Tác dụng kháng ung thư của virut vắc xin sởi và quai bị dùng phối hợp trên chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối ung thư đại trực tràng người

Nội dung text: Tác dụng kháng ung thư của virut vắc xin sởi và quai bị dùng phối hợp trên chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối ung thư đại trực tràng người

1. TẠP CHÍ Y DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2018 TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƢ CỦA VIRUT VẮC XIN SỞI VÀ QUAI BỊ DÙNG PHỐI HỢP TRÊN CHUỘT THIẾU HỤT MIỄN DỊCH MANG KHỐI UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG NGƢỜI Lê Duy Cương*; Hồ Anh Sơn*; Ngô Thu Hằng*; Nguyễn Lĩnh Toàn* TÓM TẮT Mục tiêu: đánh giá hiệu quả kháng ung thư của virut vắc xin sởi và quai bị dùng phối hợp trên chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối ung thư đại trực tràng (UTĐTT) người. Đối tượng và phương pháp: virut vắc xin sởi và quai bị (MeV và MuV) được tách dòng từ vắc xin Priorix (Hãng GlaxoSmithKline, Anh). Chuột nude (Hãng Charles River, Mỹ) 6 - 8 tuần tuổi, chia thành 4 nhóm (10 con/nhóm) được ghép u tế bào HT29 (106-7 tế bào/con) dưới da đùi, khi khối u có kích thước khoảng 20 - 40 mm3 (sau 7 - 10 ngày ghép), tiến hành tiêm virut vào khối u với liều 107 CFU/con, 2 lần/tuần, trong 3 tuần, nhóm chứng tiêm PBS. Kết quả và kết luận: khối u ở nhóm tiêm virut phát triển chậm và thời gian sống dài hơn có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) so với nhóm chứng; nhóm tiêm phối hợp virut có kích thước u phát triển chậm và thời gian sống dài hơn có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) so với nhóm tiêm đơn virut. Như vậy, phối hợp vắc xin MeV và MuV kháng u tế bào HT29 trên chuột nude tốt hơn so với từng loại virut. * Từ khóa: Ung thư đại trực tràng; Vắc xin virut sởi và quai bị; Tác dụng kháng ung thư. Assessing Anti-Cancer Efficacy of Measles and Mumps Virus Vaccine Combination on Nude Mice Bearing Human Colorectal Cancer Tumors Summary Objectives: Evaluation of the anti-cancer effects of measles and mumps virus vaccine combination on nude mice bearing human colorectal cancer tumor. Materials and methods: Measles and mumps virus vaccine (MeV and MuV) were separated from Priorix vaccine (GlaxoSmithKline, UK). Nude mice (Charles River, USA), 6 - 8 weeks old, were divided into 4 groups (10 mice/group). Nude mice were injected subcutaneously at thighs with 106-7 HT29 cells, when the tumor was about 20 - 40 mm3 (posttreatment 7 - 10 days) carry out to inject MeV and MuV into the tumor with a dose of 107 CFU/mice, twice weekly for 3 weeks, the control group was injected by PBS. Results and conclusions: The tumor size grew slowly and survival time of the virus-treated groups was significantly long (p < 0.05) versus that of the control group. The tumor size grew slowly and survival time of the virus-treated combination group was significantly long (p < 0.05) versus that of viral-treated single groups. Thus, MeV and MuV combination virotherapy treated colorectal tumor on nude mice was better than virus-treated single therapy. *Keywords: Colorectal cancer; Measles and mumps virus vaccine; Anti-cancer effect. * Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Lĩnh Toàn (toannl@vmmu.edu.vn) Ngày nhận bài: 03/01/2018; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 08/02/2018 Ngày bài báo được đăng: 02/03/2018 38
2. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2018 ĐẶT VẤN ĐỀ hợp bào, đó là sự hợp nhất tế bào bị nhiễm virut với tế bào lân cận không Ung thư đại trực tràng là một gánh nhiễm virut, đây là cơ chế tạo cho chúng nặng rất lớn cho sức khỏe cộng đồng. lây lan mà không cần giải phóng các hạt Trên thế giới, đây là loại ung thư phổ biến virut trưởng thành ra ngoài tế bào. Sự thứ ba ở nam giới và thứ hai ở nữ. Ở các hợp nhất các tế bào hình thành hợp bào nước phương Tây, hàng năm khoảng (50 - 100 tế bào) tương quan với tiềm 917.000 trường hợp mắc UTĐTT, là nguyên năng ly giải tế bào u của chúng. Sự hình nhân đứng hàng thứ hai gây tử vong do thành hợp bào góp phần vào hiệu quả ung thư [1]. Hiện nay, có nhiều phương virut gây ly giải tế bào u, làm cho virut pháp điều trị UTĐTT, bao gồm cả các nhân lên và hạn chế tiếp xúc với kháng phương pháp điều trị đích và sản phẩm thể trung hòa trong máu vật chủ. Hợp bào thuốc có hoạt tính sinh học như kháng tiết ra một lượng lớn “syncytiosome”, thể đặc hiệu kháng nguyên Virotherapy đó là các túi giống như exosome biểu Oncolytic (OV) là một phương thức điều hiện kháng nguyên khối u (TAA) cao qua trị ung thư mới, là phương pháp biến sự các phân tử MHC. Ngoài ra, các tế bào nhân lên của virut thành vũ khí tiêu diệt tế DC trình diện chéo TAA được tăng cường bào ung thư mà không ảnh hưởng đến mạnh bởi glycoprotein hợp màng của MeV các tế bào lành. Có ít nhất 11 loại virut, và MuV. Một lợi thế nữa của MuV và MeV bao gồm: adenovirus, vaccinia virut, là protein HN và N hoạt động như một coxsackievirut, reovirus, virut sởi (MeV), sialidase, có khả năng loại bỏ dư lượng virut quai bị (MuV) đang được nghiên cứu axít sialic từ bề mặt tế bào khối u làm và thử nghiệm lâm sàng điều trị nhiều loại giảm tăng trưởng tế bào ác tính, kích hoạt ung thư khác nhau. Hiện nay, virut Herpes các tế bào NK và bài tiết của IFN-γ [4]. simplex biến đổi gen là IMLYGIC™ Tuy nhiên, đến nay chưa có nghiên cứu (T-VEC/Talimogene Laherparepvec) đã in vivo đánh giá hiệu quả phối hợp vắc xin được phê chuẩn điều trị bệnh nhân (BN) MeV và MuV điều trị UTĐTT người. Do đó, bị ung thư hắc sắc tố tái phát sau điều trị chúng tôi tiến hành đề tài này nhằm: phẫu thuật ở Mỹ và các nước liên minh Đánh giá hiệu quả phối hợp virut vắc xin châu Âu [2]. sởi và quai bị kháng khối u tế bào dòng Virut vắc xin sởi và quai bị (MeV và UTĐTT người (HT29) trên chuột nude. MuV) thuộc gia đình Paramyxoviridae có tiềm năng ly giải tế bào u cao. Chúng có ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP nhiều đặc điểm tự nhiên rất thích hợp để NGHIÊN CỨU phát triển thành tác nhân điều trị ung thư 1. Đối tƣợng nghiên cứu. như: tính ổn định gen cao, độ an toàn cao - Tế bào Vero và HT29: được nuôi cấy đối với con người [2], kết hợp với tiềm trong phòng thí nghiệm với môi trường năng biến đổi gen tạo ra MeV và MuV tái nuôi cấy DMEM hay RPMI (thêm 10% tổ hợp có các thuộc tính trị liệu ung thư foetal bovine serum, 1% glutamine và 1% rất tốt. Lợi thế ly giải tế bào u rất lớn kháng sinh), duy trì tế bào ở tủ ấm 370C, của MeV và MuV là khả năng hình thành 5% CO2. 39
