Phương pháp định lượng mức độ phản ứng miễn dịch huỳnh quang trên tiêu bản mô học

Nội dung text: Phương pháp định lượng mức độ phản ứng miễn dịch huỳnh quang trên tiêu bản mô học

1. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG MỨC ĐỘ PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG TRÊN TIÊU BẢN MÔ HỌC Tưởng Phi Vương* TÓM TẮT Mục tiêu: xây dựng phương pháp đánh giá định lượng mức độ phản ứng miễn dịch huỳnh quang tiêu bản mô da người trên cơ sở kỹ thuật số phân tích ảnh chụp tiêu bản. Phương pháp: tính tỷ lệ diện tích vùng có tín hiệu huỳnh quang và tính cường độ sáng của từng ảnh thu bằng phần mềm ImageJ. Sử dụng test Spearson để tính tỷ số tương quan r các cặp số liệu. Kết quả: cả hai phương pháp đánh giá định lượng mức độ phản ứng miễn dịch huỳnh quang đều thể hiện tính chính xác, đơn giản, dễ áp dụng, dễ phổ biến và thống nhất cao, sử dụng công cụ phần mềm hoàn toàn miễn phí, cũng như cho phép xử lý số liệu nghiên cứu bằng các thuật toán thống kê. * Từ khóa: Mô da; Miễn dịch huỳnh quang; Desmoglein-1. Quantitative-Analyzing Results of Immunofluoresence Stain on Histological Slide Summary Objectives: To create and estimate effectiveness of quantitative methods for estimating immunofluorescence reactions based on digital analysis of skin tissue slide photo from confocal laser scanning microscopy. Methods: Immunofluorescence reactions on cryostat sectioned and paraffin-slide of human skin were carried out with anti- desmoglein-1 antibody. The total of all immunofluorescence positive areas and mean of grey level in the digital photo were calculated automatically by using ImageJ PC software. Spearson test was used to analyze the correlation of this result. Results: Both quantitative methods in evaluation of immunofluorescence results are simple and easy to use with high level of validation and free image processing software. Beside, the immunofluorescence evaluation method based on photo grey level could help investigators more choices when statistically analyzing results of immunofluorescence reactions. * Keywords: Immunofluorescence quantitative methods; Skin tissue; Desmoglein-1. ĐẶT VẤN ĐỀ cứu, là công cụ hỗ trợ đắc lực cho nghiên cứu mô bệnh học bằng phương pháp miễn Cùng với những thành tựu của khoa dịch huỳnh quang. Kết quả phản ứng miễn học kỹ thuật trong lĩnh vực y tế, sự ra đời dịch huỳnh quang được biểu hiện trên ảnh của kính hiển vi đồng tiêu quét laser nhận chụp tiêu bản bằng kính hiển vi đồng tiêu được sự quan tâm của các nhà nghiên quét laser với độ nhạy và độ đặc hiệu cao. * Viện 69, Bộ Tư Lệnh Bảo vệ Lăng Chủ tịch Hồ Chí Minh Người phản hồi (Corresponding): Tưởng Phi Vương (tphivuong@yahoo.com) Ngày nhận bài: 25/07/2017; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 26/08/2017 Ngày bài báo được đăng: 30/08/2017 80
2. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Tuy nhiên, việc đánh giá mức độ phản ứng * Nhuộm miễn dịch huỳnh quang cả miễn dịch huỳnh quang trên những ảnh này hai loại tiêu bản theo quy trình sau: mới chỉ mang tính định tính (có - không, - Rửa tiêu bản nhanh bằng đệm PBS. yếu - mạnh) và chưa thực sự khách quan. - Khử huỳnh quang không đặc hiệu bằng Điều này cho thấy cần phải xây dựng NaBH4 0,01% trong đệm PBS, 3 lần, phương pháp đánh giá định lượng mức 5 phút/lần. độ phản ứng miễn dịch huỳnh quang để - Rửa tiêu bản bằng đệm PBS, 3 lần, làm tăng tính chính xác và khách quan, 2 phút/lần. tin cậy của kết quả nghiên cứu. Phần mềm - Bão hòa với huyết thanh dê 10% trong phân tích ảnh kỹ thuật số miễn phí chuyên PBS (30 phút, nhiệt độ phòng). dụng cho nghiên cứu y sinh ImageJ của - Ủ với kháng thể trực tiếp (kháng Viện Y học Quốc gia Mỹ cho phép chúng Desmoglein) đ pha lo ng 50 lần (60 phút, tôi thực hiện ý tưởng nghiên cứu này. nhiệt độ phòng). ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP - Rửa nhanh bằng BSA/PBS 0,1%, 3 lần, 2 phút/lần. NGHIÊN CỨU - Ủ với kháng thể gián tiếp gắn huỳnh 1. Đối tƣợng nghiên cứu. quang (AF488) nồng độ 1:200 trong hộp Mẫu mô da người bình thường kích kín, đậy bằng giấy bạc (60 phút, nhiệt độ thước 1 x 1 cm, cố định bằng dung dịch phòng). formaldehyd 4% trong 24 giờ ở nhiệt độ - Rửa nhanh bằng BSA/PBS 0,1%, 3 lần, phòng. 2 phút/lần. 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. - Rửa nhanh bằng PBS, 2 lần, 2 phút/lần. * Chuẩn bị mẫu mô da: - Gắn glyxerol (glycerin: PBS = 9:1 theo - Pha mẫu mô da thành hai phần, một tỷ lệ thể tích). phần để cắt lạnh và phần còn lại đúc - Để khô 10 phút ở nhiệt độ phòng trong paraphin. hộp kín tránh ánh áng. - Tiến hành cắt tiêu bản (cắt lạnh và - Soi tiêu bản nhuộm miễn dịch huỳnh cắt từ block paraphin) dày 4 µm (12 tiêu quang bằng kính LSM 700 (Carl Zeiss, bản mỗi loại), gắn lên lam kính bằng dung Đức) với nguồn lade Ex.488 nm, cường dịch dán albumin pha glycerin. độ 5%, master gain 600, độ phóng đại - Tiêu bản cắt từ block paraphin được 630 lần, pihole 56 µm. Chụp ảnh ở cùng tẩy paraphin, sau đó bộc lộ kháng nguyên một chế độ: ảnh 8 bít, độ phân giải 512 x bằng lò vi sóng (trong đệm citrate 10 mM, 512 pixels tại vị trí vi trường có phản ứng pH = 6, điện áp lò vi sóng 600 W, thời gian miễn dịch huỳnh quang rộng nhất. Lưu ảnh 30 phút). thu được dưới dạng *jpg. 81
3. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 * Đánh giá kết quả phản ứng miễn dịch huỳnh quang bằng phần mềm ImageJ dựa trên tính toán diện tích vùng có tín hiệu huỳnh quang (hình 1): Hình 2: Tính cường độ sáng trung bình của ảnh tiêu bản bằng phần mềm ImageJ. Bước 1: Nhấn open để mở từng ảnh. Bước 2: Nhấn image: chọn type, chọn RGB stack, trên ảnh mở chọn ảnh green. Hình 1: Tính diện tích vùng có tín hiệu huỳnh quang bằng phần mềm ImageJ. Bước 3: Nhấn image: chọn adjust, chọn brightness/contrast, lọc bỏ grey level < 40, Bước 1: Nhấn open để mở từng ảnh. xong nhấn apply. Bước 2: Nhấn image: chọn type, chọn Bước 4: Nhấn analyze: chọn histogram, RGB stack, trên ảnh mở chọn ảnh green. trên màn hình sẽ hiện ra đồ thị histogram Bước 3: Nhấn image: chọn adjust, chọn với thông số mean phía dưới. brightness/contrast, lọc bỏ grey level < 40, Sau khi thu được kết quả tính diện tích xong nhấn apply. và cường độ sáng trung bình của ảnh, Bước 4: Nhấn image: chọn adjust, chọn tiến hành lập bảng 2 x 2 cho mỗi nhóm threshold, chọn dark background, red nhấn (nhóm tiêu bản cắt lạnh và nhóm tiêu bản set: chọn lower threshold level: 40. paraphin) như sau: Bước 5: Nhấn analyze: chọn set Mẫu Tỷ lệ Cƣ ờng độ sáng measurements, chọn area, chọn area diện tích của ảnh fraction, chọn limit to threshold. 1 Bước 6: Nhấn analyze: chọn measure. Trên màn hình sẽ hiển thị bảng kết quả * Đánh giá kết quả phản ứng miễn dịch * Xử lý thống kê: huỳnh quang bằng phần mềm ImageJ Sử dụng test Spearson để tính tỷ số dựa trên tính toán cường độ sáng của ảnh tương quan r kết quả tính diện tích và tính tiêu bản (hình 2): cường độ sáng của ảnh. 82
4. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU b c d Hình 3: Kết quả bộc lộ kháng nguyên desmoglein trên tiêu bản cắt lạnh (a, c) và tiêu bản paraphin (b, d). Nhuộm miễn dịch huỳnh quang gian tiếp với kháng thể gắn huỳnh quang AF488. (Hình a, b: x100; Hình c, d: x630). Dấu ấn kháng nguyên desmoglein của Dấu ấn kháng nguyên được bộc lộ ở liên kết desmosom trên tiêu bản cắt lạnh tất cả các lớp trên thượng bì nhưng với và tiêu bản paraphin đều cho kết quả cường độ mạnh nhất tại vị trí giữa các dương tính. Hình ảnh dấu ấn kháng tế bào lớp gai. Trên màng đáy không nguyên phát hiện thấy ở ranh giới giữa thấy xuất hiện dấu ấn kháng nguyên các tế bào (vùng liên kết giữa hai tế bào cạnh nhau bằng liên kết desmosome). desmoglein-1. Trong khi giữa các lá vảy Tập hợp các dấu ấn kháng nguyên này sừng vẫn xuất hiện những dấu ấn kháng tạo thành dạng mạng lưới đặc trưng. nguyên này. 83
5. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Sử dụng phần mềm ImageJ để tính tỷ Có mối tương quan tuyến tính (r ≈ 1) lệ diện tích vùng có tín hiệu huỳnh quang giữa kết quả tính tỷ lệ diện tích huỳnh và cường độ sáng đối với mỗi ảnh chụp quang và cường độ sáng tương ứng của nhóm tiêu bản cắt lạnh và nhóm tiêu của ảnh tiêu bản cắt lạnh cũng như tiêu bản paraphin rồi lập đồ thị tương quan bản đúc paraphin với độ tin cậy cao giữa kết quả như sau: (p < 0,00001). Nói cách khác, kết quả thu được từ hai phương pháp đánh giá mức độ phản ứng miễn dịch huỳnh quang này tương đồng nhau. BÀN LUẬN Phương pháp đánh giá phản ứng miễn dịch huỳnh quang trên tiêu bản mô dựa trên tính toán diện tích vùng có tín hiệu huỳnh quang bằng phần mềm ImageJ đ được nhiều nghiên cứu sử dụng như: trong đánh giá diện tích vùng cơ tim bị tổn thương ở bệnh nhân nhồi máu cơ tim [3] hay nghiên cứu đánh giá mức độ xơ hóa Đồ thị 1: Mối tương quan giữa kết quả tính gan bằng cách tính diện tích vùng xơ sau tỷ lệ diện tích huỳnh quang và cường độ khi sử dụng các thuốc nhuộm collagen [1]. sáng của ảnh tiêu bản cắt lạnh. Cũng trên cơ sở nguyên tắc tính diện tích của các nghiên cứu này, chúng tôi vận dụng để tính diện tích vùng nhuộm miễn 3.5 y = 1.0527x - 0.34 dịch huỳnh quang trên tiêu bản mô, từ đó 3 R2 = 0.9909 gián tiếp đánh giá mức độ phản ứng miễn 2.5 dịch huỳnh quang. Phương pháp này được 2 chọn để đối chứng cho đánh giá phản 1.5 ứng miễn dịch huỳnh quang mà chúng tôi Tỉ lệ diện tích diện lệ Tỉ 1 nghiên cứu xây dựng. 0.5 Phương pháp đánh giá phản ứng miễn 0 dịch huỳnh quang thông qua chỉ số cường 0 1 2 3 4 độ sáng ảnh, cho đến nay chưa thấy Cường độ sáng trung bình nghiên cứu nào sử dụng. Ý tưởng sử dụng cường độ sáng của ảnh kỹ thuật số xuất phát từ đặc điểm của ảnh tiêu bản Đồ thị 2: Mối tương quan giữa kết quả nhu ộm huỳnh quang chỉ hiển thị vùng tín tính tỷ lệ diện tích huỳnh quang và hi ệu huỳnh quang trên nền tối của tiêu bản. cường độ sáng trung bình của ảnh Do đó, cường độ sáng của ảnh thu được tiêu bản đúc paraphin. phản ánh trực tiếp cường độ huỳnh quang 84
6. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 trên vùng vi trường của tiêu bản đó. Giá trị hợp này, kết quả định lượng mức độ trung bình của cường độ sáng ảnh khác phản ứng miễn dịch huỳnh quang hoàn nhau (số lượng ảnh cần phải tính toán đối toàn có thể chuyển đổi thành bán định với từng nghiên cứu cụ thể để có tính đại lượng (thứ hạng) hoặc định tính (danh mục) diện cao) của cùng một tiêu bản sẽ “đại diện” dựa trên đặc điểm của ảnh kỹ thuật số. cho cường độ huỳnh quang của tiêu bản Chuyển đổi thành kết quả bán định lượng đó. Như vậy, phương pháp này cho phép có thể dễ dàng thực hiện khi áp dụng test định lượng mức độ phản ứng miễn dịch U Mann - Whitney. Dưới đây miêu tả cách huỳnh quang của tiêu bản mô học. Từ đó thức chuyển đổi kết quả nhuộm miễn dịch tạo thuận lợi để xử lý thống kê kết quả huỳnh quang từ định lượng cường độ sáng thu được bằng thuật toán thống kê với của ảnh sang định tính cường độ sáng