Sử dụng chỉ thị ADN (RAPD - PCR) trong nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen Đảng sâm góp phần định hướng công tác bảo tồn và phát triển ở Việt Nam

Nội dung text: Sử dụng chỉ thị ADN (RAPD - PCR) trong nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen Đảng sâm góp phần định hướng công tác bảo tồn và phát triển ở Việt Nam

1. Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 1 (2017) 32-39 Sử dụng chỉ thị ADN (RAPD-PCR) trong nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen Đảng sâm góp phần định hướng công tác bảo tồn và phát triển ở Việt Nam Phạm Thanh Huyền1,*, Đinh Đoàn Long2 1Viện Dược liệu, Bộ Y tế, 3B Quang Trung, Hoàn Kiếm, Hà Nội 2Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, 144 Xuân Thủy, Cầu Giấy, Hà Nội Nhận ngày 10 tháng 2 năm 2017 Chỉnh sửa ngày 20 tháng 4 năm 2017; Chấp nhận đăng ngày 14 tháng 6 năm 2017 Tóm tắt: Nhằm muc đích bảo tồn và chọn, tạo giống loài cây thuốc Đảng sâm trong tương lai ở Việt Nam, chúng tôi tiến hành nghiên cứu nhằm đánh giá mức độ đa dạng di truyền của một số quần thể Đảng sâm phân bố tự nhiên và trồng trọt ở một số tỉnh miền núi Tây Bắc (Lào Cai, Hà Giang, Sơn La) và Tây Nguyên (Lâm Đồng, Kon Tum). Tổng cộng 15 mẫu quần thể Đảng sâm, trong đó có 3 mẫu từ Lào Cai, 1 mẫu từ Hà Giang, 1 mẫu từ Sơn La, 4 mẫu từ Lâm Đồng và 6 mẫu từ Kon Tum đã được thu thập để tách chiết ADN và phân tích đa dạng di truyền bằng chỉ thị RAPD-PCR sử dụng 12 mồi có trình tự 10 nucleotit ngẫu nhiên. Kết quả phân tích bằng phần mềm NTSYSpc 2.1 cho thấy trong tổng cộng 106 băng RAPD-PCR thu được có 88 băng đa hình (83%) và 18 băng đồng hình (17%). 15 mẫu quần thể chia làm 2 nhóm lớn, tách biệt rõ rệt giữa nhóm mẫu thu ở Tây Bắc và nhóm mẫu thu ở Tây Nguyên. Các mẫu thu thập ở vị trí địa lý gần nhau có khác biệt di truyền nhỏ hơn cho thấy nhiều khả năng chúng có nguồn gốc chung. Sự khác biệt di truyền cao giữa các quần thể cách xa về địa lý cho thấy những nguồn gen này cần được bảo tồn độc lập phục vụ cho công tác chọn lọc và tạo giống trong tương lai. Từ khóa: Condonopsis javanica, RAPD-PCR, đa dạng di truyền, khoảng cách địa lý. 1. Đặt vấn đề * bảo tồn, chọn, tạo và nhân giống phù hợp, đáp ứng yêu cầu của quá trình phát triển một nền Đối với các loài cây thuốc, một trong những công nghiệp chế biến dược liệu bền vững, yêu cầu hàng đầu hiện nay của nền công nghiệp 2004). Hiện nay việc sử dụng các chỉ thị ADN dược phẩm dựa trên dược liệu tự nhiên là yêu (RAPD-PCR, RFLP-PCR, AFLP, SSR, ...) cầu tiêu chuẩn hóa nguồn nguyên liệu ban đầu. ngày càng được sử dụng rộng rãi trong các Việc lựa chọn được nguồn gen có chất phục vụ nghiên cứu phân loại, phân tích đa dạng sinh công tác chọn tạo giống các loài cây thuốc có học, xác định khoảng cách di truyền và đặc vai trò hết sức quan trọng. Trong quá trình đó, trưng ở các cá thể và quần thể thực vật nhằm việc phân tích các chỉ thị ADN cho phép đánh mục đích bảo tồn và chọn giống. giá một cách chính xác mức độ đa dạng di Đảng sâm (Condonopsis javanica (Blume) truyền của một loài cây thuốc nhằm định hướng Hook f.) là một cây thuốc quý được lưu truyền _______ từ lâu đời với các tác dụng bổ tỳ, ích khí, sinh * Tác giả liên hệ. ĐT.: 84-4-39363377. tân chỉ khát. Đảng Sâm đươc sử dụng để bồ bổ Email: huyenptnimm@gmail.com sức khỏe, cơ thể bị suy nhược, hoặc dùng như 32