3. TẠP CHÍ Y DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2018 - Vắc xin MeV và MuV sống, giảm độc 104 tế bào/200 l/giếng, duy trì tế bào trên 0 lực: phân lập, tăng sinh MeV và MuV đĩa 96 giếng ở tủ ấm 37 C, 5% CO2. nguồn gốc từ vắc xin priorix (Hãng Sau 24 giờ, kiểm tra dưới kính hiển vi GlaxoSmithKline, Anh), thực hiện tại thấy tế bào Vero bám đáy tốt. Tiến hành Trường Đại học Quốc gia Singapore. nhiễm virut vào các giếng theo hàng A, B, - Chuột thiếu hụt miễn dịch (nude mice): C, D, E, F, I, tương ứng với nồng độ 10-2 chuột nude 6 - 8 tuần tuổi (Hãng Charles đến 10-8 của stock virut, cột 11 và 12 là River, Mỹ) được nuôi trong phòng sạch. nhóm chứng (không nhiễm). Kiểm tra tế bào Vero nhiễm virut ở các giếng trên đĩa 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. 96 giếng hàng ngày dưới kính hiển vi. * Chuẩn độ virut (TCID50): Đến ngày thứ 6 nhiễm virut, các giếng có - Nhiễm virut tế bào Vero trên đĩa hình ảnh nhiễm virut rõ, tiến hành 96 giếng: gieo tế bào Vero vào các giếng nhuộm xanh methylen và tính TCID50 theo trên đĩa 96 giếng với nồng độ tế bào công thức: I: Tính khoảng tỷ lệ (PD): (% CPE ở nồng độ pha loãng có % CPE > 50%) - (50%) (% CPE ở nồng độ pha loãng có % CPE > 50%) - (% CPE ở nồng độ pha loãng có % CPE < 50%) II: Tính (-Log) nồng độ pha loãng có % CPE > 50% (10-3 sẽ là 3) I+II TCID50/ml = 10 /ml (CPE: giếng có tế bào nhiễm virut) Đổi chuẩn độ TCID50 sang CFU: CFU/ml = 0,7 x TCID50/ml. * Tạo khối u trên chuột nude và điều trị: Tiêm tế bào HT29 (107 tế bào/chuột) vào dưới da đùi chuột nude. Sau 7 - 10 ngày tiêm tế bào u, kích thước khối u đạt khoảng 20 - 30 mm3, chuột có khối u được chia ngẫu nhiên thành 4 nhóm (10 con/1 nhóm), 3 nhóm được điều trị bằng tiêm virut nội u lần lượt là MeV + MuV, MuV và MeV, nhóm chứng tiêm bằng dung dịch PBS. Liều điều trị là 107 CFU/con, 2 lần/tuần, trong 3 tuần. Dùng thước kẹp đo khối u (2 lần/tuần). Thực hiện các bước thí nghiệm trên chuột tuân theo hướng dẫn sử dụng và chăm sóc động vật thí nghiệm. Công thức tính thể tích khối u: 2 Chiều rộng (mm) x chiều dài (mm) 3 Thể tích khối u (mm ) = 2 Tiêm tế bào HT29 vào Đo kích thước khối u ở đùi chuột đùi chuột gây u Hình 1: Ghép u dưới da đùi chuột và đo kích thước u. 40
4. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2018 * Phương pháp phân tích kết quả: Dùng các thuật toán thống kê, sử dụng phần mềm STATVIEW và SPSS. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1. Kích thƣớc u. C o n tro l Thể tích khối u M uV Kích thước u3 (mm ) M eV 1 0 0 0 0 M u V + M eV P<0.05 8 0 0 0 6 0 0 0 4 0 0 0 2 0 0 0 0 ngà y 1 ngà y 4 ngà y 8 ngà y 11 ngà y 15 ngà y 18 ngà y 22 ngà y 25 ngà y 29 Thời gian sau điều trị Hình 2: 3 Kết quả thể tích khối u (mm ) sau thời gian điều trị. Kết quả cho thấy tiêm virut đã ngăn chặn khối u phát triển, quan sát thấy rõ từ ngày thứ ba đến ngày thứ 29 sau điều trị. Thể tích khối u (mm3) ở các nhóm điều trị virut tăng chậm có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) so với nhóm chứng (ở ngày thứ 29: 1.988,7 ± 885,8; 4.790,4 ± 1.924,8; 4.655,4 ± 1.042,1 so với 9.326,7 ± 2.713,4). Thể tích khối u ở nhóm điều trị phối hợp virut tăng chậm hơn nhóm điều trị đơn virut có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Thể tích khối u của hai nhóm điều trị bằng MeV và MuV khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). 2. Thời gian sống của chuột nude. TThờihời gian ssốngống trung trung bình bình (ngày) 6 0 MuV+MeV MuV MeV Control 4 0 2 0 p<0.05 0 l V V V o u u e tr Nhóm M M M n + o V c e M A B Hình 3: Thời gian sống và tỷ lệ chết của chuột sau điều trị. 41