biến liên tục và cho nhiều thông tin hơn của ảnh. các phương pháp thống kê với biến không Do ảnh thu được dưới dạng 8 bit nên liên tục (biến thứ hạng, danh mục). cường độ sáng trung bình cũng dao động Bên cạnh đó, một vấn đề đặt ra đối với trong khoảng 0 (đen) đến 255 đơn vị (trắng) nghiên cứu mô học nói chung đều có số trong histogram của ảnh. Mặt khác, mắt lượng mẫu rất hạn chế. Do vậy, chỉ có thể người chỉ có khả năng cảm nhận được 24 sử dụng được phương pháp thống kê cho khác biệt (tương đương 255/24 ≈ 10 đơn biến thứ hạng (test U Mann - Whitney) hoặc vị cường độ sáng) trên histogram của ảnh biến danh mục (test Fisher). Trong trường (hình 4). Hình 4: 24 mức độ sáng mà mắt người có thể cảm nhận được sự khác nhau. Trên cơ sở những suy luận logic này, có thể quy ước định tính mức độ phản ứng miễn dịch huỳnh quang. Bảng 1: Quy ước định tính mức độ phản ứng miễn dịch huỳnh quang trên cơ sở cường độ sáng của ảnh chụp tiêu bản nhuộm miễn dịch huỳnh quang. Cƣờng độ sáng của ảnh tiêu bản nhuộm miễn dịch Đ ịnh tính mức độ phản ứng miễn huỳnh quang dịch huỳnh quang Từ 0 - < 10 đơn vị cường độ sáng Âm tính Từ 10 - < 20 đơn vị cường độ sáng Yếu Từ 20 - < 30 đơn vị cường độ sáng Trung bình Từ 30 - < 40 đơn vị cường độ sáng Mạnh ≥ 40 Rất mạnh 85
7. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Hoặc có thể lập bảng 2 x 2 định tính KẾT LUẬN phản ứng miễn dịch huỳnh quang. Hai phương pháp đánh giá định lượng Bảng 2: Quy ước xác định dương-âm phản ứng miễn dịch huỳnh quang trên cơ tính của phản ứng miễn dịch huỳnh quang sở phân tích kỹ thuật số ảnh tiêu bản trên cơ sở cường độ sáng của ảnh chụp (tính tỷ lệ diện tích vùng xảy ra phản ứng tiêu bản nhuộm miễn dịch huỳnh quang. miễn dịch huỳnh quang và tính cường độ sáng của ảnh) bằng phần mềm ImageJ Số mẫu dƣơng Số mẫu âm tính Tổng tính (> 10 đơn vị (< 10 đơn vị chúng tôi nghiên cứu xây dựng thể hiện số cƣờng độ sáng) cƣờng độ sáng) tính chính xác, đơn giản, dễ áp dụng, Nhóm 1 phổ biến với tính thống nhất cao, sử dụng công cụ phần mềm hoàn toàn miễn phí. Nhóm 2 Bên cạnh đó, còn giúp các nhà nghiên Tổng số cứu có thêm nhiều lựa chọn thuật toán thống kê (có thể dùng cả test với biến liên Sau đó sử dụng test Fisher để kiểm tục, biến thứ hạng và biến danh mục), chứng, so sánh sự khác nhau trong kết bảo đảm linh hoạt và tin cậy trong xử lý quả phản ứng miễn dịch huỳnh quang thu kết quả nghiên cứu. được giữa hai nhóm nghiên cứu. Như vậy, hai phương pháp đánh giá TÀI LIỆU THAM KHẢO mức độ phản ứng miễn dịch huỳnh quang đều cho kết quả tương đồng, có thể lựa 1. Amin Ali H, Mohamed A.El-Missiry, Fatna M. Elhusseini, Thuraya M.Mutawi. chọn áp dụng một trong hai phương pháp Assessment of hepatic fibrosis by image này để đánh giá mức độ phản ứng miễn analysis software in relation to physiological dịch huỳnh quang. Ưu điểm của chúng đều markers. International Journal of Advanced mang tính định lượng, đơn giản, dễ áp Reseach. 2016, 4 (4), pp.1676-1688. dụng, phổ biến với tính thống nhất cao, 2. Carey J. Light and Photography: sử dụng công cụ phần mềm hoàn toàn Exposure and Tonal Range Considerations, miễn phí. Phương pháp tính cường độ sáng không những giúp các nhà nghiên photogra-phy-exposure-and-tonal-range-conside- cứu có thêm lựa chọn thuật toán thống kê rations/2011. (có thể dùng cả test với biến liên tục, biến 3. Olivera L.F.L, Mejia J, Carvalho E.E.V thứ hạng và biến danh mục), bảo đảm sự et al. Myocardial infarction area quantification linh hoạt và tính tin cậy trong xử lý kết using high-resolution SPECT images in rats. quả nghiên cứu. Arq Bras Cardiol. 2013, 101 (1), pp.59-67. 86