Phát hiện và định lượng ADN phôi thai tự do trong huyết tương người mẹ bằng phương pháp realtime - Pcr

Nội dung text: Phát hiện và định lượng ADN phôi thai tự do trong huyết tương người mẹ bằng phương pháp realtime - Pcr

1. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2014 PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƢỢNG ADN PHÔI THAI TỰ DO TRONG HUYẾT TƢƠNG NGƢỜI MẸ BẰNG PHƢƠNG PHÁP REALTIME - PCR Triệu Tiến Sang*; Trần Văn Khoa*; Đinh Đoàn Long** TÓM TẮT Việc phát hiện ra sự tồn tại của ADN phôi thai tự do và tế bào phôi thai tự do trong huyết tương người mẹ đã mở ra một hướng chẩn đoán trước sinh mới bằng biện pháp không can thiệp. Để định lượng được ADN phôi thai tự do trong huyết tương người mẹ, chúng tôi sử dụng phương pháp Realtime - PCR dựa trên kỹ thuật TaqManPCR Realtime có sử dụng đầu dò huỳnh quang. Kỹ thuật này cho phép quan sát được các tín hiệu huỳnh quang của gen đích và biết được số bản copy của chúng ở từng chu kỳ nhân gen. Đối tượng nghiên cứu: 40 thai phụ đang mang thai từ tuần thứ 7 đến tuần thứ 12 của thai kỳ. Kết quả: gen GAPDH xuất hiện tín hiệu ở cả 40 mẫu với số bản copy dao động từ 4,63E + 02 đến 7,99E + 05/1 ml huyết tương. Gen SRY xuất hiện tín hiệu huỳnh quang ở các mẫu thai nam từ 1,48E + 00 đến 2,97E + 03. Hai mẫu nội chứng âm gen SRY không xuất hiện tín hiệu và gen GAPDH xuất hiện tín hiệu với số bản copy mẫu nội chứng âm số 1 là 1,33E + 04 và số bản copy của mẫu nội chứng âm 2 là 1,44E + 04. * Từ khoá: ADN phôi thai tự do; Huyết tương mẹ; Định lượng. Detection and quantitation of fetal cell Dna in maternal peripheral blood by realtime - pcr Summary Introduction: the discovery of the existence of fetal cells in maternal peripheral blood has opened up a new direction for early diagnosis of congenital anomalies by means of non-interference. To quantify fetal DNA circulating in maternal blood we used Realtime - PCR method based on TaqMan PCR technique using fluorescent probes. This technique allows to observe the fluorescence signal of the target gene DNA for us to know the number of copies of each target gene at each time point of the PCR process. Objects, chemicals DNA research methods: we shall select 40 pregnant women in the 7th week to the 12th week of pregnancy. Along with two negative control sample of 2 DNA pregnant women not yet having sex once 5 ml of blood is taken DNA conduct split DNA separated plasma free plasma DNA as the other sample. Results: 40 samples were studied gene GAPDH signals appear with number of copy of GAPDH gene in 1 ml is from 4.63E + 02 to 7.99E + 05 in 1 ml of plasma. SRY gene appearance signals in the positive samples ADN the number of copies of the SRY gene ranged from 1.48 to 2.97E + 03 in 1 ml of plasma. The form does not appear SRY gene signal is the pregnant female gender, levels of GAPDH gene in plasma DNA of this sample ranged from 1.88 to 8.13E + 04E + 03 copies in 1 ml of plasma. For internal negative control sample 2 signal SRY gene does not appear DNA GAPDH gene signal of internal negative control sample 1 is 1.33E + 04 DNA internal negative control 2 is 1.40E + 04 copies/ml. * Key words: Fetal DNA; Realtime - PCR; Non-interference. * Học viện Quân y ** Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội Người phản hồi (Corresponding): Triệu Tiến Sang (trieusangk83@yahoo.com) Ngày nhận bài: 28/04/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 18/05/2014 Ngày bài báo được đăng: 26/06/2014 46
2. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2014 ĐẶT VẤN ĐỀ 2 nữ giới chưa mang thai và chưa quan hệ tình dục lần nào, lấy 5 ml máu và tiến Nhiều phương pháp chẩn đoán trước hành tách huyết tương, tách ADN tự do sinh đã được áp dụng trong lâm sàng trong huyết tương như các mẫu nghiên như: siêu âm thai, test sàng lọc bộ ba cứu khác. Nghiên cứu được thực hiện (triple test), là những biện pháp không tại Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học can thiệp, nhưng cho kết quả muộn và độ Quân sự, Học viện Quân y. đặc hiệu thấp. Ngoài ra, còn có các phương pháp cho kết quả sớm như: chọc hút nước 2. Hóa chất nghiên cứu. ối, sinh thiết gai rau. Nhưng đây là những - Hóa chất tách chiết ADN: ethanol 70%, phương pháp có can thiệp, tỷ lệ biến ethanol 100%, proteinase K, nước cất, bộ kít chứng cao cho cả thai nhi và sản phụ. Quiagen. Việc phát hiện ra sự tồn tại của tế bào - Hóa chất cho PCR: PCR Reaction phôi thai trong máu ngoại vi của mẹ đã Mix, DNA Polymerase, Reverse primer, mở ra một hướng đi mới cho chẩn đoán Forward primer, probe, nước cất khử ion sớm các dị tật bẩm sinh bằng phương và vô trùng. pháp không can thiệp. - Thiết bị: máy lắc ổn nhiệt (Eppendorf, Đức), máy ly tâm cao tốc (Hettich, Đức), Để định lượng được ADN phôi thai lưu buồng thao tác PCR (Mỹ), máy Realtime - hành trong máu mẹ, chúng tôi dùng phương PCR (RotoGen, Quiagene), máy PCR ABI pháp realtime - PCR dựa trên kỹ thuật 9700 (Applied Biosystem), tủ hốt hoá chất PCR TaqMan sử dụng đầu dò huỳnh quang. (Hàn Quốc), máy đo nồng độ ADN (Nano Kỹ thuật này cho phép quan sát các tín Drop, Mỹ). hiệu huỳnh quang của gen đích và cho ta 3. Phƣơng pháp nghiên cứu. biết số bản copy của từng gen đích ở từng thời điểm của quá trình PCR. Do vậy, Huyết tương sau khi ly tâm, lấy 200 ml chúng tôi thực hiện nghiên cứu này với tách chiết bằng bộ kít của Quiagen. ADN mục tiêu: Phát hiện và định lượng ADN sau khi tách chiết được hòa tan trong 50 ul phôi thai tự do trong huyết tương người H2O deion. mẹ bằng phương pháp realtime - PCR. ADN này sau đó được khuếch đại bằng kỹ thuật realtime - PCR với các đầu dò: ĐỐI TƢỢNG, HOÁ CHẤT VÀ SRY_F 5'-TGGCGATTAAGTCAAATTCGC -3' PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU SRY_R 5'-CCCCCTAGTACCCTGACAATGTATT -3' 1. Đối tƣợng nghiên cứu. Probe SRY 5'-(FAM)_TCTGCCTCCCTGACT-GCTCTACTGCT_(TAMRA)-3' 40 phụ nữ mang thai từ tuần thứ 7 đến GAPDH_F 5'-CCCCACACACATGCACTTACC-3' tuần thứ 12 của thai kỳ. Tất cả được lấy GAPDH_R 5'-CCTAGTCCCAGGGCTTTGATT-3' 5 ml máu toàn phần và ly tâm 5.000 Probe GAPDH 5’(HEX)_AAAGAGCTAGGAAGGACAGGCAACTTGGC_(BHQ1)3’ vòng/phút trong 5 phút rồi lấy huyết Đánh dấu đầu dò bằng 2 màu huỳnh tương. Cùng với 2 mẫu đối chứng âm là quang HEX và FAM. 46
3. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2014 Thực hiện quá trình chạy PCR theo chu trình sau: Phản ứng PCR với tổng thể tích phản ứng 25 ul, trong đó PCR master mix 10 ul; primer SRY (F, R probe):(0,25:0,25:0,5) ul và primer GAPDH (F, R probe):(0,25:0,25:0,5 ul); nước: 8 ul. 950C 10 phút 1 chu kỳ 950C 1 phút 55 chu kỳ 600C 1 phút * Xử lý số liệu: bằng phần mềm chuyên dụng của máy chạy realtime-PCR RotoGen - Quiagen đã tích hợp sẵn và các thuật toán thống kê trên phần mềm phân tích số liệu Excel Microsoft Office. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 1. Kết quả sau khi chạy đƣờng chuẩn của gen SRY và gen GAPDH trong mẫu chuẩn pha loãng ở các nồng độ 104, 103, 102. Hình 1: Hình ảnh phân tích đường chuẩn của gen GAPDH. 47
4. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2014 Tín hiệu của gen GAPDH lên đẹp, đường chuẩn tốt có hệ số R = 0,99997; R2 = 0,99993, hệ số tương quan rất chặt. Tính được số bản copy của các mẫu nghiên cứu của gen GAPDH theo công thức: Gen SRY với tín hiệu huỳnh quang màu xanh dưới đây cũng cho tín hiệu tốt và đường chuẩn lên đẹp với hệ số tương quan chặt R = 0,99988 và R2 = 0,99975. Hình 2: Hình ảnh phân tích đường chuẩn của gen SRY. Tính số bản copy của gen SRY theo công thức sau: 48
5. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2014 2. Kết quả chạy định lƣợng 40 mẫu huyết tƣơng phụ nữ mang thai từ tuần thứ 8 đến tuần 12 của thai kỳ. Áp dụng quy trình trên để định lượng kiểm tra nồng độ ADN thai nhi trong huyết tương người mẹ trên 40 mẫu bằng cặp mồi và probe trên gen SRY, cùng với 2 mẫu đối chứng âm, thu được các kết quả sau: Bảng 1: Nồng độ ADN của thai nhi trong huyết tương người mẹ. MÃ BỆNH TUỔI SỐ BẢN COPY SỐ BẢN COPY TỶ LỆ GEN STT CT_SRY Ct_GAPDH NHÂN THAI GEN SRY GEN GAPDH SRY/GAPDH (%) 1 623 8,3 2,60E + 02 36,96 2,13E + 04 24,55 1,2207 2 622 8,4 3,50E + 02 38,62 2,89E + 04 25,65 1,2115 3 621 8 1,59E + 02 35,54 2,10E + 04 23,48 0,7571 4 301 9 1,01E + 03 29,62 7,99E + 05 27,47 0,1264 5 296 8,2 3,51E + 00 35,21 5,08E + 02 26,95 0,6909 6 308 8,4 1,48E + 00 34,33 6,92E + 02 27,75 0,2139 7 269 8,3 2,97E + 03 32,51 1,89E + 05 26,48 1,5714 8 317 8 1,96E + 03 33,6 4,33E + 04 24,47 4,5266 9 322 8 7,24E + 01 40,89 7,56E + 02 29,95 9,5767 10 277 8,2 2,31E + 02 36,85 3,47E + 03 25,67 6,6571 11 303 8 1,66E + 01 42,34 1,38E + 03 29,98 1,2029 12 323 8,3 2,31E + 02 35,67 2,79E + 03 30,99 8,2766 13 555 12 1,09E + 02 38,72 7,43E + 02 31,02 14,6703 14 545 8,2 6,77E + 01 39,66 1,21E + 03 34,68 5,5950 15 551 8 6,86E + 02 35,02 3,11E + 04 23,49 2,2058 16 540 10 5,27E + 02 35,55 4,02E + 03 27,62 13,1095 17 542 7,5 1,23E + 02 36,56 1,20E + 04 25,42 1,0250 18 570 8 1,28E + 02 38,38 1,51E + 04 24,94 0,8477 19 327 9 7,81E + 01 39,38 2,41E + 03 33,29 3,2407 20 582 9 1,64E + 02 37,89 5,19E + 03 31,74 3,1599 21 567 10 1,95E + 02 39,82 2,21E + 03 28,83 8,8235 22 538 8 7,24E + 01 34,99 3,19E + 03 32,72 2,2696 23 537 8 2,31E + 02 39,52 2,57E + 04 23,87 0,8988 24 583 8 1,66E + 01 36,56 2,41E + 03 28,65 0,6888 25 575 8 4,15E + 01 41,1 2,28E + 04 24,12 0,1820 26 316 8 1,35E + 02 38,28 1,61E + 04 34,1 0,8385 27 331 11,2 2,57E + 02 36,99 2,34E + 03 28,71 10,9829 28 298 8 1,36E + 02 38,27 9,21E + 04 21,3 0,1477 49
6. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2014 29 297 8 2,87E + 02 38,21 1,08E + 04 30,27 2,6574 30 314 11 4,02E + 01 40,71 4,63E + 02 31,97 8,6825 Âm nội 31 - - - 1,33E + 04 29,08 0,00 chứng 1 Âm nội 32 - - - 1,40E + 04 27,75 0,00 chứng 2 33 270 8,4 - - 8,13E + 04 31,97 0,00 34 271 11 - - 3,42E + 04 34,1 0,00 35 275 8 - - 2,74E + 04 24,47 0,00 36 276 8 - - 5,28E + 04 24,74 0,00 37 280 8,2 - - 1,88E + 03 29,95 0,00 38 295 8 - - 5,21E + 04 30,99 0,00 39 300 8,3 - - 7,93E + 04 33,29 0,00 40 309 9 - - 1,38E + 04 28,71 0,00 41 310 11,2 - - 1,90E + 04 28,79 0,00 42 311 12 - - 1,40E + 04 27,75 0,00 Tất cả 40 mẫu nghiên cứu gen GAPDH đều xuất hiện các tín hiệu với số bản copy của gen GAPDH này/1 ml từ 4,63E + 02 đến 7,99E + 05/1 ml huyết tương. Gen SRY xuất hiện tín hiệu ở các mẫu dương tính và số bản copy của gen SRY dao động từ 1,48 - 2,97E + 03/1 ml huyết tương. Các mẫu không xuất hiện tín hiệu của gen SRY là thai mang nhiễm sắc thể giới tính XX, nồng độ ADN gen GAPDH huyết tương của những mẫu này dao động từ 1,88E + 03 đến 8,13E + 04 bản copy/1 ml huyết tương. Đối với 2 mẫu nội chứng âm, tín hiệu gen SRY không xuất hiện và tín hiệu gen GAPDH của mẫu nội chứng âm 1 là 1,33E + 04, nội chứng âm 2 là 1,40E + 04 bản copy/ml. KẾT LUẬN 2. Bianchi DW, Shuber AP, DeMaria MA, Đã phát hiện và định lượng được nồng Fougner AC, Klinger KW. Fetal cells in maternal độ ADN tự do của thai nhi lưu hành trong blood: determination of purity DNA yield by huyết tương người mẹ bằng phương pháp quantitative PCR. Am J Obstet Gynecol. 1994, realtime - PCR. Nghiên cứu này mở ra 171, pp.922-926. hướng chẩn đoán dị tật trước sinh và các 3. Bianchi DW, Williams JM, Sullivan LM, bệnh di truyền trước sinh bằng biện pháp Hanson FW, Klinger KW, Shuber AP. PCR quantitation of fetal cells in maternal blood in không can thiệp. normal DNA aneuploid pregnancies. Am J TÀI LIỆU THAM KHẢO Hum Genet. 1997, 61, pp.822-829. 4. Bianchi DW, Zickwolf GK, Weil GJ, 1. Bianchi DW, Flint AF, Pizzimenti MF, Sylvester S, DeMaria MA. Male fetal progenitor Knoll JH, Latt SA. Isolation of fetal DNA from cells persist in maternal blood for as long as nucleated erythrocytes in maternal blood. Proc 27 years postpartum. Proc Natl Acad Sci. USA. Natl Acad Sci USA. 1990, 87, pp.3279-3283. 1996, 93, pp.705-708. 50
7. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2014 5. BolADN CR. Setting microsatellites free. 8. Hamada H, Arinami T, Kubo T, Nat Med 2: 972-974 Camaschella C, Alfarano A, Hamaguchi H, Iwasaki H. Fetal nucleated Gottardi E, Travi M, Primignani P, Caligaris CF, cells in maternal peripheral blood: frequency Saglio G (1990) Prenatal diagnosis of fetal DNA relationship to gestational age. Hum hemoglobin Lepore-Boston disease on maternal Genet. 1993, 91, pp.427-432. peripheral blood. Blood. 1996, 75, pp.2102-2106. 9. Heid CA, Stevens J, Livak KJ, Williams 6. Chen XQ, Stroun M, Magnenat J-L, PM. Realtime quantitative PCR. Genome Res. Nicod LP, Kurt A-M, Lyautey J, Lederrey C et al. 1996, 6, pp.986-994. Microsatellite alterations in plasma DNA of small cell lung cancer patients. Nat Med. 10. HollADN PM, Abramson RD, Watson R, 1996, 2, pp.1033-1035. GelfADN DH. Detection of specific polymerase 7. Cheung MC, Goldberg JD, Kan YW. chain reaction product by utilizing the 5_–3_ Prenatal diagnosis of sickle cell anemia DNA exonuclease activity of the Thermus aquaticus thalassemia by analysis of fetal cells in maternal DNA polymerase. Proc Natl Acad Sci USA. blood. Nat Genet. 1996, 14, pp.264-268. 1991, 88, pp.7276-7280. 51
8. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2014 52