2. P.T. Huyền, Đ.Đ. Long / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 1 (2017) 32-39 33 một loại thuốc bổ. Ở Việt Nam, Đảng sâm được 2.1. Vật liệu tìm thấy phân bố khá rộng từ miền múi phía bắc tới các tỉnh Nam trung bộ như Kon Tum, Lâm Tổng cộng 15 mẫu thực vật được thu thập ở Đồng. Tuy nhiên, do khai thác quá mức và nạn một số khu vực thuộc các tỉnh Lào Cai, Sơn La, chặt phá rừng nên trữ lượng của loài cây thuốc Hà Giang, Lâm Đồng, Kon Tum đã được sử bị suy giảm. Từ nhiều năm nay, Đảng sâm đã dụng trong nghiên cứu. Dựa vào vị trí phân bố được đưa vào Sách Đỏ Việt Nam, danh lục Đỏ của chúng mà mà chúng tôi chia các mẫu Đảng cây thuốc Việt Nam và là đối tượng được ưu sâm thành năm nhóm (N1 – N5). Mỗi mẫu tiên bảo tồn [1-3]. được kí hiệu bắt đầu bằng chữ Cj (viết tắt của Hiện nay nhu cầu sử dụng Đảng sâm ở Việt Condonopsis javanica) theo sau là số thứ tự từ Nam là rất lớn. Vấn đề đặt ra là làm thế nào để 1 đến 15 (xem Bảng 1). khai thác và phát triển bền vững loài cây thuốc Các mẫu thực vật sau khi đưa về phòng thí này đáp ứng nhu cầu thị trường trong nước. Để nghiệm được làm sạch bằng nước cất và cồn, có cơ sở cho công tác bảo tồn và chọn lọc phân tách lấy phần lá, thân. Các phần mô dập nguồn nguyên liệu làm giống để phát triển nát hoặc có biểu hiện nhiễm bệnh bị cắt bỏ, sau nguồn nguyên liệu làm thuốc thì việc đánh giá đó mẫu được nghiền trong nitơ lỏng bằng chày mức độ đa dạng nguồn gen Đảng sâm là thực sự và cối đã khử trùng từ trước thành dạng bột mịn cần thiết. có kích thước hạt nhỏ hơn 1mm. Mẫu nghiền được chia ra bảo quản trong các ống Falcon 15 mL, rồi bảo quản ở -800C để làm nguyên liệu 2. Vât liệu và phương pháp nghiên cứu tách chiết ADN tổng số. Bảng 1. Danh sách các mẫu đảng sâm Việt Nam (Codonopsis javanica (Blume) Hook f.) được sử dụng trong nghiên cứu Nhóm mẫu Địa điểm SHTB tại Kí hiệu mẫu Số lượng Tọa độ GPS (theo Tỉnh) (huyện/T. xã) BT ADN Sa Pả, Sapa 1 22.3311°, 103.8500° 9722 Cj1 N1 Tả Phìn, Sapa 1 22.4020°, 103.8262° 9711 Cj2 (Lào Cai) Bản Khoang, Sapa 1 22.4265°, 103.8051° 9714 Cj3 N2 Phó Bảng, Đồng 1 22.2322°, 105.1870° 9715 Cj4 (Hà Giang) Văn N3 Xã Loong Hẹ, 1 21.1560°, 103.3227° 9719 Cj5 (Sơn La) Thuận Châu Cj6 Đa Sal, Lạc Dương 12.1735°, 108.6693° 9712 2 N4 12.1735°, 108.6693° 9716 Cj7 (Lâm Đồng) Đa Sal, Lạc Dương 12.1742°, 108.6675° - Cj8 2 12.1742°, 108.6675° - Cj9 14.2511°, 107.9878° 9708 Cj10 Thôn 1, Xã Hòa 2 Bình, Tp Kon Tum 14.2511°, 107.9879° 9709 Cj11 N5 14.1710°, 107.5842° 9748 Cj12 (Kon Tum) Huyện Hòa Bình 2 14.1710°, 107.5843° 9750 Cj13 Đăk Hà, Tu Mơ 1 14.4811°, 107.5760° 9706 Cj14 Rông Huyện Kon Plong 1 14.3725°, 108.1850° 9707 Cj15
