Phát triển kỹ thuật reverse transcription polymerase chain reaction xác định virut ebola

Nội dung text: Phát triển kỹ thuật reverse transcription polymerase chain reaction xác định virut ebola

1. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2016 PHÁT TRI ỂN K Ỹ THU ẬT REVERSE TRANSCRIPTION POLYMERASE CHAIN REACTION XÁC ĐỊNH VIRUT EBOLA Nguy ễn V ăn An*; Nguy ễn Thái S ơn*; Bùi Ti ến S ỹ** Hoàng Xuân S ử***; H ồ Hữu Th ọ***; Đinh Th ị Thu H ằng*** TÓM T ẮT Mục tiêu: thi ết k ế ph ản ứng RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) phát hi ện đồng th ời 5 loài virut Ebola , góp ph ần ch ẩn đoán nhanh, chính xác, k ịp th ời ng ăn ch ặn và ki ểm soát lây lan c ủa d ịch b ệnh do virut Ebola . Vật li ệu và ph ươ ng pháp: các trình t ự toàn b ộ bộ gen c ủa 5 loài virut Ebola được thu th ập t ừ Ngân hàng d ữ li ệu GenBank. S ử dụng ph ần m ềm tin sinh h ọc thi ết k ế mồi đặc hi ệu v ới virut Ebola, th ực hi ện ph ản ứng RT-PCR v ới các c ặp m ồi v ừa thi ết k ế trên mẫu ARN chu ẩn d ươ ng và chu ẩn âm b ằng b ộ kít One-Step RT-PCR (Thermo Fisher, M ỹ). Kết qu ả: thi ết k ế được 01 m ồi xuôi (Ebo-pan-Fwd: GTGTGCGARTAACTAYGAGGAAG), 02 mồi ng ược (Ebo-pan-Rev2: GGATGACTCTTTGYCGMACAAT, Ebo-pan-Rev3: GGCATGGCAGCMARTGTTCTC). Kết qu ả th ực hi ện ph ản ứng RT-PCR s ử dụng b ộ kít One-Step RT-PCR (Thermo Fisher, M ỹ) đối v ới chu ẩn d ươ ng ARN c ủa virut Ebola ch ủng Zaire Mayinga (giáo s ư Jonas Schmidt- Chanasit ở Vi ện Y h ọc Nhi ệt đới Bernhard Nocht, Hamburg, C ộng hòa Liên bang Đức cung cấp) cho 2 b ăng đặc hi ệu v ới Ebola có kích th ước l ần l ượt là 541 bp, 830 bp; không xu ất hi ện băng đặc hi ệu đối v ới m ẫu chu ẩn âm là virut Dengue. Kết lu ận: đã thi ết k ế thành công ph ản ứng RT-PCR ch ẩn đoán virut Ebola. * T ừ khóa: Virut Ebola; RT-PCR; Zaire Ebola. Development and Validation of One-Step Reverse-Transcription- PCR for Simultanous Detection of Five Ebolavirus Species Summary Objectives: To establish one-step RT-PCR for simultanous detection of five Ebolavirus species. Materials and methods: Full genome sequences of five Ebolavirus species retrieved from the Genebank for design of primers using Primer Express software. RT-PCR has been optimized and validated with the positive and negative standards using One-Step RT-PCR kit (Thermo Fisher, USA). Results and conclusions: We designed one forward primer and two reverse primers with following sequences: Ebo-pan-Fwd: GTGTGCGARTAACTAYGAGGAAG, Ebo-pan-Rev2: GGATGACTCTTTGYCGMACAAT, Ebo-pan-Rev3: GGCATGGCAGCMARTGTTCTC, respectively. Primer pairs above were tested with the positive standard (Zaire Virut Ebola Mayinga, kindly provided by Pr Jonas Schmidt-Chanasit, Bernhard Nocht Institute for Tropical Medicine, Hamburg, Germany) using One-Step RT-PCR kit. (Thermo Fisher, USA). Clear and specific bands were detected at 354 bp for Ebo-pan-Rev2 and 830 bp Ebo-pan-Rev3, respectively. * Bệnh vi ện Quân y 103 ** B ệnh vi ện TWQ Đ 108 *** Học vi ện Quân y Ng ười ph ản h ồi (Corresponding): Nguy ễn Văn An (ank59hvqy@gmail.com) Ngày nh ận bài: 30/06/2016; Ngày ph ản bi ện đánh giá bài báo: 07/09/2016 Ngày bài báo được đă ng: 29/09/2016 74
2. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2016 The specificity of this assay was 100% as verified by testing with RNA extracted from plasma in patients infected with Dengue virus. Conclusion: We have developed and validated successfully one-step reverse transcription-PCR for simultanous detection of five Ebolavirus species. * Key words: Ebolavirus; RT-PCR; Zaire Ebola. ĐẶT V ẤN ĐỀ th ời ng ăn ch ặn và ki ểm soát s ự lây lan ủ ị Virut Ebola g ồm 5 loài E. Sudan, c a d ch virut Ebola. E. Zaire, E. Bundibugyo, E. Taï Forest, VẬT LI ỆU VÀ PH ƯƠ NG PHÁP E. Reston được phát hi ện l ần đầu tiên t ại NGHIÊN C ỨU Trung Phi n ăm 1976 t ừ hai đại d ịch ở Sudan và Congo [1]. Dịch virut Ebola * V ật li ệu: (EVD) bùng phát ở Tây Phi t ừ cu ối n ăm - Chu ẩn d ươ ng: ARN tách t ừ tế bào 2013, là v ụ dịch kéo dài nh ất và gây t ử lây nhi ễm ch ủng virut Zaire Ebola vong nhi ều nh ất trong s ố các v ụ dịch do Mayinga do Vi ện Y h ọc Nhi ệt đới virut Ebola được ghi nh ận t ừ tr ước đến Bernhard Nocht (Harmbug, Đức) trao nay, đặc bi ệt l ần đầu tiên d ịch virut Ebola tặng. vượt ra kh ỏi ranh gi ới Trung Phi. Tính - Hóa ch ất: tris base, Taq-polymerase, đến ngày 27 - 03 - 2016, theo T ổ ch ức Y trizol (Sigma, M ỹ), kít QIAGEN One-Step tế Th ế gi ới (WHO), v ụ dịch này đã có đến RT-PCR. 28.646 ng ười m ắc b ệnh ở 10 qu ốc gia - Thi ết b ị: GeneAmp PCR System khác nhau, v ới s ố ca t ử vong lên đến trên 9700 (Thermo Fisher, M ỹ), máy ch ụp ảnh 11.323 ng ười [2]. Hi ện nay trong các gel Dolphin-Doc (Vealtec, M ỹ). ph ươ ng pháp ch ẩn đoán Ebola, sinh h ọc 2. Ph ươ ng pháp nghiên c ứu. phân t ử là ph ươ ng pháp có độ nh ạy, độ - Sử dụng ph ần m ềm tin sinh h ọc k ết đặc hi ệu cao, th ời gian cho k ết qu ả nhanh hợp v ới th ực nghi ệm labo. [3]. Có nhi ều nghiên c ứu đã s ử dụng RT- PCR (Reverse transcription-PCR) ch ẩn - Ph ần m ềm s ử dụng: BioEdit v7.9, đoán Ebola nh ư: Jonathan S s ử dụng RT- Clone Manager Professional v9 để tìm ra PCR phát hi ện E. Sudan, E. Zaire trong thông s ố của m ồi và thi ết k ế mồi. máu t ại v ụ dịch ở Uganda n ăm 2000 [4], - Trình t ự toàn b ộ bộ gen virut Ebola Yohei Kurosaki s ử dụng k ỹ thu ật RT- của c ả 5 loài: E. Sudan, E.Zaire, E. LAMP (Reverse Transcription-Loop Bundibugyo, E. Taï Forest, E. Reston thu Mediated Isothermal Amplification) để th ập t ừ Ngân hàng Gen GenBank. ch ẩn đoán E. Zaire [5], Lui L sử dụng 76 trình t ự toàn b ộ bộ gen c ủa c ủa 5 realtime RT-PCR để ch ẩn đoán E. Zaire loài virut Ebola được thu th ập t ừ Ngân tại v ụ dịch ở Sierra Leone n ăm 2014 [6]... hàng Gen GenBank c ủa NCBI (National Trong nghiên c ứu này, chúng tôi ti ến Center for Biotechnology Information): hành thi ết k ế ph ản ứng RT-PCR ch ẩn đoán đồng th ời c ả 5 loài virut Ebola góp sVariation/Database/nph-select.cgi, ph ần phát hi ện nhanh, chính xác để kịp trong đó 50 trình t ự E. Zaire , 6 trình t ự 75
3. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2016 E. Sudan , 3 trình t ự E. Bundibugyo, 1 Để tăng tính đa d ạng cho d ữ li ệu g ốc các trình t ự E. Taï Forest , 16 trình t ự E. trình t ự tham chi ếu, chúng tôi l ựa ch ọn Reston . Hình 1 minh h ọa các b ước thu th ập trình t ự các ch ủng Ebola ở nhi ều vùng địa trình t ự toàn b ộ bộ gen c ủa virut Ebola. lý khác nhau và th ờ i đ i ể m khác nhau. Hình 1: Dữ li ệu b ộ gen virut Ebola trên GenBank. - Kỹ thu ật RT-PCR: cADN t ổng h ợp t ừ ARN chu ẩn d ươ ng và ARN chu ẩn âm thông qua ph ản ứng phiên mã ng ược dùng làm khuôn cho ph ản ứng PCR. KẾT QU Ả NGHIÊN C ỨU VÀ BÀN LU ẬN 1. Kết qu ả thi ết k ế mồi. Bộ gen c ủa virut Ebola có kích th ước kho ảng 19 kb, g ồm 7 gen: nucleprotein (NP), viral protein (VP) 35 - VP40 - glycoprotein - VP30 - VP24 - ARN polymerase (L), trong đó gen NP được coi là khá b ảo t ồn trong b ộ gen c ủa virut Ebola và được nhi ều nghiên cứu tr ước đây s ử dụng làm đích phát hi ện để thi ết k ế ph ản ứng RT-PCR ch ẩn đoán virut Ebola [5, 7]. Sau khi có được trình t ự vùng không mã hóa đầu 3’ và toàn b ộ gen NP, sử dụng l ệnh ch ọn vùng b ảo t ồn v ới m ột trình t ự có s ẵn trong c ửa s ổ của ph ần mềm BioEdit 7.9, chúng tôi l ựa ch ọn 01 m ồi xuôi và 02 m ồi ng ược cho ph ản ứng RT- PCR phát hi ện đồng th ời 5 loài virut Ebola, ký hi ệu l ần l ượt là Pan-Ebo-Fwd, Pan-Ebo- Rev2 và Pan-Ebo-Rev3. Bảng 1: Trình t ự mồi c ủa ph ản ứng RT-PCR ch ẩn đoán Ebola. STT Tên m ồi Trình t ự Kích th ước s ản ph ẩm 1 Ebo-pan-Rev2 GGATGACTCTTTGYCGMACAAT 541 base pair 2 Ebo-pan-Fwd GTGTGCGARTAACTAYGAGGAAG 3 Ebo-pan-Rev3 GGCATGGCAGCMARTGTTCTC 830 base pair 4 Ebo-pan-Fwd GTGTGCGARTAACTAYGAGGAAG 76
4. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2016 Hình 2: Trình t ự và v ị trí c ủa m ồi Pan-Ebo-Fdw, Pan-Ebo-Rev2, Pan-Ebo-Rev3 . Các trình t ự mồi đều được ki ểm tra l ại b ằng công c ụ Blast nucleotid để ki ểm tra s ự bắt c ặp chéo v ới các ch ủng virut ngoài Ebola, k ết qu ả cho th ấy: 100% trình t ự gi ống với trình t ự mồi c ủa Ebola. K ết qu ả ki ểm tra m ồi Pan-Ebo-Rev2 bi ểu th ị ở hình 3 và bằng đường link Hình 3: Ki ểm tra lo ại tr ừ sự bắt chéo v ới các virut khác c ủa m ồi Pan-Ebo-Rev2. 2. K ết qu ả phản ứng RT-PCR trên m ẫu ARN Zaire Ebola Mayinga và ARN virut Dengue. * Quy trình th ực hi ện ph ản ứng RT-PCR ch ẩn đoán virut Ebola b ằng bộ kít QIAGEN One-Step RT-PCR: - Chu ẩn b ị ARN primer mix: primer reverse 10 µM (1 µl), primer foward 10 µM (1 µl), ARN template (4 µl): 75 0C/5 phút, làm l ạnh ngay trong đá 5 phút. - Thành ph ần ph ản ứng RT-PCR: ARN primer mix (6 µl), Buffer 5x (5 µl), dNTP mix (0,5 µl), ARNse Inhibitor (0,5 µl), RT-PCR enzyme mix (0,5 µl), H 2O (12,5 µl). 77
5. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2016 - Chu trình nhi ệt: 42°C/30 phút - 95°C/3 phút - (95°C/30 giây - 50°C/30 giây - 72°C/45 giây) x 30 chu k ỳ - 75°C/5 phút. M: Marker 100 bp Gi ếng 1: phản ứng RT-PCR s ử dụng c ặp m ồi Ebo-pan-Fwd/Rev3 v ới m ẫu chu ẩn d ươ ng Zaire Ebola Mayinga. Gi ếng 2: ph ản ứng RT-PCR s ử dụng c ặp m ồi Ebo-pan-Fwd/Rev2 v ới m ẫu chu ẩn d ươ ng Zaire Ebola Mayinga. Gi ếng 3: ph ản ứng RT-PCR v ới m ẫu chu ẩn âm RNA virut Dengue. Hình 4: Kết qu ả ph ản ứng RT-PCR