Phân tích tổng thể sắc đồ và phân loại kim ngân bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

Nội dung text: Phân tích tổng thể sắc đồ và phân loại kim ngân bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

1. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2013 PHÂN TÍCH TỔNG THỂ SẮC ĐỒ VÀ PHÂN LOẠI KIM NGÂN BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Chử Văn Mến*; Nguyễn Văn Long*; Vũ Tuấn Anh*; Phạm Xuân Phong** TÓM TẮT Kim ngân là một dƣợc liệu đƣợc sử dụng trong cổ truyền. Tác dụng điều trị của dƣợc liệu này phụ thuộc nhiều vào nguồn gốc phân bố. Trong nghiên cứu trƣớc của chúng tôi, phƣơng pháp phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao đƣợc sử dụng để định lƣợng đồng thời 4 hoạt chất sinh học là coniferin, axít loganic, sweroside và loganin. Trong nghiên cứu này, phƣơng pháp phân tích đƣợc áp dụng định lƣợng 4 hoạt chất sinh học trong 92 mẫu từ Hàn Quốc và Trung Quốc cùng với phân tích tổng thể sắc đồ nhằm phân biệt dƣợc liệu từ những nguồn khác nhau. Hàm lƣợng của coniferin, loganic axít, sweroside và loganin đƣợc xác định là 0,032 - 1,206 mg/g, 0,033 - 20,425 mg/g, 0,017 - 10,09 mg/g và 0,018 - 10,255 mg/g trong dƣợc liệu khô. Phân tích tổng thể sắc đồ dựa vào LDA cho thấy Kim ngân từ các vùng khác nhau có thể đƣợc phân biệt chính xác tới 80%. * Từ khóa: Kim ngân; HPLC; LDA; Phân tích sắc đồ. CHROMATOGRAPHIC FINGERPRINT AND DISCRIMINANT ANALYSIS FOR THE QUALITY EVALUATION OF LONICERAE FOLIUM ET CAULIS BY HPLC summary Lonicerae folium et caulis is an important traditional herbal drug. The therapeutic effectiveness of this herb depends strongly on the geographical origin. In our previous report, the HPLC analytical method has been developed for the simultaneous determination of four bioactive compounds: coniferin, loganic acid, sweroside and loganin. In this study, the analytical method was applied to quantitate four bioactive compounds in 92 samples collected from Korea and China together with pattern recognition analysis to differentiate the herbs from different regions. Contents of coniferin, loganic acid, sweroside and loganin were calculated to be 0.032 - 1.206 mg/g, 0.033 - 20.425 mg/g, 0.017 - 10.09 mg/g, and 0.018 - 10.255 mg/g in dried plant. The pattern recognition analysis was carried out using LDA (Linear Discriminant Analysis) showed Lonicerae folium et caulis from different origins can be differentiated with the accuracy of 80%. * Key words: Lonicerae folium et caulis; HPLC; LDA; Pattern analysis. ĐẶT VẤN ĐỀ các nƣớc Đông Á nhƣ Việt Nam, Trung Quốc, Hàn Quốc và Nhật Bản... đƣợc sử dụng để Kim ngân, còn gọi là Nhẫn đông có tên chống viêm, chống dị ứng, mẩn ngứa trong khoa học là Lonicera japonica thuộc họ y học cổ truyền [1]. Nghiên cứu về thành Cơm cháy (Caprifoliaceae), mọc chủ yếu ở phần hóa học và tác dụng sinh học của cây * Học viện Quân y ** Viện Y học Cổ truyềnQuân đội Người phản hồi (Corresponding): Chử Văn Mến (chuvanmen@gmail.com) Ngày nhận bài: 15/8/2013; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 23/8/2013 Ngày bài báo được đăng: 25/9/2013 5
2. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2013 Kim ngân cho thấy: các nhóm hoạt chất trƣớc, phƣơng pháp định lƣợng đồng thời nhƣ phenolic, iridoids, saponin và flavonoids 4 hoạt chất sinh học: coniferin, axít loganic, có tác dụng chống oxy hóa, chống viêm, sweroside và loganin (hình 1) trong dƣợc chống dị ứng... [4, 10]. Tuy nhiên, do ảnh liệu Kim ngân đã đƣợc tiến hành trên 92 hƣởng của khí hậu, thổ nhƣỡng và thời mẫu thu mua tại các nơi khác nhau của gian thu hái nên hàm lƣợng các hoạt chất Trung Quốc và Hàn Quốc có tính chọn lọc và tác dụng sinh học của Kim ngân bị biến và chính xác cao [2, 3]. Trong nghiên cứu động nhiều. Ở Việt Nam, Kim ngân chủ yếu này, phƣơng pháp định lƣợng đồng thời đƣợc nhập khẩu từ các nƣớc Đông Á nhƣ các hoạt chất sinh học trong dƣợc liệu Kim Trung Quốc, một số ít từ Hàn Quốc và Nhật ngân đƣợc áp dụng cho số lƣợng mẫu lớn Bản. Vì vậy, đánh giá chất lƣợng toàn diện cùng với phân tích tổng thể sắc đồ và nguyên liệu kim ngân đƣợc thu mua ở phân tích phân loại nguồn dƣợc liệu Kim những nơi khác nhau là cần thiết, góp phần ngân để đánh giá chất lƣợng tổng thể của đảm bảo chất lƣợng thuốc. Trong nghiên cứu dƣợc liệu này. OH OH COOR1 H O HO O HO OH R2 OH OH O O H HO O Coniferin (1) HO OH O R1 R2 OH O O Loganic acid (2) H OH O Loganin (4) CH3 CH3 HO O HO H OH Sweroside (3) Hình 1: Cấu trúc của chất đánh dấu trong phân tích định lƣợng Kim ngân. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2. Mẫu nghiên cứu. NGHIÊN CỨU Mẫu Kim ngân thu mua ở các nơi khác 1. Hoá chất và thiết bị. nhau tại Trung Quốc, Hàn Quốc, mẫu đƣợc - Hoá chất: nội chuẩn: methyl paraben; lƣu tại Đại học Dƣợc, Đại học Quốc gia chuẩn coniferin, axít loganic, sweroside và Chung Nam, Hàn Quốc. loganin đƣợc chiết xuất, phân tách, tinh chế 3. Điều kiện sắc ký. và xác định cấu trúc; methanol, nƣớc cất, Cột: cột phân tích pha đảo Optimapak axít formic đạt tiêu chuẩn cho sắc ký lỏng. RP18 (250 x 4,6 mm; 5 μm) của công ty RS - Thiết bị: máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Tech, Hàn Quốc; bƣớc sóng phát hiện Shimadzu, Detector UV-VIS và Detector 254 nm; pha động: dung môi A: dung dịch diode array đƣợc nối với máy tính IBM. methanol 10% trong dung dịch axít formic 6
3. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2013 0,1%; dung môi B: dung dịch methanol 90% 4. Chuẩn bị dung dịch chuẩn và thử. trong dung dịch axít formic 0,1%; tốc độ - Nội chuẩn: dung dịch methyl paraben: dòng: 1,0 ml/phút; thể tích tiêm 10 μl. 1.000 µg/ml trong methanol. Chƣơng trình rửa giải nhƣ sau: - Mẫu chuẩn: pha các dung dịch chuẩn coniferin, axít loganic, sweroside và loganin Thời gian (phút) Tỷ lệ (%) A Tỷ lệ (%) B có nồng độ chính xác 5,0; 10,0; 25,0; 50,0; 0 15 100 70 0 30 100,0 và 200,0 µg/ml trong dung dịch chuẩn nội methyl paraben 200 (µg/ml) trong methanol. 15 25 70 30 30 70 - Mẫu thử: cân chính xác 1 g bột dƣợc liệu Kim ngân. Thêm chính xác 9 ml ethanol 25 30 30 70 70% và 1 ml dung dịch chuẩn nội, cân, lắc 30 35 30 0 70 100 siêu âm 30 phút. Cân lại, bổ sung khối lƣợng mất bằng ethanol 70%, ly tâm, gạn 35 45 0 0 100 100 lấy lớp trên, lọc qua màng lọc 0,45 μm. Tiến hành tiêm 10 µl dung dịch chuẩn và thử vào 45 50 0 100 100 0 hệ thống sắc ký. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Hình 2: Sắc ký đồ và so sánh phổ của mẫu chuẩn (a) và mẫu thử (b); (1): coniferin; (2): axít loganic; (3): sweroside; (4): loganin; (IS): methyl paraben. Với điều kiện sắc ký và phƣơng pháp xử thời gian lƣu của pic coniferin, axít loganic, lý mẫu đã lựa chọn, sắc ký đồ thu đƣợc cho sweroside và loganin trong sắc ký đồ của các pic tách rõ ràng, nhiễu nền thấp, thể mẫu chuẩn lần lƣợt là 12,61, 15,34; 19,55; hiện qua sắc ký đồ của mẫu thử dƣợc liệu 20,21 phút (hình 2a). Kim ngân (hình 2b). Trên các sắc ký đồ Đồng thời, tại thời gian lƣu của pic mẫu thử, các pic có thời gian lƣu trùng với coniferin, axít loganic, sweroside và loganin 7
4. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2013 trên sắc ký đồ mẫu thử và chuẩn, chúng tôi lựa chọn. Qua đó cho phép tiến hành định so sánh phổ hấp thụ UV thu đƣợc của pic. tính, định lƣợng các chất có trong Kim ngân Kết quả cho thấy phổ thử và chuẩn trùng ở những điều kiện sắc ký đã chọn. khít lên nhau với hệ số match lần lƣợt là 1. Khoảng tuyến tính, giới hạn phát 0,9995; 0,9994; 0,9996 và 0,9938. Điều này hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ). chứng tỏ pic thu đƣợc trên sắc ký đồ của mẫu thử là tinh khiết và các thành phần Mỗi chất chuẩn bị một dãy dung dịch có khác có trong mẫu thử không ảnh hƣởng nồng độ từ 5,0; 10,0; 25,0; 50,0; 100,0 và đến quá trình phân tích coniferin, axít loganic, 200,0 µg/ml, tiến hành sắc ký nhƣ điều kiện sweroside và loganin ở điều kiện sắc ký đã đã mô tả. Hình 3: Đƣờng chuẩn của các chất định lƣợng Bảng 1: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính, giới hiện phát hiện, giới hạn định lƣợng. LOD LOQ CHẤT CHUẨN NỒNG ĐỘ (㎍/ml) PHƢƠNG TRÌNH HỒI QUY r (g/ml) (g/ml) Coniferin (1) 5 ～ 200 Y = 17,01X＋1,45 1,00 0,71 2,13 xÝt loganic (2) 5 ～ 200 Y = 2,58X – 0,66 0,99 0,44 1.32 Sweroside (3) 5 ～ 200 Y = 7,23X＋0,01 1,00 0,70 2,10 Loganin (4) 5 ～ 200 Y = 2,88X – 0,18 1,00 1,10 3,30 Kết quả khảo sát trên cho thấy: trong 2. Độ đúng, độ lặp lại của phƣơng khoảng nồng độ của coniferin, axít loganic, pháp. sweroside và loganin từ 5 - 200 μg/ml, có Độ đúng và độ lặp lại của phƣơng pháp tƣơng quan tuyến tính giữa nồng độ và diện đƣợc tiến hành trên các mẫu chuẩn đã biết tích pic tƣơng ứng. trƣớc nồng độ. Độ đúng và độ lặp lại trong Phƣơng trình tuyến tính của các chất ngày đƣợc tiến hành bằng cách phân tích coniferin, axít loganic, sweroside và loganin cho phép xác định giới hạn phát hiện lần lƣợt mẫu chuẩn 5 lần trong một ngày; độ đúng 0,557; 0,327; 0,657 và 1,098 µg/ml, giới hạn và độ lặp lại giữa các ngày đƣợc tiến hành định của từng chất tƣơng ứng với từng chất bằng cách phân tích mẫu chuẩn trong lần lƣợt 1,687; 0,990; 1,990 và 3,327 µg/ml. 5 ngày liên tiếp. 8
5. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2013 Bảng 2: Kết quả xác định độ đúng và độ lặp lại của phƣơng pháp. NỒNG ĐỘ TRONG NGÀY (n = 5) GIỮA CÁC NGÀY (n = 5) CHẤT CHUẨN ( g/ml) Độ đúng (%) RSD (%) Độ đúng (%) RSD (%) 2 101,19 0,45 100,62 0,46 Coniferin 4 100,08 0,20 100,18 0,26 8 99,90 0,23 100,72 0,27 2 101,49 1,15 101,50 1,29 xít loganic 4 100,87 0,26 100,88 0,96 8 100,00 0,56 100,10 0,58 2 100,55 0,57 101,14 0,86 Sweroside 4 99,81 0,16 100,27 0,48 8 99,39 0,11 99,61 0,14 2 100,02 0,62 100,76 0,65 Loganin 4 99,64 0,45 100,15 0,67 8 101,11 0,74 100,13 0,78 Độ đúng trong khoảng từ 99,31 - 101,50% đối với độ đúng trong ngày và giữa các ngày. Kết quả cho thấy: RSD của phƣơng pháp thấp hơn 1,29% đối với độ lặp lại trong ngày và giữa các ngày. Kết quả chứng tỏ phƣơng pháp định lƣợng đồng thời các hoạt chất sinh học có độ chính xác và lặp lại cao. 3. Kết quả phân tích định lƣợng các hoạt chất trong mẫu dƣợc liệu Kim ngân. 9
6. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2013 Hình 4: Phân bố hàm lƣợng hoạt chất trong các mẫu Kim ngân, (a) coniferin, (b) axít loganic, (c) sweroside và (d) loganin. Kết quả khảo sát hàm lƣợng coniferin, nhằm phân biệt dƣợc liệu từ những nguồn axít loganic, sweroside và loganin có trong khác nhau. Hàm lƣợng coniferin, axít loganic, 92 mẫu Kim ngân đƣợc xác định là 0,032 - sweroside và loganin đƣợc xác định là 1,206 mg/g, 0,033 - 20.425 mg/g, 0,017 - 0,032 - 1,206 mg/g, 0,033 - 20,425 mg/g, 10,09 mg/g, và 0,018 - 10,255 mg/g trong 0,017 - 10,09 mg/g và 0,018 - 10,255 mg/g dƣợc liệu khô. trong dƣợc liệu khô. Phân tích tổng thể sắc độ dựa vào LDA cho thấy Kim ngân từ 4. Kết quả phân loại Kim ngân bằng những vùng khác nhau có thể phân biệt phân tích tổng thể sắc đồ. chính xác tới 80%. Nghiên cứu này một lần nữa khẳng định có sự ảnh hƣởng của các yếu tố ngoại cảnh, thổ nhƣỡng tới hàm lƣợng hoạt chất trong dƣợc liệu nói chung và Kim ngân nói riêng. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Đỗ Tất Lợi. Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. Nhà xuất bản Y học. 2004. 2. Chử Văn Mến, Nguyễn Văn Long, Nguyễn Tùng Linh, Hoàng Văn Lương, Kang Jong Seong. Định lƣợng đồng thời các hoạt chất sinh học trong dƣợc liệu Kim Ngân (Lonicera Hình 5: Kết quả phân tích phân loại dƣợc japonica) bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu liệu Kim ngân từ các nguồn khác nhau. năng cao. Tạp chí Y-Dƣợc học Quân sự, 2010, Kết quả phân tích tổng thể sắc đồ dựa số 7, tr.12-19. trên 11 pic chung bằng LDA (phân tích phân 3. Chu Van Men, Jang Yu Seon, Nguyen Van biệt tuyến tính-Linear discriminant analysis) Long, Lee Kwan Jun, Lee Sae Eun, Kim Young cho thấy: các mẫu Kim ngân từ những Ho, Bae Ki Hwan, Kang Jong Seong. Quality nguồn gốc khác nhau đƣợc phân biệt với evaluation of Lonicerae folium et caulis using multiple component analysis by high performance độ chính xác tới 80%. liquid chromatography. Proceeding of the Fall International Convention of The Pharmaceutical KẾT LUẬN Society of Korea. 2010, October 21, p.254. Từ các kết quả nghiên cứu, chúng tôi rút 4. Lee. E. J, Kim. J. S. Kim, H. P, Lee. J. H, ra kết luận sau: and Kang. S. S. Phenolic constituents from the Đã định lƣợng 4 hoạt chất trong 92 mẫu flower buds of Lonicera japonica and their 5- dƣợc liệu Kim ngân từ Hàn Quốc và Trung lipoxygenase inhibitory activities. Food Chem. 2010, 120 (1), pp.134-139. Quốc cùng với phân tích tổng thể sắc đồ 10
7. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2013 5. Kumar. N, Bhandari. P, Singh. B. and Kaul 8. Song. W, Li. S, Wang, S. Wu. Y, Zi. J, V. K. Saponins and volatile constituents from Gan. M, Zhang. Y, Liu. M, Lin. S, Yang. Y. and Lonicera japonica India. Nat Prod Commun. Shi. J. Pyridinium alkaloid-coupled secoiridoids 2007, 2 (6), pp.633-666. from the flower buds of Lonicera japonica. J Nat 6. Kumar. N, Singh. B, Gupta. A. P. and Prod. 2008, 71 (5), pp.922-925. Kaul. V. K. Lonijaposides, novel cerebrosides 9. Won. J. B, and Ma. C. J. Neuroprotective from Lonicera japonica. Tetrahedron. 2006, 62 activities of some medicinal plants against (18), pp.4317-4322. glutamate-induced neurotoxicity in primary 7. Pradhan. D, Panda. P. K, Tripathy. G, cultures of rat cortical cells. Nat Prod Sci. 2009, Nayak. J. R. and Pattanaik. A. Anticancer 15 (3), pp.125-129. activity of biflavonoids from Lonicera japonica 10. Yu. D. Q, Chen. R. Y, Huang. L. J, Xie. F. and Benincasa hispida on human cancer cell Z, Ming. D. S, Zhou. K, Li. H. Y. and Tong. K. M. lines. Int J Pharmacol Biol Sci. 2009, 3 (1), The structure and absolute configuration of pp.59-64. Shuangkangsu: a novel natural cyclic peroxide from Lonicera japonica (Thunb.). J Asian Nat Prod Res. 2008, 10 (9), pp.851-856. 11
8. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2013 12