Phân tích gen ftsz - Xác định vật chủ sản xuất hợp chất tự nhiên onnamide từ theonella swinhoei

Nội dung text: Phân tích gen ftsz - Xác định vật chủ sản xuất hợp chất tự nhiên onnamide từ theonella swinhoei

1. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2016 PHÂN TÍCH GEN ftsZ - XÁC ĐỊNH VẬT CHỦ SẢN XUẤT HỢP CHẤT TỰ NHIÊN ONNAMIDE TỪ THEONELLA SWINHOEI Nguyễn Tú Anh* TÓM TẮT Mục tiêu: xác định v t chủ sản xuất hợp chất tự nhiên onnamide từ Theonella swinhoei căn cứ trên kết quả phân tích gen ftsZ. Phương pháp: khuếch đại gen ftsZ từ ADN toàn phần của T. swinhoei bằng cặp mồi đặc hiệu, giải trình tự và phân tích bằng chương trình BLAST và BioEdit - ClustalW. Kết quả: phân tích trình tự nucleotid các ftsZ từ ADN toàn phần của T. swinhoei cho thấy có độ tương đồng từ 56 - 58% với gen ftsZ của loài Dehalococcoides ethenogenes thuộc ngành Chloroflexi. Trình tự các gen ftsZ phân l p được có độ tương đồng cao với nhau ( 96%), nhưng không giống nhau hoàn toàn. Kết luận: kết quả này đã đặt ra giả thuyết có nhi u biến thể gen ftsZ từ những chủng vi khuẩn (VK) cộng sinh khác nhau để giải thích hiện tượng tìm thấy nhi u hợp chất thuộc họ onnamide từ T. swinhoei. * Từ khóa: Theonella swinhoei; Onnamide; Gen ftsZ, Chloroflexi; Vi sinh v t cộng sinh. Determination of the Producer of Onnamides from the Theonella Swinhoei Based on the ftsZ Gene Summary Objectives: To determine the producer of onnamides from the Theonella swinhoei based on the ftsZ gene. Methods: Amplify the ftsZ gene from the metagenomic DNA of T. swinhoei using the specific primers. These PCR products were sent for sequencing and analyzed applying BLAST and BioEdit - ClustalW. Results: Nucleotide sequence analysis showed that the amplicons from the metagenomic DNA of T. swinhoei had the identity ranging from 56 to 58% with the ftsZ of Dehalococcoides ethenogenes, a member of the phylum Chloroflexi. These cloned FtsZ amplicons shared high but not complete identities ( 96%). Conclusion: These results demonstrate the existence of multiple closely related ftsZ variants inside the metagenomic DNA of T. swinhoei. This might explain the presence of closely related onnamide variants, which could belong to distinct, diversified strains. * Key words: Theonella swinhoei; Onnamide; ftsZ gene; Chloroflexi; Symbiontic bacteria. ĐẶT VẤN ĐỀ sản xuất những hợp chất này lại được Sinh v t biển, trong đó có Theonella cho là các VK cộng sinh với chúng. Giả swinhoei, là nguồn cung cấp phong phú thuyết cộng sinh được đ xuất do công các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh thức hóa học của các chất từ sinh v t học cao. Mặc dù v y, v t chủ th t sự biển và từ một số VK tương tự nhau [1, 2]. * Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Tú Anh (nguyentuanhvn@gmail.com) Ngày nhận bài: 01/02/2016; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 08/03/2016 Ngày bài báo được đăng: 21/03/2016 40
2. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2016 Do VK cộng sinh rất khó nuôi cấy trong khuẩn, kháng virut, đặc biệt có độc tính đi u kiện phòng thí nghiệm, nên kỹ thu t trên một số dòng tế bào ung thư ở ngưỡng sinh học phân tử phân tích hệ gen toàn picomolar [4]. Vì v y, để hiểu rõ con đường phần, bao gồm ADN của sinh v t biển và sinh tổng hợp onnamide trong tự nhiên, ADN của hệ VK cộng sinh được áp d ng. hệ gen toàn phần của T. swinhoei ~ 32 Gbp Một ví d điển hình, bằng kỹ thu t này, đã được chiết tách. Khi phân l p gen PKS- v t chủ sản xuất hợp chất polyketid pederin NRPS (polyketide synthetase - nonribosomal được xác định chính là VK Pseudomonas peptide synthetase) chịu trách nhiệm sinh sống cộng sinh với loài kiến ba khoang tổng hợp onnamide cũng đã bộc lộ được Paederus fulcipes [3]. gen không phải onn - gen ftsZ nằm li n k . Từ T. swinhoei, 22 loại onnamide thuộc Phân tích trình tự nucleotid của ftsZ nhóm hợp chất polyketide - nonribosomal giúp có nh n định v v t chủ sản xuất peptide (PK-NRP) họ pederin được tìm thấy onnamide cũng như sự đa dạng của (hình 1). Onnamide có hoạt tính kháng nhóm hợp chất onnamide từ T. swinhoei. Onnamide F Theopederin E Theopederin D Theopederin F Hình 1: Theonella swinhoei. Một số hợp chất nhóm onnamide từ 41
3. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2016 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP cùng 3’-T bằng cách bổ sung dTTP theo NGHIÊN CỨU phản ứng: 15 µl vector pBluescript SK II (-) * ADN toàn phần của T. swinhoei: đã cắt bằng EcoRV; 2 µl buffer 10 X ThermoPol; 0,5 µl dTTP 100 mM; 2 µl Taq T. swinhoei (đảo Hachijo-jima, Nh t Bản) polymerase; ủ ở 72oC trong 2 giờ. được dùng để chiết tách ADN toàn phần theo quy trình được Piel và CS mô tả [3]. Các sản phẩm ADN được tinh sạch * Khuếch đại gen ftsZ: sau khi chạy điện gi trên gel agarose và sử d ng bộ kít QIAquick Gel Extraction Dựa trên trình tự gen ftsZ phân l p Kit (Qiagen). được ~ 883 bp, thiết kế cặp mồi đặc hiệu gồm mồi xuôi 5’ CGC TGC GAC GTA Ghép nối sản phẩm PCR có đầu 3’-A CCC AAC C 3’ và mồi ngược 5’ CGT và vector 3’-T bằng enzym T4 ligase. Sau CAT CGG ACA TAG GCG TAA C 3’. đó đưa vào tế bào E. coli XL1 blue bằng Thành phần phản ứng PCR khuếch đại phương pháp thẩm điện. Chọn tế bào gen ftsZ gồm 2, 5 µl buffer 10 X ThermoPol; được biến nạp bằng sàng lọc khuẩn lạc 0,5 µl dNTPs 10 mM; 0,25 µl BSA 100 X; VK trắng/xanh. 0,25 µl mồi xuôi 50 µM; 0,25 µl mồi ngược * Chiết tách ftsZ từ E. coli: 50 µM; 0,125 µl Hot-start polymerase; 0,5 ftsZ từ tế bào E. coli biến nạp được µl ADN toàn phần; nước cất vừa đủ 25 µl. chiết tách và gửi giải trình tự tại Công ty Chương trình phản ứng PCR gồm 35 chu GATC Biotech (giải trình tự bằng máy o k : biến tính ADN ở 95 C/30 giây, bắt cặp giải trình tự tự động theo phương pháp o o mồi ở 62 C/60 giây, kéo dài ở 72 C/60 giây. Sanger). Để chuẩn bị tạo dòng sản phẩm PCR bằng kỹ thu t TA cloning, trong chương trình KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ PCR, giai đoạn kéo dài cuối cùng tiến hành BÀN LUẬN trong 10 phút. Nhờ v y, các nucleotide A 1. Phân tích trình tự ftsZ của fosmid tự dộng được thêm vào đầu 3’ của gen pTSSH2. ftsZ, tạo đầu t n cùng 3’-A. Phát hiện sản Trong quá trình tìm kiếm gen mã hóa phẩm PCR bằng phương pháp điện di trên onnamide từ ADN toàn phần của T. swinhoei, gel agarose 1%. đã phát hiện đoạn gen ftsZ nằm li n k * Tạo dòng đoạn gen ftsZ bằng kỹ thuật gen onnI trên fosmid pTSSH2. FtsZ là TA cloning: protein thuộc họ tubulin - like có ở VK, Sử d ng vector tạo dòng pBluescript đóng vai trò trong quá trình phân chia tế SK II (-), cắt bằng enzym cắt giới hạn bào VK và có tính bảo tồn cao (hình 2) EcoRV. Tiếp theo, tạo T-vector có đầu t n [5]. 42
4. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2016 onn genes ftsZ mã hóa protein tubulin-like cần thiết cho quá trình phân chia vi khuẩn © 2011 E Fischer-Friedrich Hình 2: (a) Gen ftsZ của pTSSH2. Đoạn liên t c: các gen onn, đoạn có vạch chéo: các gen không mã hóa cho onnamide, đoạn không màu: gen ftsZ (b) FtsZ (mũi tên) trong quá trình phân chia tế bào VK. 2. Phân tích trình tự ftsZ từ ADN toàn thuộc 03 ngành Firmicutes, Cyanobacteria phần của T. swinhoei. và Chloroflexi; trong đó ftsZ phân l p được Do có nhi u hợp chất onnamide hiện thuộc ngành Chloroflexi. Phân tích này đã diện trong T. swinhoei, vì v y giả thuyết cung cấp bằng chứng v chủ nhân th t m i v t chủ chịu trách nhiệm sản xuất sự của hợp chất onnamide là VK ngành một loại onnamide được đặt ra. Với m c Chloroflexi. Chloroflexi gồm những VK không đích tìm hiểu sự đa dạng của trình tự lưu hu nh màu l c, có khả năng tự dưỡng - gen ftsZ tồn tại trong hệ ADN toàn phần, nghĩa là sản xuất chất hữu cơ từ CO2 và ftsZ sau khi khuếch đại và biến nạp vào các chất vô cơ có trong môi trường dưới E. coli, chọn ngẫu nhiên 5 tế bào E. coli xúc tác của ánh sáng. Vì v y, Chloroflexi biến nạp để thu ftsZ. Đặt tên 5 trình tự còn được xếp vào nhóm VK quang hợp thu nh n: pTA1-1 - pTA1-5. Phân tích [6]. Nhóm VK này thấy nhi u ở động v t bằng BLAST cho thấy cả 5 trình tự sống trên cạn, sinh v t biển và đặc biệt nucleotide đ u mã hóa cho protein FtsZ ở hệ VK cộng sinh với bọt biển với tỷ lệ của Dehalococcoides ethenogenes, thuộc 22% [7]. Nh n định này phù hợp với ngành Chloroflexi với tỷ lệ tương đồng nghiên cứu của Bewley và CS cho rằng 56 - 58%. Tiếp t c so sánh trình tự ftsZ từ các chất chuyển hóa của T. swinhoei không nghiên cứu với 23 trình tự ftsZ của VK khác có nguồn gốc từ Cyanobacteria hay tế bào có độ tương đồng cao nhất. Những VK này của bọt biển [8]. 43
5. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2016 Tiếp t c so sánh những trình tự Mặc dù pederin và onnamide có công thức nucleotid này với trình tự ftsZ tìm thấy hóa học tương tự nhau, nhưng VK sản trên fosmid pTSSH2 bằng chương trình xuất chúng lại thuộc hai ngành hoàn toàn BioEdit - ClustalW. Kết quả cho thấy 5 khác nhau, Chloroflexi và Proteobacteria. trình tự này tương đồng nhau và tương Đây có thể do hiện tượng chuyển gen đồng với trình tự ftsZ của pTSSH2 với tỷ ngang (Horizontal gene transfer - HGT). lệ khá cao (≥ 96%), tuy nhiên không có Trong tự nhiên, HGT thường xảy ra để trình tự nào giống nhau hoàn toàn (bảng truy n v t liệu di truy n giữa VK, ngay cả 1). Kết quả trên đã chứng minh sự tồn tại khi VK không thuộc cùng một chi. Nhờ của các biến thể ftsZ trong hệ gen toàn v y, VK tăng khả năng thích nghi với đi u phần T. swinhoei. Đi u này giúp giải thích kiện môi trường sống thay đổi và di truy n hiện tượng từ T. swinhoei có nhi u hợp tính trạng qua các