3. 34 P.T. Huyền, Đ.Đ. Long / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 1 (2017) 32-39 Các mồi RAPD thuộc 2 nhóm OPA và OPC được cung cấp từ hãng Fermentas (Lithuania). Bảng 2. Danh sách các mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu Mồi Trình tự mồi Mồi Trình tự mồi OPA1 5’- CAGGCCCTTC -3’ OPA19 5’- CAACGTCGGT -3’ OPA7 5’-GAAACGGGTC -3’ OPA20 5’- GTTGCGATCC -3’ OPA12 5’- TCGGCGATAG -3’ OPC1 5’-TTCGAGCCAG -3’ OPA13 5’- CAGCACCCAC -3’ OPC3 5’- GGGGGTCTTT -3’ OPA15 5’- TTCCGAACCC -3’ OPC12 5’- TGTCATCCCC -3’ OPA17 5’- GACCGCTTGT -3’ OPC20 5’- TTCCCCCCAG -3’ H Các thang chuẩn kích thước ADN: marker nhiệt độ phòng trong 10 phút; rồi dùng 1kb của hãng Fermentas (Mỹ) pipetman loại bỏ dịch nổi và rửa tủa ADN hai Các hóa chất khác được dùng trong tách lần bằng ethanol lạnh (100%), kết hợp ly chiết ADN và phản ứng RAPD-PCR đảm bảo tâm.Để tủa khô tự nhiên (hoặc dùng máy cô chất lượng và độ tinh sạch gồm đệm CTAB, ADN), rồi hòa tan ADN kết tủa trong 100 µL chloroform, isoamyl acohol, EDTA, ethanol, đệm 1x TE (10 mM Tris-HCl, pH7.5, 1 mM agarose, các thành phần PCR (MgCl2, đệm và EDTA); bảo quản ở 4ºC. enzyme Taq DNA polymerase, dNTPs), thuốc ADN tổng số sau khi tách chiết được kiểm nhộm ethidium bromide (EtBr), được cung cấp tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose bở những hãng uy tín như Sigma (Mỹ), Merk 0.8%. Thực hiện điện di trong môi trường đệm (Đức), Fluka (Thụy Sỹ). 1x TBE, ở hiệu điện thế 90 V trong khoảng 45 phút. Kích thước tương đối của sản phẩm ADN 2.2. Phương pháp nghiên cứu tổng số được xác định bằng cách so sánh với * Tách chiết ADN tổng số thang ADN 1kb (Fermentas). + Quy trình tách chiết ADN tổng số được Độ tinh sạch của ADN đồng thời được kiểm thực hiện dựa trên nguyên tắc sử dụng dung tra và định lượng bằng phương pháp đo quang môi hữu cơ theo phương pháp Mini-CTAB phổ hấp thụ (OD) ở bước sóng 260 nm và 280 được Sanghai-Maroof và cộng sự mô tả đầu nm. Dịch chiết được pha loãng 100 lần (10 µl tiên năm 1984 [4], sau đó được Edwards và ADN tổng số + 990 µl dd H2O), tiến hành đo 3 cộng sự cải tiến (năm 1991) [5] gồm các bước lần ở mỗi mẫu, kết quả lấy trung bình của 3 lần cơ bản sau: Cân 50 mg mẫu thực vật đã nghiền đo. Mức độ tinh sạch của ADN (mức độ lẫn trong nitơ lỏng và chuyển vào ống eppendorf ARN và protein) phản ánh qua tỷ số OD260/280. 1,5 ml. Bổ sung 900 µL dung dịch đệm nghiền Các mẫu được coi là tinh sạch khi có tỷ số (200 mM Tris HCl, pH 7,5; 25mM EDTA, pH nàyxấp xỉ 1,8. Nồng độ dung dịch gốc được 7,5; 250 mM NaCl; 2% CTAB và 2% tính dựa trên hệ số 1,0 OD260 = 50 µg/µl -mecaptoethanol). Ủ mẫu ở 65oC trong 90 dsADN. phút. Làm nguội về nhiệt độ phòng, bổ sung * Kỹ thuật RAPD-PCR được tiến hành qua 450 µL phenol/chlorofom/ isoamylalcohol (tỷ lệ hai bước: thể tích: 25/24/1), ủ trong 10 phút. Ly tâm - Bước 1: ADN hệ gen được nhân bản 10.000 vòng/ phút ở 4ºC trong 10 phút; rồi (khuếch đại) bằng các mồi ngẫu nhiên RAPD dùng pipet hút phần dịch nổi sang ống với thành phần phản ứng và điều kiện (chu trình eppendorf 1,5ml. Bổ sung 600 µL isopropanol. nhiệt của phản ứng) PCR được mô tả ở Bảng 3 Ủ ở 4ºC qua đêm.Ly tâm 10.000 vòng /phút ở và 4.
