Phát hiện gen blatem và blactx - m ở các chủng E. coli và klebsiella pneumoniae bằng phản ứng multiplex - pcr

Nội dung text: Phát hiện gen blatem và blactx - m ở các chủng E. coli và klebsiella pneumoniae bằng phản ứng multiplex - pcr

1. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 PHÁT HIỆN GEN blaTEM VÀ blaCTX-M Ở CÁC CHỦNG E. COLI VÀ KLEBSIELLA PNEUMONIAE BẰNG PHẢN ỨNG MULTIPLEX-PCR Nguyễn Đắc Trung* TÓM TẮT Nghiên cứu được tiến hành với 43 chủng E. coli và 24 chủng Klebsiella pneumoniae phân lập tại Bệnh viện Đa khoa TW Thái Nguyên và Bệnh viện Trường Đại học Y Dược Thái Nguyên từ tháng 4 - 2012 đến 4 - 2013. Sàng lọc các chủng vi khuẩn (VK) có khả năng sinh beta-lactamase phổ rộng (ESBLs, extended- spectrum beta-lactamases) bằng kỹ thuật khoanh giấy đôi (double-disk test). Khuếch đại các gen ESBL blaTEM và blaCTM-M bằng phản ứng PCR đơn mồi và multiplex-PCR. Kết quả cho thấy 17 chủng E. coli (39,53%) và 8 chủng K. pneumoniae (33,33%) sinh ESBL, trong đó 9 chủng E. coli và 2 chủng K. pneumoniae chỉ mang gen blaTEM (970 bp). Gen blaCTM-M (540 bp) được tìm thấy ở 4 chủng E. coli và 5 chủng K. pneumoniae. Đặc biệt, có 2 chủng E. coli mang đồng thời cả gen blaTEM và blaCTM-M, 2 chủng E. coli và 1 chủng K. pneumoniae không tìm thấy bất kỳ gen bla nào kể trên. * Từ khóa: Beta-lactamase phổ rộng; BlaTEM; BlaCTM-M; E. coli; Klebsiella pneumoniae; Multiplex-PCR. DETECTION OF blaTEM AND blaCTX-M GENES IN E. COLI AND KLEBSIELLA PNEUMONIAE ISOLATES BY MULTIPLEX-PCR SUMMARY In the study, 43 isolates of E. coli and 24 isolates of Klebsiella pneumoniae isolated at Thainguyen Central General Hospital and Thainguyen Hospital of University of Medicine and Pharmacy from 4 - 2012 to 4 - 2013 were screened for ESBL production by double-disk test. The amplification for ESBL genes of blaTEM and blaCTX-M was also undertaken by single PCR and multiplex-PCR. The findings indicated ESBL was found in 17 of 43 isolates of E. coli (39.53%) and 8 of 24 isolates of K. pneumoniae (33.33%). With ESBL-producing isolates, gene blaTEM (970 bp) was harbored by 9 of 17 isolates of E. coli and 2 of 8 isolates of K. pneumoniae, 4 of 17 isolates of E. coli and 5 of 8 isolates of K. pneumoniae possesed gene blaCTM-M (540 bp). Especially, there were 2 isolates of E. coli carrying both gene blaTEM and blaCTM-M. In fact, no targeted gene bla was detected in 2 isolates of E. coli and 1 isolate of K. pneumoniae. * Key words: Extended-spectrum beta-lactamases; BlaTEM; BlaCTM-M; E. coli; Klebsiella pneumoniae; Multiplex-PCR. * Đại học Y Dược Thái Nguyên Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Đắc Trung (dactrung69@gmail.com) Ngày nhận bài: 27/9/2013; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 27/10/2013 Ngày bài báo được đăng: 8/11/2013 76
2. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 ĐẶT VẤN ĐỀ thức được vai trò của ESBLs và chưa có biện pháp để phát hiện. Sự Trong nhiều thập kỷ qua, áp lực thiếu hiểu biết hoặc thiếu nguồn lực chọn lọc của kháng sinh luôn được để kiểm soát cơ chế đề kháng này duy trì lên VK gây bệnh do kháng lan truyền sẽ dẫn đến thất bại liên sinh không được sử dụng hợp lý tiếp trong việc tìm phương cách trong điều trị lâm sàng các bệnh thích hợp giúp ngăn chặn VK gây nhiễm khuẩn. Áp lực chọn lọc này bệnh sinh β-lactamase lan rộng [9]. làm xuất hiện các beta-lactamase Mục tiêu của nghiên cứu: Phát hiện khác nhau ở một số VK gây bệnh. 2 gen ESBL bla và bla ở các Các beta-lactamase phổ rộng TEM CTM-M chủng E. coli và Klebsiella (ESBLs, extended-spectrum beta- pneumoniae phân lập từ mẫu bệnh lactamases) là những beta- phẩm lâm sàng bằng kỹ thuật lactamase được tạo bởi VK Gram multiplex-PCR. âm, có khả năng thủy phân kháng sinh β-lactam có chứa một nhóm ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP oxyimino (cephalosporins thế hệ 3 và NGHIÊN CỨU aztreonam) nhưng lại bị ức chế bởi 1. Đối tƣợng nghiên cứu. các chất ức chế β-lactamase như axit clavulanic, sulbactam và tazobactam 43 chủng E. coli và 24 chủng Klebsiella pneumoniae được phân lập [2]. ESBLs thường được mã hóa bởi từ bệnh phẩm lâm sàng tại Bệnh viện các gen nằm trên plasmid và được Đa khoa TW Thái Nguyên và Bệnh tìm thấy ở E. coli, Klebsiella và các viện Đại học Y Dược Thái Nguyên VK Gram âm khác [6]. ESBLs phân từ 4 - 2012 đến 4 - 2013. thành 3 loại là TEM, SHV và CTX-M [1, 10]. Ở Việt Nam, việc phát hiện 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. chủng VK Gram âm sinh ESBLs mới Phân lập và định danh chủng VK chỉ dựa vào kết quả kỹ thuật khoanh trên hệ thống máy tự động Vitek 2 giấy đôi (double-disk test) và cũng compact 60. Sàng lọc khả năng sinh chưa phải là một xét nghiệm thường ESBLs ở các chủng VK bằng quy. Thất bại trong việc phát hiện phương pháp khoanh giấy đôi. Ở khả năng hình thành ESBLs bằng kỹ những chủng VK được sàng lọc có thuật kháng sinh khuếch tán đã kiểu hình ESBL dương tính, sử dụng được ghi nhận trên thế giới [7]. cặp mồi tham khảo để lần lượt phát Nhiều phòng xét nghiệm không ý hiện các gen ESBL đặc hiệu tương 77
3. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 ứng là blaTEM [4] và blaCTX-M [8] bằng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ phản ứng PCR đơn mồi và phát hiện BÀN LUẬN đồng thời gen này bằng phản ứng 1. Kết quả phát hiện VK E. coli multiplex-PCR. ADN khuôn cho và K. pneumoniae sinh ESBL phản ứng PCR được tách chiết trực bằng xét nghiệm sàng lọc. tiếp từ khuẩn lạc VK theo phương Sau khi có kết quả kháng sinh đồ pháp của Cebula và CS [5]. Sử dụng với chủng E. coli và K. pneumoniae, mồi cho phản ứng PCR đơn mồi và những chủng nghi ngờ sinh ESBL multiplex-PCR bao gồm: (có đường kính vòng vô khuẩn xung blaTEM-F: 5’-TCGGGGAAATGTGCGCG- quanh các khoanh giấy kháng sinh: 3’, cefotaxime ≤ 27 mm, ceftriaxone blaTEM-R: 5’-TGCTTAATCAGTGAGGCACC- ≤ 25 mm và ceftazidime ≤ 22 mm) 3’, đều được kiểm tra khả năng sinh blaCTX-M-F: 5’-ATGTGCAGYACCAGT ESBL (kiểu hình ESBL (+)) bằng AARGT-3’, phương pháp khoanh giấy đôi. Kết blaCTX-M-R: 5’- quả cho thấy: 17/43 (39,53%) chủng TGGGTRAARTARGTSA CCAGA-3’. E. coli và 8/24 (33,33%) chủng K. Hỗn hợp (Hãng Thermo Scientific) pneumoniae có kiểu hình ESBL (+). cho một phản ứng multiplex-PCR Thực tế từ một số kết quả nghiên gồm: 200 µM của mỗi loại dNTP; 2,5 cứu thực hiện tại Việt Nam cũng như mM MgCI2; 0,2 pmol của mỗi loại trên thế giới gần đây cho thấy khả ADN mồi; 1 U Taq ADN polymerase năng sinh ESBL ở hai loại VK này và 1x đệm PCR (20 mM Tris-HCI, luôn khác nhau [3, 4, 7]. pH 8,4, 50 mM KCI), bổ sung nước khử ion tới thể tích 25 µl. Phản ứng * Kết quả khuếch đại gen blaTEM PCR thực hiện trên hệ thống luân bằng phản ứng PCR đơn mồi: theo nhiệt với chu trình nhiệt: 7 phút tính toán lý thuyết, với việc sử dụng biến tính ở 940C, 30 chu kỳ (940C/ 50 cặp mồi blaTEM trong phản ứng PCR, giây - 500C/40 giây - 720C/1 phút), chu một đoạn băng ADN có kích thước kỳ tổng hợp cuối cùng ở 720C/10 970 bp sẽ được khuếch đại, những phút. Kiểm tra hiệu quả quá trình chủng không có gen trong genome khuếch đại và kích thước sản phẩm sẽ cho kết quả âm tính. PCR trên gel agarose 1% và nhuộm bằng ethidium bromide. 78
4. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 mang một trong 2 gen còn lại là blaCTX-M và blaSHV? Kết quả phản ứng PCR với cặp mồi blaTEM cho thấy: có 9 chủng VK E.coli ESBL (+) và 2 chủng K. pneumoniae ESBL (+) mang gen blaTEM. * Kết quả khuếch đại gen blaCTX- M bằng phản ứng PCR đơn mồi: với các chủng VK có kiểu hình ESBL (+), ngoài phát hiện gen blaTEM, phản Hình 1: Kết quả khuếch đại gen ứng PCR đơn mồi được sử dụng để blaTEM bằng PCR đơn mồi. TM M. Marker GeneRuler 1kb; 1. khuếch đại gen blaCTX-M. Sử dụng A25; 2. C15; 3. B5; 4. C5; cặp mồi tương ứng cho gen blaCTX-M 5. C10; 6. C12; 7. C27; 8. Chứng và tính toán lý thuyết, phản ứng âm. PCR có thể tạo sản phẩm là một Phân tích kết quả điện di hình 1 băng ADN đặc hiệu có kích thước cho thấy phân đoạn ADN được khoảng 540 bp. khuếch đại có kích thước khoảng 970 bp, hoàn toàn phù hợp với tính toán lý thuyết. Trên các đường chạy số 1, 3 - 7 tương ứng với chủng A25, B5, C5, C10, C12 và C27 đều thấy xuất hiện một băng ADN có kích thước khoảng 970 bp. Như vậy, những chủng này đều cho kết quả dương tính với gen blaTEM. Riêng chủng C15 không thấy xuất hiện băng ADN tương tự (âm tính với Hình 2: Kết quả khuếch đại gen gene blaTEM). Có thể chủng VK này blaCTX-M bằng PCR đơn mồi. 79
5. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 1.A25; 2. B5; 3. C12; 4.C15; 5. Kết quả khuếch đại 2 gen đích C17; 6. C18; 7. C20; 8. Chứng âm; bằng phản ứng PCR với từng cặp TM 9.C19; M. Marker GeneRuler 1kb mồi đơn trong nghiên cứu này cho thấy có 3 chủng VK là A22, A28 và Kết quả điện di hình 2 cho thấy C20 cho kết quả âm tính với cả 2 phân đoạn ADN được khuếch đại gen, mặc dù chúng đều có kiểu hình với cặp mồi bla có kích thước CTX-M ESBL (+). Có thể gen mã hóa cho khoảng 540 bp, hoàn toàn