5. TẠP CHÍ Y DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2018 Sau thời gian điều trị, thời gian sống thụ cảm thể biểu hiện thấp và đòi hỏi mức trung bình của chuột nude ở các nhóm tới hạn thụ cảm thể CD46 để tạo hợp bào tiêm virut (MeV và MuV) dài hơn có ý nghĩa lớn hơn, gây tổn thương phá hủy tế bào thống kê so với nhóm chứng (p < 0,05) đáng kể [5]. Chúng ta đã biết thụ cảm thể (hình 3a). Tỷ lệ chuột còn sống (sau 43 ngày CD46, Nectin-4 của virut sởi và thụ cảm theo dõi) ở các nhóm tiêm virut (100%; thể MuV-JL của virut quai bị. Ngoài ra, 60%; 60%) nhiều hơn có ý nghĩa thống kê axít sialic có nhiều ở tế bào ác tính làm (p < 0,05) so với nhóm chứng (0%) (hình 3b). cho chúng lây nhiễm tế bào ung thư có Đặc biệt, ở nhóm tiêm phối hợp virut tính chọn lọc cao hơn. Tế bào ung thư có thời gian sống trung bình dài hơn và tỷ biểu hiện mức cao CD46, Nectin-4 hay lệ chuột còn sống nhiều hơn (sau 43 ngày axít sialic nhằm bảo vệ chúng khỏi hoạt theo dõi) có nghĩa thống kê (p < 0,05) so với động ly giải tế bào qua con đường bổ thể nhóm tiêm đơn virut. [5]. Mức độ phong phú của thụ cảm thể xác định tính đặc hiệu và hiệu quả lây Thời gian sống và tỷ lệ chuột chết ở nhiễm của virut vào tế bào u. Tính đặc 2 nhóm tiêm MeV, MuV khác biệt không hiệu khối u đối với virut có thể xảy ra ở có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). mức nội bào sau khi virut xâm nhập vào tế bào, virut có thể tận dụng được các BÀN LUẬN yếu tố khiếm khuyết gen (interferon, kích Với những tiến bộ của công nghệ sinh hoạt Ras, p53, Rb) chỉ có duy nhất ở tế học và hiểu biết về virut ly giải tế bào ung bào khối u, làm cho chúng có tính chọn thư đã thúc đẩy các nhà nghiên cứu lọc tế bào khối u và không xảy ra ở các tế khám phá nhiều loài virut kháng ung thư bào bình thường [5]. Trong khi đó, nhiều có hiệu quả. Trong nghiên cứu này, để tài liệu cho thấy virut ly giải tế bào khối u đánh giá hiệu quả phối hợp vắc xin virut tận dụng được những khiếm khuyết gen MeV và MuV ly giải tế bào UTĐTT người trong tế bào khối u để khuếch đại bộ gen HT29 in vivo, chúng tôi đã ghép u tế bào của chúng và tăng biểu hiện bộ gen đó. HT29 khu trú dưới da đùi chuột nude, phù Tuy nhiên, vẫn chưa rõ phạm vi mà MeV hợp cho liệu pháp điều trị tiêm virut nội u, và MuV tận dụng con đường khiếm khuyết gia tăng khả năng virut tiếp xúc và xâm gen để ly giải tế bào u như thế nào, nhập vào khối u. cần có nhiều nghiên cứu sâu hơn về vấn Số lượng thụ cảm thể được chứng đề này. minh là yếu tố quan trọng quyết định đến Nghiên cứu của chúng tôi cũng cho tính lây nhiễm hay hiệu quả lan truyền của thấy virut MeV và MuV có tác dụng làm virut vào các tế bào u đích [5]. Sử dụng chậm phát triển khối u tế bào HT29 trên nhiều loại tế bào biểu hiện từ thấp đến đùi chuột nude bắt đầu vào ngày thứ ba cao mức thụ thể CD46, đã xác định khả sau khi tiêm virut (hình 2). Khả năng virut năng lây nhiễm virut sởi tăng lên theo lây lan tạo ra hoạt động kháng u là do virut số lượng thụ cảm thể. Hợp bào ít ở mức nhân lên trong tế bào đích và “bắt kịp” với 42
6. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2018 quá trình tăng sinh tế bào u, hầu hết các ngại về độ an toàn khi sử dụng. Chủng khối u được điều trị bằng MeV và MuV Urabe của MuV gây ra các biến chứng cho thấy giảm và không phát triển kích trên hệ thần kinh trung ương với tần suất thước. Kết quả của chúng tôi phù hợp với lên đến 1% tiêm chủng vắc xin, tiêm trong những nghiên cứu khác sử dụng vắc xin não khỉ đuôi sóc gây viêm não và viêm virut sởi và quai bị sống giảm độc lực màng não [10]. Nghiên cứu của chúng tôi điều trị ung thư [6, 7]. Bên cạch đó, việc sử dụng 107 PFU virut vắc xin quai bị phân chia liều lượng, với liều 107 PFU hoặc sởi để điều trị khối u ở chuột nude, virut và liệu trình điều trị như vậy là cần liều này