4. P.T. Huyền, Đ.Đ. Long / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 1 (2017) 32-39 35 L Bảng 3. Thành phần phản ứng PCR sử dụng Bảng 4. Chu trình nhiệt của PCR sử dụng cho Đảng cho Đảng sâm Việt Nam sâm Việt Nam Nhiệt Thời gian Số chu Thành phần phản ứng Thể tích (µL) Bước phản ứng độ (˚C) (phút) kỳ H2O (siêu sạch) 16,8 Biến tính bước đầu 94 5 1 ADN khuôn (50 ng/µL) 0,5 Biến tính 94 1 Đệm Taq ADN pol (10x) 2,5 Gắn mồi 37 1 35 dNTPs (2mM) 2,5 Kéo dài chuỗi 72 2 Mồi RAPD (10 µM) 2,5 Kéo dài bổ sung 72 7 1 Taq ADN pol (5u/ µL) 0,2 Bảo quản 4 ∞ Tổng thể tích PCR: 25 µL ; - Bước 2: Sản phẩm ADN sau PCR được 3.1. Sự đa dạng di truyền của các mẫu quần thể phân tích trên gel điện di agarose 1,0 - 1,5% Đảng sâm Việt Nam chạy ở hiệu điện thế 60 - 80 V trong 45 phút bằng phương pháp nhuộm với EtBr. Kích thước Bằng phần mềm NTSYSpc 2.1, chúng tôi tương đối của các băng khuếch đại được so xác định được hệ số tương đồng di truyền (bảng sánh với thang chuẩn kích thước ADN 1kb 5) giữa 15 mẫu Đảng sâm. Kết quả cho thấy, (Fermentas, 1kb DNA Ladder). các mẫu Đảng sâm thu ở khu vực Tây Bắc (Hà * Phân tich di truyền bằng RAPD - PCR Giang, Lào Cai, Sơn La) và các mẫu thu ở Tây Nguyên (Lâm Đồng, Kon Tum) tách biệt thành Kết quả điện di sản phẩm RAPD-PCR được 2 nhóm (nhánh) rõ rệt. Sự khác biệt di truyền chuyển thành ma trận nhị phân trong phần mềm lớn nhất được tìm thấy giữa mẫu Cj5 (thu ở NTSYSpc 2.02h (Applied Biotstatistics, New Thuận Châu, Sơn La) với các mẫu Cj6 và Cj7 York) theo nguyên tắc: sự có mặt của mỗi băng (mọc tự nhiên ở Lạc Dương, Lâm Đồng) với hệ được ghi là 1, sự vắng mặt được ghi là 0. Từ ma số khác biệt di truyền là 0,38. Hai mẫu được trận nhị phân, hệ số tương quan DICE (SD), ma xác định có mức độ tương đồng di truyền lớn trận tương đồng theo từng cặp được thiết lập. nhất là Cj8 và Cj9 với hệ số tương đồng di Hệ số SD được tính bằng hai lần số băng chung truyền là 0,95. Đây cũng chính là hai mẫu được của hai mẫu chia cho tổng số băng thu được của thu từ vườn trồng của người dân tại Lạc Dương, hai mẫu đó (S = 2NAB / (NA + NB)). Hệ số thu Lâm Đồng; có lẽ chúng có nguồn gốc gần gũi được là 1,0 có nghĩa là hai mẫu hoàn toàn giống và là kết quả của người dân nhân giống tự phát. nhau, trong khi 0,0 có nghĩa là hai mẫu không Khi so sánh giữa các cặp mẫu phân bố trong có điểm chung nào. Cuối cùng, cây quan hệ di cùng địa giới hành chính (cùng Tỉnh), thì xu truyền giữa các mẫu được xây dựng theo hướng đồng hình (tương đồng di truyền) cao phương pháp UPGMA (Unweighted Pair- hơn rõ rệt khi so với các cặp mẫu ngoài nhóm. Group Method with Arithmetical Averages). Sự