Phân tích định lượng và phân tích tổng thể sắc đồ nhằm đánh giá chất lượng đại hoàng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

Nội dung text: Phân tích định lượng và phân tích tổng thể sắc đồ nhằm đánh giá chất lượng đại hoàng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

1. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 PHÂN TÍCH ĐỊNH LƢỢNG VÀ PHÂN TÍCH TỔNG THỂ SẮC ĐỒ NHẰM ĐÁNH GIÁ CHẤT LƢỢNG ĐẠI HOÀNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Chử Văn Mến*; Nguyễn Văn Long*; Vũ Tuấn Anh* TÓM TẮT Phƣơng pháp phân tích định lƣợng kết hợp với phân tích tổng thể sắc đồ đƣợc phát triển nhằm đánh giá chất lƣợng Đại hoàng dựa trên sắc đồ đặc trƣng. 5 hoạt chất gồm: chrysophanol, emodin, emodin-glucoside, rhaponticin và sennoside A đƣợc định lƣợng. Thực hiện phân tách trên cột pha đảo C18 với chƣơng trình gradient sử dụng dung môi A (dung dịch 0,05 M axit phosphoric trong nƣớc) và dung môi B (acetonitrile), bƣớc sóng 280 nm, tốc độ dòng 1,0 ml/phút. Chƣơng trình rửa giải gồm: 0 - 5 phút (20% B), 18 phút (28% B), 25 phút (42% B), 30 phút (100% B) cho kết quả tách tốt. Phƣơng pháp trên đƣợc áp dụng cho 31 mẫu Đại hoàng gồm các loài khác nhau. Kết quả: hàm lƣợng hoạt chất biến động nhiều trong các mẫu Đại hoàng và không khác biệt giữa các loài Đại hoàng. Ở phân tích tổng thể sắc đồ, 17 pic chính đƣợc chọn. Phân tích phân biệt tuyến tính LDA cho thấy các mẫu đƣợc phân loại thành 4 nhóm với độ chính xác 100%. Nghiên cứu này cho thấy: việc kết hợp định lƣợng các hoạt chất cùng với phân tích tổng thể sắc đồ giúp tiếp cận toàn diện trong đánh giá chất lƣợng dƣợc liệu nói chung và Đại hoàng nói riêng. * Từ khóa: Đại hoàng; Sắc ký lỏng hiệu năng cao; Đánh giá chất lƣợng. QUANTITATIVE AND PATTERN ANALYSIS FOR THE QUALITY EVALUATION OF RHEI RHIZOMA BY HPLC SUMMARY A quantitative and pattern analysis for the quality evaluation of Rhei rhizoma by HPLC based on chromatographic fingerprints in 40 minutes was developed. Five marker compounds, namely, chrysophanol, emodin, emodin-glucoside, rhaponticin and sennoside A were quantitated. The chromatographic separation was performed on a C18 column by gradient elution with 0.05 M phosphoric acid in water and acetonitrile, the wavelength was set at 280 nm, the flow rate was set at 1 ml/min, gradient condition as followed: 0 - 5 min (20% B); * Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Chử Văn Mến (chuvanmen@gmail.com) Ngày nhận bài: 16/8/2013; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 31/10/2013 Ngày bài báo được đăng: 5/11/2013 31
2. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 18 min (28% B); 25 min (42% B); 30 min (100% B) gave the satisfied separation. The developed method was applied to the quantitation of 31 samples of different Rhei Rhizoma species. The results showed that the contents of bioactive compounds were fluctuated among samples and there were no difference among Rhubarb species. For pattern analysis, seventeen common peaks were selected. LDA (Linear Discriminant Analysis) showed that the samples were clustered into 4 different groups of species with the accuracy of 100%. This study showed that quantitative determination of marker compounds combined with pattern- recognition method can provide a comprehensive approach for the quality assessment of herbal medicines. * Key words: Rhei Rhizoma; HPLC; Quality evaluation. lợi mật, bảo vệ gan, kháng virut, kháng ĐẶT VẤN