phù hợp ESBL ở 3 chủng VK này thuộc nhóm với lý thuyết tính toán. Trên đường gen khác với 2 gen cần tìm. Trong chạy số 1, 3 - 6 và 9 tương ứng các khuôn khổ nghiên cứu này, chúng tôi chủng VK A25, C12, C15, C17, C18 chưa có điều kiện tìm hiểu thêm và C19 đều cho kết quả dương tính những gen này. Trên thực tế, với số lượng kiểu gen ESBL phong phú (do với gen blaCTX-M (xuất hiện 1 băng ADN có kích thước khoảng 540 bp). đột biến của gen ESBL được tìm thấy đầu tiên), việc chỉ sử dụng một Riêng chủng B5 và C20 không xuất số cặp mồi để phát hiện gen đích hiện băng ADN nào ở vị trí tương tự ESBL có thể bỏ sót và không tìm thấy của các chủng cho kết quả dương gen ở những chủng VK sinh ESBL. tính với gen đích cần phát hiện. Có Hiện tượng không tìm thấy gen ESBL thể, ESBL ở các chủng VK này do ở một chủng K. pneumoniae và 2 gen còn lại là blaSHV mã hóa? Với chủng E. coli kháng cephalosporin việc sử dụng cặp mồi blaCTX-M, kết phổ rộng cũng đã được đề cập tới quả phản ứng PCR cho thấy: có 4 trong nghiên cứu của Van Cao và chủng VK E. coli ESBL (+) và 5 CS thực hiện tại Việt Nam (2001) [4]. chủng K. pneumoniae ESBL (+) Kết quả này cho thấy cần nghiên cứu bổ sung các ESBL mới ở mang gen blaCTX-M. những chủng VK này. Cũng từ kết Kết quả từ phản ứng PCR với hai quả phản ứng PCR đơn mồi trong cặp mồi riêng rẽ blaTEM và blaCTX-M nghiên cứu của chúng tôi, 2 chủng còn cho thấy có 2 chủng E. coli VK E.coli ESBL (+) mang đồng thời ESBL(+) mang đồng thời cả hai gen cả hai gen ESBL là blaTEM và blaCTX- blaTEM và blaCTX-M. M. Hiện tượng một chủng VK Gram âm cùng một lúc mang hai hoặc nhiều loại gen ESBL khác nhau đã 80
6. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 được nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam, ví dụ như sự kết hợp của blaTEM + blaSHV, blaCTX-M + blaSHV [1, 5, 7], blaTEM + blaCTX-M [5, 7], blaTEM + blaCTX-M + blaSHV [5, 7]. Việc một chủng VK gây bệnh cùng một lúc sở hữu nhiều gen ESBL khác nhau sẽ giúp tăng khả năng đề kháng kháng sinh β-lactam, đặc biệt với những kháng sinh có phổ tác dụng rộng thuộc nhóm này. Hiện tượng này cũng cho thấy dưới áp lực chọn lọc Hình 3: Kết quả khuếch đại gen của kháng sinh ngày một gia tăng, bla và bla bằng multiplex- VK gây bệnh đang dần hình thành TEM CTX-M PCR. những cơ chế đề kháng phức tạp, M. Marker GeneRulerTM 1kb; 1. phối hợp nhiều cách thức đề kháng Chứng âm; 2. B5 (blaTEM); 3. B5 khác nhau để làm giảm hoặc mất (blaCTX-M); 4. B5 (multiplex-PCR hiệu lực tác động của kháng sinh lên blaTEM và blaCTX-M); 5. A25 ( chính chúng. blaTEM); 6. A25 (blaCTX-M); 7. A25 (multiplex-PCR blaTEM và blaCTX-M); 8. C15 2. Kết quả khuếch đại gen ESBL (blaTEM); 9. C15 (blaCTX-M); 10. C15 bằng kỹ thuật multiplex-PCR. (multiplex-PCR blaTEM và blaCTX-M); Bằng các phản ứng PCR đơn Kết quả điện di từ hình 3 cho thấy: mồi, sử dụng 2 cặp mồi riêng rẽ với tất cả các chủng E. coli và K. - Chủng B5: ở đường chạy số 2 pneumoniae sinh ESBL, đã phát (PCR với blaTEM) và đường