đồng hình cao hơn trong phạm vi mỗi quần thể phản ánh nhiều khả năng chúng có nguồn gốc chung và xuất phát từ những quần thể tự 3. Kết quả nghiên cứu nhiên có kích thước tương đối nhỏ. Điều này cần lưu ý cho công tác bảo tồn, bởi nếu những Sử dụng 12 mồi ngẫu nhiên (RAPD) để quần thể như vậy được khai thác liên tục dễ dẫn phân tích đa hình di truyền của 15 mẫu đảng đến sự mất đi hoàn toàn của một số vốn gen. sâm Việt Nam đã thu được tổng cộng 106 băng, Khi so sánh giữa 5 mẫu thu ở khu vực phía trung bình là 8,8 băng/mồi. Trong đó, số băng Bắc (Cj1 - Cj5), có vẻ như có sự tương quan đa hình là 88, (chiếm 83 % tổng số băng). Số giữa mức độ khác biệt di truyền với khoảng băng đồng hình là 18 (chiếm 17%). cách địa lý. Trong đó, hai mẫu thu ở thị trấn Sa
5. 36 P.T. Huyền, Đ.Đ. Long / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 1 (2017) 32-39 Pa và ở Bản Khoang (Cj1 và Cj3) có mức độ giữa các cặp mẫu dao động từ 22% (mẫu Cj3 tương đồng di truyền là 90% (SD = 0,9). Sự thu ở Bản Khoang, Lào Cai và Cj8 thu ở Lạc khác biệt di truyền giữa 2 mẫu này có xu hướng Dương, Lâm Đồng) tới 38% (mẫu Cj5 thu ở tăng lên khi đối sách với mẫu Cj2 (thu ở Tả Thuận Châu, Sơn La với Cj6/Cj7 thu ở Lạc Phìn, Lào Cai; SD = 0,81 - 0,82) và Cj4 (thu ở Dương, Lâm Đồng). Phó Bảng, Hà Giang; SD = 0,83) và Cj5 (thu ở Thuận Châu, Sơn La; SD = 0,71 - 0,74). Mức 3.2. Xây dựng cây quan hệ di truyền độ khác biệt di truyền chung dao động trong khoảng từ 10% (cặp mẫu Cj1 và Cj3) đến 29% Mỗi mẫu trong nghiên cứu đại diện cho (cặp mẫu Cj5 thu ở Thuận Châu, Sơn La với quần thể ở khu vực chúng phân bố, cây quan hệ Cj2 thu ở Tả Phìn, Lào Cai). di truyền giữa 15 mẫu quần thể này được phân Đối với 10 mẫu thu ở khu vực phía Nam, sự tích nhờ chỉ thị RAPD-PCR trong nghiên cứu khác biệt di truyền dao động trong khoảng từ này (hình 1) phản ánh chúng tách thành 2 cụm 5% (cặp mẫu Cj8 và Cj9, đều là mẫu trồng thu (nhánh) tương quan rõ rệt tương ứng với phân ở Lạc Dương, Lâm Đồng) đến 32% (cặp mẫu bố địa lý. Mặc dù xét tổng thể các mẫu thu thập Cj11 thu ở Hòa Bình, Kon Tum và Cj14 thu ở từ 2 miền, sự đa dạng di truyền của loài Đảng Tu Mơ Rông, Kon Tum). sâm ở nước ta được tìm thấy, song trong phạm Kết quả bước đầu cho thấy, mức độ khác vi mỗi vùng phân bố, hệ số đa dạng (khác biệt) biệt di truyền giữa các cặp mẫu trong cùng di truyền giữa các mẫu giảm rõ rệt. Yếu tố địa nhóm thu ở khu vực miền Bắc hoặc miền Nam lý có tương quan đến sự khác biệt di truyền. là tương đương nhau (dao động trong khoảng từ Theo đó, xu hướng phổ biến là các mẫu có vị trí 5% đến trên dưới 30%). Sự khác biệt này tăng phân bố địa lí càng hình