ch ẩn đoán Ebola. Kết qu ả hình 4 cho th ấy 2 ph ản ứng trình RT-PCR phát hi ện c ả 5 loài virut RT-PCR v ới c ả 01 m ồi xuôi và 02 m ồi Ebola trong nh ững nghiên c ứu ti ếp theo. ng ược đều cho k ết qu ả dươ ng tính, band Để kh ẳng định s ản ph ẩm PCR ch ứa điện di đặc hi ệu xu ất hi ện v ới kích th ước band đặc hi ệu c ủa virut Ebola, chúng tôi 541 bp và 830 bp. Tuy nhiên, m ặc dù kích ti ến hành tinh s ạch s ản ph ẩm PCR và gi ải th ước s ản ph ẩm dài h ơn, nh ưng hi ệu qu ả trình t ự trên h ệ th ống ABI-1300, k ết qu ả khu ếch đại c ủa m ồi xuôi Pan-Ebo-Fwd và gi ải trình t ự đối chi ếu v ới Ngân hàng mồi ng ược Pan-Ebo-Rev3 l ớn h ơn nhi ều GenBank b ằng công c ụ Blast Nuclecotid. so v ới ph ản ứng PCR v ới c ặp m ồi Pan- Kết qu ả phân tích trình t ự thu được cho Ebo-Fwd và m ồi ng ược Pan-Ebo-Rev2. th ấy đây là trình t ự đặc hi ệu c ủa virut Chúng tôi ti ếp t ục ti ến hành các ph ản ứng Zaire Ebola . Hình 5 bi ểu hi ện k ết qu ả đối PCR khác nhau v ới c ặp m ồi Pan-Ebo- chi ếu trình t ự của s ản ph ẩm PCR sau khi Fwd và Pan-Ebo-Rev3 để tối ưu hóa quy gi ải trình t ự bằng công c ụ blast nucleotid. 78
6. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2016 Hình 5: Kết qu ả blast nucleotid c ủa trình t ự sản ph ẩm RT-PCR thu được. KẾT LU ẬN 2. WHO . situation/ebola-situation-report-30-march- Thi ết k ế thành công ph ản ứng RT- 2016. 2016. PCR xác định virut Ebola v ới 01 m ồi xuôi 3. Grolla, A et al . Laboratory diagnosis of (Ebo-pan-Fwd), 02 m ồi ng ược (Ebo-pan- Ebola and Marburg hemorrhagic fever. Bull Rev2, Ebo-pan-Rev3). K ết qu ả th ực hi ện Soc Pathol Exot. 2005, 98 (3), pp.205-209. ph ản ứng RT-PCR đối v ới chu ẩn d ươ ng 4. Towner, JS et al. Rapid diagnosis of ARN virut Zaire Ebola Mayinga cho 2 Ebola hemorrhagic fever by reverse ă đặ ệ ớ b ng c hi u v i virut Ebola có kích transcription-PCR in an outbreak setting and th ước là 541 bp, 830 bp, không xu ất hi ện assessment of patient viral load as a predictor băng đặc hi ệu đối v ới m ẫu chu ẩn âm là of outcome. J Virol. 2004, 78 (8), pp.4330-4341. virut Dengue . Thành ph ần ph ản ứng RT- 5. Kurosak Y et al . Rapid and simple PCR g ồm: ARN primer mix (6 µl), Buffer 5 detection of Ebola virus by reverse x (5 µl), dNTP mix (0,5 µl), ARNse transcription-loop-mediated isothermal Inhibitor (0,5 µl), RT-PCR enzyme mix amplification. J Virol Methods. 2007, 141 (1), (0,5 µl), H 2O (12,5 µl). Chu trình nhi ệt: pp.78-83. 42°C/30 phút - 95°C/3 phút - (95°C/30 6. Liu L et al . Detection of Zaire Ebola virus giây - 50°C/30 giây -72°C/45 giây) x 30 by real-time reverse transcription-polymerase chu k ỳ - 75°C/5 phút. chain reaction. Sierra Leone. 2014. J Virol Methods. 2015, 222, pp.62-65. TÀI LI ỆU THAM KH ẢO 7. Ogawa, H et al . Detection of all known 1. Bres, P. The epidemic of Ebola filovirus species by reverse transcription- haemorrhagic fever in Sudan and Zaire, 1976: polymerase chain reaction using a primer set introductory note. Bull World Health Organ. specific for the viral nucleoprotein gene. 1978, 56 (2), p.245. J Virol Methods. 2011, 171 (1), pp.310-313. 79