chạy số 4 (multiplex-PCR) đều xuất hiện 1 hiện 2 gen là blaTEM và blaCTX-M. Phản ứng multiplex-PCR thực hiện băng ADN có kích thước khoảng bằng hai cặp mồi đã cho kết quả 970 bp; đường chạy số 3 (PCR với blaCTX-M) không xuất hiện băng ADN. PCR (+) là blaTEM và blaCTX-M để Kết luận: chủng B5 chỉ mang gen khuếch đại đồng thời hai gen ESBL bla . tương ứng. TEM - Chủng A25: ở đường chạy số 5 (PCR với blaTEM) và đường chạy số 7 (multiplex-PCR) đều xuất hiện 1 81
7. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 băng ADN có kích thước khoảng SỐ CHỦNG VK MANG GEN 970 bp; đường chạy số 6 (PCR với VK (số chủng) blaTEM blaCTX-M blaTEM+CT Âm tính blaCTX-M) và đường chạy số 7 X (multiplex-PCR) đều xuất hiện 1 E. coli (17) 9 4 2 2 băng ADN có kích thước khoảng K. 2 5 0 1 540 bp. Kết luận: chủng A25 mang pneumoniae (8) cả gen blaTEM và blaCTX-M. 11 9 2 3 Tổng số (25) (44,0% (36,0% (8,0%) (12,0% - Chủng C15: ở đường chạy số 9 ) ) ) Bằng phản ứng PCR đơn mồi và (PCR với blaCTX-M) và đường chạy số 10 (multiplex-PCR) đều xuất hiện 1 multiplex-PCR khuếch đại 2 gen ESBL, kết quả cho thấy gen bla băng ADN có kích thước khoảng TEM và bla được tìm thấy ở cả VK 540 bp; đường chạy số 8 (PCR với CTX-M E.coli và K.pneumoniae. Trong đó, blaTEM) không hề xuất hiện băng 44% số chủng ESBL (+) mang gen ADN nào. Kết luận: chủng B5 chỉ blaTEM và 36% mang gen blaCTX-M. mang gen blaCTX-M. Gen blaTEM chủ yếu được tìm thấy ở Các phản ứng multiplex-PCR với E. coli, trong khi đó, gen blaCTX-M lại tất cả chủng VK ESBL (+) trong thường được tìm thấy ở VK K. nghiên cứu này đều cho kết quả phù pneumoniae. Sự kết hợp 2 gen hợp với phản ứng PCR sử dụng blaTEM và blaCTX-M chỉ được tìm thấy từng cặp mồi đơn lẻ (blaTEM hoặc duy nhất ở 2 chủng E. coli. Cả 2 gen blaCTX-M). Như vậy, tuy cùng cho kết blaTEM và blaCTX-M không tìm thấy ở 2 quả giống nhau, nhưng có thể nhận chủng E.coli và 1 chủng K. thấy dòng phản ứng multiplex-PCR pneumoniae. để phát hiện gen bla có hiệu quả cao Trong nghiên cứu này, hiện tượng hơn so với phản ứng PCR đơn mồi, VK E. coli và K. pneumoniae mang tiết kiệm thời gian thực hiện phản chủ yếu một gen hoặc blaTEM hoặc ứng, tiết kiệm hóa chất và vật tư tiêu blaCTX-M tương ứng với kết quả của hao. Van Cao và CS tiến hành tại Việt Nam năm 2001 [4]. Trong nghiên cứu của mình, nhóm tác giả nhận Bảng 1: Kiểu gen ESBL bla được thấy không chỉ có hai gen blaTEM + tìm thấy ở các chủng VK. blaCTX-M kết hợp như trong nghiên 82
8. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 cứu của chúng tôi mà còn xuất hiện - Gen blaCTX-M (540 bp) được tìm một vài kiểu kết hợp gen khác trong thấy ở 4/17 chủng E. coli ESBL (+) cùng một chủng VK như blaTEM + và ở 5/8 chủng Klebsiella blaSHV, blaCTX-M + blaSHV và blaTEM + pneumoniae ESBL (+). blaCTX-M + blaSHV. Ngoài các gen - Có 2 chủng E. coli ESBL (+) blaTEM, blaCTX-M và blaSHV, nhóm mang cả gen blaTEM và blaCTX-M. nghiên cứu còn tìm thấy gen bla VEB - Có 2 chủng E. coli ESBL (+) và 1 ở các