gần, mức tương đồng lên rõ rệt khi so sánh giữa hai cặp mẫu bất kỳ di truyền có xu hướng càng cao và ngược lại. thu ở hai miền, với mức độ khác biệt di truyền Bảng 5. Hệ số tương đồng di truyền giữa 15 mẫu Đảng sâm được thu thập trong nghiên cứu Tên mẫu Cj1 Cj2 Cj3 Cj4 Cj5 Cj6 Cj7 Cj8 Cj9 Cj10 Cj11 Cj12 Cj13 Cj14 Cj15 Cj1 1,00 Cj2 0,82 1,00 Cj3 0,90 0,81 1,00 Cj4 0,83 0,82 0,80 1,00 Cj5 0,74 0,71 0,78 0,71 1,00 Cj6 0,68 0,65 0,70 0,76 0,62 1,00 Cj7 0,69 0,67 0,67 0,77 0,62 0,90 1,00 Cj8 0,73 0,68 0,78 0,73 0,65 0,76 0,75 1,00 Cj9 0,73 0,66 0,76 0,75 0,66 0,78 0,75 0,95 1,00 Cj10 0,69 0,68 0,70 0,75 0,66 0,80 0,76 0,74 0,73 1,00 Cj11 0,67 0,67 0,66 0,70 0,66 0,78 0,81 0,72 0,71 0,91 1,00 Cj12 0,68 0,66 0,72 0,70 0,66 0,84 0,82 0,78 0,77 0,74 0,75 1,00 Cj13 0,71 0,65 0,73 0,69 0,65 0,86 0,83 0,78 0,77 0,75 0,77 0,92 1,00 Cj14 0,74 0,72 Hì0,78nh 0,67 1. Cây 0,64 quan0,76 h0,72ệ di 0,78 truyền 0,78 giữa 0,69 15 0,68 mẫu 0,77 đảng 0,78 sâm 1,00Việt Nam 3.3. BưCj15ớc đầ0,69u đã xác0,64 đ0,71ịnh m0,71ột số0,66 ch ỉ 0,80thị đ0,76ặc trưng 0,79 0,78của ngu0,76ồ n 0,74gen đ0,84ảng sâm0,90 Vi 0,84ệt Nam 1,00
6. P.T. Huyền, Đ.Đ. Long / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 1 (2017) 32-39 37 Từ các kết quả thu được, bước đầu đã xác giữa các quần thể. Đây là cơ sở cho việc có thể định một số chỉ thị đặc trưng phân biệt hai sử dụng chỉ thị ADN, trong đó có RAPD-PCR nhóm đảng sâm Việt Nam thu ở Tây Bắc và trong việc định hướng bảo tồn và phát triển các Tây Nguyên (bảng 6). Các hình 2, 3 và 4 minh nguồn gen Đảng sâm nói riêng và các cây dược họa một số băng đồng hình và đa hình phân biệt liệu nói chung. Bảng 6. Một số chỉ thị RAPD-PCR đồng hình và đa hình của nguồn gen đảng sâm Việt Nam Nhóm mẫu Miền Bắc Miền Nam (Lào Cai, Sơn La, Hà Giang) (Lâm Đồng, Kon Tum) Chỉ thị đặc trưng OPA11100bp, OPA7600bp, OPA13200bp, OPA19600bp, OPA19700bp OPA191000bp, (đa hình) OPA201000bp, OPC3850bp OPC1300bp, OPC12750bp, Chỉ thị chung OPA1600bp, OPA19850bp, OPA171100bp, OPA17550bp, OPA3525bp, OPA15400bp, OPA15700bp, (đồng hình) OPA152200bp, OPC1400bp, OPC1700bp, OPC3650bp, OPC12500bp, OPC12600bp, OPC20500bp, OPC201400bp k M Cj1 Cj2 Cj3 Cj4 Cj5 Cj6 Cj7 Cj8 M Cj9 Cj10 Cj11 Cj12 Cj13 Cj14 Cj15 1100bp 600bp 300bp OPA1 Hình 1. Chỉ thị RAPD-PCR của 15 mẫu đảng sâm Việt Nam với mồi OPA1. Mũi tên và kích thước chỉ băng 600bp (chỉ thị OPA1600bp) là băng đồng hình cho tất các mẫu, các băng còn lại là các băng đa hình. Cj1 - Cj15: kí hiệu các mẫu Đảng sâm; M: marker ADN 1kb (Fermentas). M Cj1 Cj2 Cj3 Cj4 Cj5 Cj6 Cj7 Cj8 Cj9 Cj10 Cj11 Cj12 Cj13 Cj14 Cj15 1100bp 550bp OPA17 Hình 2. Chỉ thị RAPD-PCR của 15 mẫu đảng sâm Việt Nam với mồi OPA17. Mũi tên và kích thước các chỉ băng 1100bp và 550bp (các chỉ thị OPA171100bp và OPA17550bp) là băng đồng hình cho tất các mẫu, các băng còn lại là các băng đa hình. Cj1 - Cj15: kí hiệu các mẫu Đảng sâm; M: marker ADN 1kb (Fermentas)