cao gấp 103 lần so với liều thông thiết để tăng khả năng ly giải tế bào khối thường (103-4 PFU) được sử dụng để u của virut [6, 7]. Chúng tôi cũng thấy tiêm chủng. Chúng ta đã có rất nhiều kinh tiêm nội u tạo ra lây nhiễm sớm virut vào nghiệm sử dụng vắc xin đơn hoặc phối các tế bào khối u và lây lan virut có giới hợp trong chương trình chủng ngừa bệnh hạn trong khối u đã làm tăng khả năng ly sởi, Rubella với hồ sơ an toàn của hai giải tế bào khối u. Tiêm virut nội u nhiều loại vắc xin này trên hàng triệu trẻ em. lần hiệu quả hơn so với tiêm tổng liều duy Tuy nhiên, cần có đánh giá tác dụng phụ nhất [6, 7]. Kết quả này rất có giá trị định và độc tính của những virut này khi dùng hướng phương pháp phối hợp MeV và liều cao điều trị ung thư. MuV tiêm nội u điều trị ung thư cho các nghiên cứu trong tương lai. KẾT LUẬN Điểm nổi bật của nghiên cứu này là Kết quả của chúng tôi đã chứng minh việc phối hợp hai vắc xin MeV và MuV dùng phối hợp virut vắc xin MeV và MuV điều trị khối u tế bào HT29 trên chuột rất có hiệu quả kháng khối u tế bào đại nude rất có hiệu quả. MeV và MuV sống, giảm độc lực đã cộng hưởng cơ chế hoạt tràng HT29 trên chuột nude. Khối u phát động kháng ung thư. Nhiều nghiên cứu triển chậm, thời gian sống của chuột mang trước đây đã chứng minh hoạt tính của virut khối u ở nhóm tiêm phối hợp virut dài hơn quai bị (chủng Urabe) trên hơn 290 BN bị đáng kể so với nhóm tiêm đơn virut. các khối u ác tính khác nhau. BN được 8-9 điều trị với nồng độ lên đến 10 PFU virut TÀI LIỆU THAM KHẢO theo các đường tiêm khác nhau (nội u, 1. Mathers C, Boschi-Pinto C. Global trong phúc mạc hoặc tiêm tĩnh mạch) [8]. burden of cancer in the year 2000: Version 1 Một nghiên cứu khác về MuV với kết quả estimates. Geneva: World Health Organization. lâm sàng rất ít độc tính, khối u đáp ứng 2006. điều trị từng phần hoặc thoái lui toàn bộ ở 37/90 BN [9] và cổ trướng mất đi ở 2. FDA. FDA approves first-of-its-kind 26/37 BN. Mặc dù dữ liệu lâm sàng rất product for the treatment of melanoma. 2015. đáng khích lệ, nhưng các nhà nghiên cứu 3. Fielding A.K. Measles as a potential vẫn chưa thực hiện thử nghiệm lâm sàng oncolytic virus. Rev Med Virol. 2005,15 (2), MuV ly giải tế bào u rộng rãi. Có thể do lo pp.135-142. 43
7. TẠP CHÍ Y DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2018 4. Cohen M, Elkabets M, Perlmutter M, 7. Arun Ammayappan, Stephen J Russell, Porgador A, Voronov E, Apte R.N et al. Mark J Federspiel. Recombinant mumps virut Sialylation of 3methylcholanthrene-induced as a cancer therapeutic agent. Molecular fibrosarcoma determines antitumor immune Therapy - Oncolytics. 2016, 3, p.16019. responses during immunoediting. J Immunol. 8. Shimizu Y, Hasumi K, Okudaira Y et al. 2010, 185, pp.5869-5878. [PubMed: 20956342] Immunotherapy of advanced gynecologic 5. Olga V Matveeva, Zong S Guo, cancer patients utilizing mumps virut. Cancer Svetlana A Shabalina, Peter M Chumakov. Detect Prev. 1988, 12, pp.487-495. Oncolysis by paramyxovirutes: Multiple 9. Asada T. Treatment of human cancer mechanisms contribute to therapeutic efficiency. with mumps virut. Cancer. 1974, 34, pp.1907- Mol Ther Oncolytics. 2015. 1928. 6. Rae Myers et al. Oncolytic activities of 10. Saika S, Kidokoro M, Aoki A et al. approved mumps and measles vaccines for Neurovirulence of mumps virut: Intraspinal therapy of ovarian cancer. Cancer Gene inoculation test in marmosets. Biologicals. Therapy. 2005, 12, pp.593-599. 2004, 32, pp.147-152. 44