thế hệ. chất onnamide và m i hợp chất do những VK khác nhau sản xuất. KẾT LUẬN Bảng 4: So sánh các trình tự ftsZ. Ngoài các gen onn mã hóa onnamide, nhi u gen không mã hóa cho các PKS Trình Trình Tỷ lệ tƣơng Tên Tên tự tự đồng (%) cũng đã được phân l p từ hệ gen toàn 1 pTA1-1 2 pTA1-2 96 phần của T. swinhoe. Trong số đó, ftsZ 1 pTA1-1 3 pTA1-3 97 mã hóa protein tubulin - like là một gen 1 pTA1-1 4 pTA1-4 96 ứng viên ti m năng để nghiên cứu v v t 1 pTA1-1 5 pTA1-5 96 chủ sản xuất onnamide do chúng có trình 1 pTA1-1 6 FtsZ của 98 pTSSH2 tự bảo tồn cao giữa các VK. Theo phân 2 pTA1-2 3 pTA1-3 97 tích này, v t chủ của ftsZ, cũng là v t 2 pTA1-2 4 pTA1-4 97 chủ sản xuất onnamide, thuộc ngành 2 pTA1-2 5 pTA1-5 96 Chloroflexi. Hơn nữa, việc phát hiện được 2 pTA1-2 6 FtsZ của 97 nhi u biến thể của gen ftsZ từ VK khác pTSSH2 3 pTA1-3 4 pTA1-4 97 nhau thuộc ngành Chloroflexi từ hệ gen 3 pTA1-3 5 pTA1-5 97 toàn phần của T. swinhoei cũng là bằng 3 pTA1-3 6 FtsZ của 97 chứng củng cố cho giả thuyết có nhi u pTSSH2 chủng VK khác nhau chịu trách nhiệm 4 pTA1-4 5 pTA1-5 96 4 pTA1-4 6 FtsZ của 96 sản xuất onnamide. So sánh hai hệ thống pTSSH2 sản xuất PKS có cấu trúc tương tự nhau - 5 pTA1-5 6 FtsZ 96 nhóm gen mã hóa pederin và nhóm gen củapTSSH2 mã hóa onnamide cho thấy chúng có Kết quả phân tích trên tiếp t c cho nguồn gốc từ hai ngành VK hoàn toàn thấy thêm một khác biệt, đó là VK khác nhau, Proteobacteria cộng sinh với Pseudomonas sp. sản xuất pederin từ loài kiến ba khoang P. fuscipes và kiến ba khoang P. fulcipes và VK Chloroflexi Chloroflexi cộng sinh với loài bọt biển sản xuất onnamide từ bọt biển T. swinhoei. T. swinhoei. 44
6. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2016 TÀI LIỆU THAM KHẢO Inhibition of protein synthesis and activation of stress-activated protein kinases by onnamide 1. Haygood MG, Schmidt EW, Davidson A and theopederin B, antitumor marine natural SK, Faulkner DJ. Microbial symbionts of marine products. Cancer Sci. 2005, 96 (6), pp.357-364. invertebrates: Opportunities for microbial 5. Corton JC, Ward JE. Jr. Lutkenhaus J. biotechnology. J Mol Microbiol Biotechnol. Analysis of cell division gene ftsZ (sulB) from 1999, 1 (1), pp.33-43. Gram-negative and Gram-positive bacteria. 2. Taylor MW, Radax R, Steger D, Wagner J Bacteriol. 1987, 169, p.1-7. M. Sponge-associated microorganisms: Evolution, 6. Bacteriologists: Webster's Quotations, ecology, and biotechnological potential. Microbiol Facts and Phrases, ed. I.G. International. Mol Biol Rev. 2007, 71 (2), pp.295-347. 2008: ICON Group International, Inc. 3. Piel J, Hui D, Wen G, Butzke D, Platzer M, 7. Proksch P, Muller WE. G. Frontier in Fusetani N et al. Antitumor polyketide biosynthesis marine biotechnology Horizonbioscience. 2006. by anuncultivatedbacterial symbiont of the 8. Bewley CA, Holland ND, Faulkner DJ. marine sponge Theonella swinhoei. Proc Natl Two classes of metabolites from Theonella Acad Sci. USA. 2004, 101, pp.16222-16227. swinhoei are localized in distinct populations 4. Lee KH, Nishimura S, Matsunaga S, of bacterial symbionts. Experientia. 1996, 52 (7), Fusetani N, Horinouchi S, Yoshida M. pp.716-722. 45