7. 38 P.T. Huyền, Đ.Đ. Long / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 1 (2017) 32-39 OPC3 OPA15 Hình 3. Chỉ thị RAPD-PCR của một số mẫu đảng sâm Việt Nam với mồi OPC3 (hình trái) và OPA15 (hình phải). Hình ảnh phản ánh hiệu quả (tỉ lệ) tạo các băng đồng hình và đa hình khác nhau của các mồi RAPD. Cj1 - Cj15: kí hiệu các mẫu đảng sâm Việt Nam; M: marker ADN 1kb (Fermentas). 4. Kết luận các chỉ thị OPA1600bp, OPA19850bp, OPA171100bp, v.v. có tính đồng hình ở tất cả các mẫu Đảng 1. Đã thiết lập được thành phần và điều kiện sâm. Trong khi OPA11100bp đặc trưng cho nhóm phản ứng PCR phù hợp cho phân tích chỉ thị mẫu thu ở Tây Bắc, hay OPA191000bp chỉ tìm RAPD-PCR cho phân tích di truyền ở loài đảng thấy ở nhóm mẫu thu ở Tây Nguyên. sâm Việt Nam. Theo đó, mỗi 25µL thể tích phản ứng gồm 25 ng ADN khuôn (mẫu thực vật), 1,75mM MgCl2, 0,2mM dNTPs, 1µM mồi 5. Kiến nghị RAPD và 1 đơn vị (u) enzym Taq DNA polymerase; với 35 chu trình ở nhiệt độ bắt cặp Cần tiếp tục mở rông nghiên cứu vốn gen mồi 37oC. cây Đảng sâm nói riêng và các loài cây dược 2. Kỹ thuật RAPD-PCR đã được dùng để liệu ở Việt Nam nói chung bằng các kỹ thuật đánh giá mức đa dạng di truyền của 15 mẫu phân tích ADN, gen và hệ gen, trong đó có kỹ quần thể đảng sâm thu thập ở Việt Nam. Sự thuật RAPD-PCR, phục vụ định hướng cho tương đồng di truyền được tìm thấy tương đồng công tác bảo tồn, chọn, tạo giống và tiêu chuẩn với khoảng cách địa lý. Các mẫu thu ở khu vực hóa nguồn dược liệu làm thuốc. Tây Bắc (Hà Giang, Lào Cai, Sơn La) có hệ số tương đồng di truyền dao động từ 0,71 đến 0,90. Các mẫu thu ở khu vực Tây nguyên (Lâm Lời cảm ơn Đồng, Kon Tum) mức tương đồng di truyền trong khoảng 0,68 - 0,95. Sự khác biệt di Bài báo là kết quả thực hiện nhiệm vụ quĩ truyền rõ nhất được tìm thấy giữa các cặp mẫu gen cấp Nhà nước “Khai thác và phát triển được thu thập từ 2 vùng, điển hình nhất là mẫu nguồn gen Hà thủ ô đỏ và Đảng sâm Việt thu tại Thuận Châu (Sơn La) với các mẫu thu ở Nam làm nguyên liệu sản xuất thuốc” giai Lạc Dương (Lâm Đồng) với hệ số khác biệt di đoạn 2011 - 2015. truyền được xác định là 0,32. Cây quan hệ di truyền phân tách 15 mẫu thành 2 nhánh rõ rệt phân bố ở miền Bắc và Tài liệu tham khảo miền Nam. Một số chỉ thị RAPD - PCR đồng [1] Nguyễn Tiến Bân và nhiều người khác (2007). hình cho tất cả các mẫu của loài đảng sâm Việt Sách đỏ Việt Nam (phần II - Thực vật), NXB Nam, trong khi một số khác có tính đặc trưng Khoa học tự nhiên và công nghệ, tr 152 - 153 và giúp phân biệt 2 nhóm nguồn gen. Chẳng hạn, 303-304.