ĐỀ viêm... [5, 6, 7]. Các hoạt chất chính của Đại hoàng gồm: các anthraquinone Đại hoàng (Rhei Rhizoma) là một nhƣ chrysophanol, emodin [8], dianthrone nhóm loài trong chi Rheum thuộc họ nhƣ sennoside A [9] hay stilbene nhƣ Rau răm (Polygonaceae). Có ba loài của rhaponticin [10]. Phân tích định lƣợng chi Rheum có trong Dƣợc điển Việt Nam, đơn thuần một số chất đánh dấu không Hàn Quốc và Trung Quốc bao gồm: thể phân biệt Đại hoàng thật và giả. R. tanguticum, R. palmatum và R. officinale Trong nghiên cứu này, chúng tôi kết hợp [1, 2, 3]. Trong dƣợc điển Nhật Bản, giữa phân tích định lƣợng và phân tích ngoài ba loài trên còn có thêm Rheum tổng thể sắc đồ nhằm đánh giá toàn diện coreanum và những loài lai giữa các loài chất lƣợng Đại hoàng từ các loài khác trên là dƣợc liệu Đại hoàng [4]. Ngoài nhau. ra, các loài không chính thức nhƣ Rheum undulatum, Rheum rhaponticum, Rumex crispus, Rumex aquatica và Reynoutria elliptica thƣờng bị nhầm là Đại hoàng. Trong một số trƣờng hợp, việc xác định loài dựa trên phân tích mô học giữa các loài của mẫu Đại hoàng trên thị trƣờng cực kỳ khó khăn. Nhiều nhà nghiên cứu và thầy thuốc đông y thƣờng bị nhầm lẫn bởi sự không rõ ràng của nhiều loài trong việc sử dụng dƣợc liệu Đại hoàng. Do vậy, đánh giá chất lƣợng Đại hoàng dựa trên thành phần hoạt chất đóng vai trò rất quan trọng trong kiểm soát chất Hình 1: Cấu trúc hóa học của các hoạt chất lƣợng của Đại hoàng. chính trong Đại hoàng: 1. Sennoside A, Đại hoàng đƣợc biết đến với nhiều 2. Rhaponticin, 3. Emodin-glucoside, hoạt tính sinh học nhƣ nhuận tràng, 4. Emodin, 5. Chrysophanol. 32
3. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP Chƣơng trình rửa giải nhƣ sau: NGHIÊN CỨU THỜI GIAN 1. Hóa chất và thiết bị. % A % B (phút) Hóa chất: các chất chuẩn chrysophanol, emodin, emodin-glucoside, rhaponticin 0 5 80 20 và sennoside A đƣợc chiết xuất, phân tách, tinh chế và xác định cấu trúc, chuẩn 5 18 80 72 20 28 nội (eugenol), acetonitrile, methanol, nƣớc 18 25 72 58 28 42 cất, axit phosphoric đạt tiêu chuẩn cho sắc ký lỏng hiệu năng cao, các hóa chất khác 25 30 58 0 42 100 đạt tiêu chuẩn phân tích. 30 35 0 80 100 20 Mẫu Đại hoàng đƣợc thu hái từ nhiều vùng khác nhau của Trung Quốc và Hàn 35 40 80 20 Quốc, đƣợc GS. Jae Hyun Lee, Khoa Y học Cổ Truyền, Đại học Dong Guk * Chuẩn bị dung dịch chuẩn và thử: thẩm định và lƣu trữ tại Khoa Dƣợc, - Nội chuẩn (IS): dung dịch eugenol Đại học Quốc gia Chung Nam, Hàn Quốc. nồng độ 1.000 µg/ml trong methanol. Thiết bị: máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu gồm bơm LC-20AD, detector - Mẫu chuẩn: dãy các dung dịch chuẩn SPD-20A UV/Vis, hệ thống tiêm mẫu tự có nồng độ chính xác chrysophanol (từ động SIL-20A, bộ phận ổn nhiệt CTO- 2 - 200 µg/ml), emodin (1 - 100 µg/ml), 20A (Shimadzu, Japan). Thực hiện phân emodin-glucoside (0,5 - 50 µg/ml), tách trên cột C18 (4,6 x 250 mm, 5 µm, rhaponticin (2 - 200 µg/ml) và sennoside A Optimapak, RStech Corp, Hàn Quốc). (0,5 - 50 µg/ml) trong dung dịch chuẩn 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. nội eugenol 200 (µg/ml) trong methanol. * Điều kiện sắc ký: - Mẫu thử: cân chính xác 100 mg bột Cột: cột phân tích pha đảo Optimapak dƣợc liệu Đại hoàng, cho vào bình định mức 10 ml. Thêm 9 ml ethanol 70% và C18 (250 x 4,6; 5μm) của Công ty RS tech (Hàn Quốc); bƣớc sóng phát hiện: 200μl dung dịch chuẩn nội, bổ sung 280 nm; pha động: dung môi A (dung ethanol 70% vừa đủ, cân, lắc siêu âm dịch axit phosphoric 0,05 M trong nƣớc); 60 phút, cân lại, bổ sung khối lƣợng mất dung môi B (acetonitrile); tốc độ dòng: bằng ethanol 70%. Ly tâm, gạn lấy lớp 1 ml/phút; thể tích tiêm: 10 μl. trên và lọc qua màng lọc 0,45 μm. 34
4. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Hình 2: Sắc ký đồ và so sánh phổ của mẫu chuẩn (a) và mẫu thử (b, c); (1): sennoside A; (2): rhaponticin; (3): emodin-glucoside (4): emodin; (5): chrysophanol. Với điều kiện sắc ký và phƣơng pháp trùng khít lên nhau với hệ số phù hợp lần xử lý mẫu đã lựa chọn, sắc ký đồ thu lƣợt là 0,9997; 0,9996; 0,9998; 0,9992 và đƣợc cho các pic tách rõ ràng, nhiễu nền 0,9994. Điều này chứng tỏ: pic thu đƣợc thấp, thể hiện qua sắc ký đồ của mẫu thử trên sắc ký đồ của mẫu thử tinh khiết và Đại hoàng và hỗn hợp chuẩn. Trên sắc các thành phần khác có trong mẫu thử ký đồ, mẫu thử có thời gian lƣu trùng không ảnh hƣởng đến quá trình phân với thời gian lƣu của pic sennoside A, tích năm chất đối chiếu sennoside A, rhaponticin, emodin-glucoside, emodin, rhaponticin, emodin-glucoside, emodin, chrysophanol của mẫu chuẩn lần lƣợt là chrysophanol, qua đó cho phép tiến hành 12,25; 13,35; 17,56; 34,42; 36,06 phút. định tính và định lƣợng. Tại thời gian lƣu của sennoside A, 1. Khoảng tuyến tính, giới hạn phát rhaponticin, emodin-glucoside, emodin, hiện và giới hạn định lƣợng. chrysophanol trên các sắc đồ mẫu thử và Pha một gồm 6 dung dịch mẫu chuẩn mẫu chuẩn, chúng tôi đã so sánh phổ hấp thụ UV thu đƣợc của pic. Kết quả có nồng độ từ 0,5 - 200 μg/ml. Tiến cho thấy phổ mẫu thử và mẫu chuẩn hành sắc ký nhƣ điều kiện đã mô tả. 35
5. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 Bảng 1: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng. CHẤT NỒNG ĐỘ PHƢƠNG TRÌNH r LOD LOQ CHUẨN (g/ml) HỒI QUY (g/ml) ((g/ml) Sennoside A 0,9 - 50 Y = 0,0023 X - 0,0066 1,0000 0,28 0,94 Rhaponticin 2,0 - 200 Y = 0,0066 X - 0,0039 0,9998 0,15 0,50 Emodin- glucoside 0,5 - 50 Y = 0,0211 X - 0,0045 0,9997 0,05 0,15 Emodin 1,0 - 100 Y = 0,0155 X - 0,0069 0,9997 0,06 0,20 Chrysophanol 2,0 - 200 Y = 0,0061 X - 0,0055 0,9996 0,16 0,50 Kết quả khảo sát cho thấy: với khoảng lƣợng của từng chất lần lƣợt 0,94, 0,50, nồng độ của sennoside A từ 0,9 - 50 μg/ml, 0,15, 0,20 và 0,50 µg/ml. rhaponticin từ 2,0 - 200 μg/ml, emodin- 2. Độ đúng, độ lặp lại của phƣơng glucoside từ 0,5 - 50 μg/ml, emodin từ pháp. 1,0 - 100 μg/ml, chrysophanol từ 2,0 - Độ đúng và độ lặp lại của phƣơng 200 μg/ml, có sự tƣơng quan tuyến tính pháp đƣợc xác định trên các mẫu chuẩn giữa nồng độ và tỷ lệ diện tích pic đã biết trƣớc nồng độ. Tính độ đúng và chuẩn/chuẩn nội. độ lặp lại trong ngày bằng cách phân Phƣơng trình tuyến tính của các chất tích mẫu chuẩn 5 lần/ngày; độ đúng và sennoside A, rhaponticin, emodin-glucoside, độ lặp lại giữa các ngày đƣợc tiến hành emodin, chrysophanol cho phép xác định bằng cách phân tích mẫu chuẩn trong giới hạn phát hiện lần lƣợt 0,28, 0,15, 5 ngày liên tiếp. 0,05, 0,06 và 0,16 µg/ml giới hạn định Bảng 2: Kết quả xác định độ đúng và độ lặp lại của phƣơng pháp. CHẤT NỒNG TRONG NG (n 5) GI A C C NG (n 5) CHUẨN ĐỘ Độ lặp lại (%) Độ đúng (%) Độ lặp lại (%) Độ đúng (%) Sennoside A 12,5 0,73 100,2 0,93 99,2 Rhaponticin 50,0 0,83 100,9 0,83 101,1 Emodin- glucoside 12,5 1,13 99,6 1,32 99,5 Emodin 25,0 0,39 100,9 0,62 102,0 Chrysophanol 50,0 0,90 101,4 1,29 101,6 37
6. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 Độ đúng trong khoảng từ 99,2 - 102,0 đối với độ đúng trong ngày và giữa các ngày. Độ lặp lại của phƣơng pháp thể hiện ở độ lệch tƣơng đối (RSD). Kết quả cho thấy: RSD của phƣơng pháp thấp hơn 1,32% đối với độ lặp lại trong ngày và giữa các ngày. Chứng tỏ phƣơng pháp định lƣợng đồng thời các hoạt chất sinh học có độ chính xác và lặp lại cao. 3. Kết quả phân tích định lƣợng các hoạt chất trong mẫu dƣợc liệu Đại hoàng. Kết quả khảo sát hàm lƣợng các hoạt chất sennoside A, rhaponticin, emodin- glucoside, emodin, chrysophanol có trong 31 mẫu Đại hoàng cho thấy: hàm lƣợng Hình 3: Kết quả phân tích hàm lƣợng hoạt cao nhất của sennoside A, rhaponticin, chất trong các mẫu Đại hoàng (mg/g): emodin-glucoside, emodin, chrysophanol (a) Sennoside A, (b) Rhaponticin, (c) Emodin- glucoside, (d) Emodin, (e) Chrysophanol. là 16,31; 94,41; 1,81; 3,11 và 12,64 mg/g trong dƣợc liệu khô. Hàm lƣợng hoạt chất 4. Kết quả phân tích tổng thể sắc đồ. chính trong các mẫu Đại hoàng biến động Tiến hành phân tích tổng thể sắc đồ nhiều trong tất cả các mẫu. Không thấy sự dựa trên 17 pic chung bằng LDA (phân khác biệt giữa các loài Đại hoàng. tích phân biệt tuyến tính) cho thấy: các mẫu Đại hoàng từ các nguồn gốc khác nhau đƣợc phân biệt với độ chính xác 100%. 38
7. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 Hình 4: Kết quả phân tích LDA các virus activity from Rheum palmatum L. mẫu Đại hoàng: (1) Rheum officinale, ethanol extract. Chemotherapy. 2007, 53 (5), (2) Rheum palmatum, (3) Rheum tanguticum, pp.320-326. (4) Rheum undulatum. 7. Chang CH, Lin CC, Yang JJ, Namba T, KẾT LUẬN Hattori M. Anti-inflammatory effects of emodin from ventilago leiocarpa. Am J Chin Med. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng 1996, 24, pp.139-142. cao đơn giản, hiệu quả. Đã đƣợc phát triển và thẩm định phƣơng pháp để định 8. Yoshiki Kashiwada, Gen-ichiro Nonaka, lƣợng đồng thời 5 hoạt chất trong dƣợc Itsuo Nishioka. Studies on Rhubarb (Rhei liệu Đại hoàng. Hàm lƣợng của hoạt Rhizoma). XV. Simultaneous determination of chất biến đổi nhiều trong các mẫu, phenolic constituents by high-performance không có sự khác biêt giữa các loài Đại liquid chromatography. Chem Pharm Bull. hoàng. Đại hoàng đƣợc phân biệt thành 1989, 37 (4), pp.999-1004. 4 nhóm khác nhau tƣơng ứng với 4 loài 9. Komatsu K, Nagayama Y, Tanaka K, với độ chính xác 100%. Phân tích định Ling Y, Cai SQ, Omote T, Meselhy MR. lƣợng đồng thời các hoạt chất kết hợp Comparative study of chemical constituents với phân tích tổng thể sắc đồ là cơ sở để of rhubarb from different origins. Chem đánh giá chất lƣợng dƣợc liệu nói chung Pharm Bull. 2006, 54 (11), pp.1491-1499. và Đại hoàng nói riêng. 10. Hu Cunhua, Ye Shaojian, Zhao Libo, Wang Jialing. Effects of five stilbene TÀI LIỆU THAM KHẢO compounds on NO mediated vasodilation 1. Dược điển Việt Nam, tập IV. 2010. and their structure - activity relationship. 2. Pharmacopoeia of the People's Republic Zhongguo Yiyuan Yaoxue Zazhi. 2006, of China. 2005. 26 (7), pp.826-829. 3. Korean Pharmacopoeia. 2007. 4. The Japanese Pharmacopoeia. 2001. 5. Okamura Nobuyuki, Abo Naomi, Aono Mio, Eguchi Tomoyori, Yoshii Hisano, Ono Yukio, Yagi Akira. Variation of sennoside A content and purgative activity during preparation of rhubarb decoction. Wakan Iyakugaku Zasshi. 2002, 19 (3), pp.114-118. 6. Li Z, Li LJ, Sun Y, Li J. Identification of natural compounds with anti-hepatitis B 39
8. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 40