chủng VK nghiên cứu. Tuy chủng Klebsiella pneumoniae ESBL nhiên, có 1 chủng K. pneumoniae và (+) không tìm thấy gen bla đích nào. 2 chủng E. coli sinh ESBL không tìm thấy gen bla nào tương tự như kết TÀI LIỆU THAM KHẢO quả của chúng tôi. Điều này có thể do chủng VK này mang gen ESBL, 1. Bonnet R. Growing group of nhưng không nằm trong kiểu gen extended- spectrum β-lactamases: the đích mà tác giả nhằm tới. Đây là một CTX-M enzymes. Antimicrob Agents hướng nghiên cứu cần được bổ Chemother. 2004, 48, pp.1-14. 2. Bradford PA. Extended-spectrum sung để có thể xây dựng bản đồ β-lactamases in the 21st century: dịch tễ học đầy đủ về sự phân bố characterization, epidemiology, and kiểu gen ESBL ở quần thể VK gây detection of this important resistance bệnh trong khu vực nghiên cứu. threat. Clin Microbiol Rev. 2001, 14, pp.933-951. KẾT LUẬN 3. Canton R, Novais A, Valverde A, Nghiên cứu tiến hành trên 43 Machado E, Peixe L, Baquero F, et al. chủng E.coli và 24 chủng Klebsiella Prevalence and spread of extended- pneumoniae bằng phản ứng spectrum beta-lactamase- producing multiplex-PCR, chúng tôi thu được Enterobacteriaceae in Europe. Clin kết quả sau: Microbiol Infect. 2008, 14 (1), pp.144- - 17/43 (39,53%) chủng E. coli và 153. 8/24 (33,33%) chủng Klebsiella 4. Cao V, Lambert T, Nhu DQ, et al. pneumoniae sinh ESBL. Distribution of extended-spectrum β- lactamases in clinical isolates of - Gen blaTEM (970 bp) được tìm Enterobacteriaceae in Vietnam. thấy ở 9/17 chủng E. coli ESBL (+) Antimicrobial agents and chemotherary. và ở 2/8 chủng Klebsiella 2002, 46 (12), pp.3739-3743. pneumoniae ESBL (+). 83
9. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 5. Cebula TA, Payne WL and Fegn 8. Jemima SA, Verghese S. Multiplex P. Simultaneous identification of strains PCR for blaCTX-M and blaSHV in the of Escherichia coli serotype O157:H7 and extended spectrum beta lactamase their Shiga-like toxin type by mismatch (ESBL) producing Gram-negative amplification mutation assay multiplex-PCR. isolates. Indian J Med Res. 2008, 128, J Clin Microbiol. 1995, 33 (1), pp.248-250. pp.313-317. 6. Emery CL, Weymouth LA. 9. Paterson DL,Yu VL. Extended Detection and clinical significance of spectrum beta-lactamases: a call for extended- spectrum β-lactamases in a improved detection and control. Clin Infect tertiary-care medical center. J Clin Dis. 1999, 29, pp.1419-1422. Microbiol. 1997, 35, pp.2061-2067. 10. Pitout JD, Wei Y, Church DL, 7. Jacob S, Shiri NV, Inna C, Orly Gregson DB. Surveillance for HM, Azita L, Howard SG et al. Extended- plasmidmediated quinolone resistance spectrum beta-lactamases among determinants in Enterobacteriaceae Enterobacter isolates obtained in Tel Aviv, within the Calgary Health Region, Israel. Antimicrobial Agents and Canada: the emergence of aac(6)-Ib-cr. Chemotherapy. 2005, 49 (3), pp.1150- J Antimicrob Chemother. 2008, 61. 1156. pp.999-1002. 84
10. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 85