8. P.T. Huyền, Đ.Đ. Long / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 1 (2017) 32-39 39 [2] Nguyễn Tập (2006). Danh lục Đỏ cây thuốc Spacer-length polymorphisms in barly Việt Nam. Tạp chí Dược liệu, tập 11, số 3, Mendelian inheritance, chromosomal location tr. 97 - 105. and population dynamics. Proc. Natl. Acad. Sci. [3] Đỗ Huy Bích và cộng sự (2003). Cây thuốc và USA., 81: 8014-8018. động vật làm thuốc ở Việt Nam (Tập 1 + 2), [5] Edwards K, Johnstone, Thompson C (1991) A NXB Khoa học và Kỹ thuật. simple and rapid method for the preparation of [4] Sanghai-Maroof MA, KM Soliman, RA plant genomic DNA for PCR analysis. Nucleic Jorgensen, RW Allard, Ribosomal DNA, Acids Res; 19(6): 1349. Analysis of Genetic Diversity on Medicinal Plants of Codonopsis javanica (Blume) Hook. f. using RAPD-PCR Technique Towards Conservation and Plant Breeding in Vietnam Pham Thanh Huyen1, Dinh Doan Long2 1National Institute of Medicinal Materials, Ministry of Health, 3B Quang Trung, Hanoi, Vietnam 2VNU School of Medicine and Pharmacy, 144 Xuan Thuy, Cau Giay, Hanoi, Vietnam Abstract: This study was subjected to assess the genetic diversity of Condonopsis javanica (Blume) Hook f. germplasm in Vietnam for the purposes of conservation and its breeding for planting expansion. Samples of 15 natural and cultivated accessions were collected throughout the country with two major areas of distribution in Northwest Highlands (Lao Cai, Ha Giang, Son La) and Western Highlands (Lam Dong, Kon Tum). DNA of 15 accessions were isolated and amplified by 12 arbitrary primers. A total of 106 RAPD-PCR loci were detected, among which 88 loci (83%) were polymorphic, whereas the other 18 (17%) were homogeneous for all the collected accessions. The cluster analysis showed that 15 accessions were divided into 2 obviously distinct groups. One consisted of 5 accessions collected in Northwest highlands, while the other consisted of 10 remaining accessions collected in West highlands. Thus, RAPD-PCR results indicated that there was abundant genetic diversity amongst natural and cultivated population of C. javanica in Vietnam and their genetic relationship appeared to be related to their geographic distance. Thus, germplasms at geographic distance should be subjected to the conservation and breeding programs of this medicinal plant species. Keywords: Condonopsis javanica, RAPD-PCR, genetic diversity, geographic distance.