Phân tích di truyền từ một tế bào để phát hiện đột biến gây bệnh Beta - Thalassemia bằng phương pháp minisequencing

Nội dung text: Phân tích di truyền từ một tế bào để phát hiện đột biến gây bệnh Beta - Thalassemia bằng phương pháp minisequencing

1. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015 PHÂN TÍCH DI TRUYỀN TỪ MỘT TẾ BÀO ĐỂ PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GÂY BỆNH BETA-THALASSEMIA BẰNG PHƢƠNG PHÁP MINISEQUENCING Trần Văn Khoa*; Ngô Trường Giang*; Đặng Tiến Trường* Nguyễn Đình Tảo* Triệu Tiến Sang*; Nguyễn Thu Hà**; Hoàng Đặng An Sinh* TÓM TẮT Mục tiêu: hoàn thiện quy trình phát hiện các đột biến gây bệnh beta -thalassemia từ 1 tế bào bạch cầu bằng phương pháp minisequensing. Đối tượng và phương pháp: tế bào bạch cầu lympho của 9 bệnh nhân (BN) hoặc người mang đột biến gen beta-globin được tách khỏi máu toàn phần bằng phương pháp ly tâm tỷ trọng dùng ficoll, lấy 1 bạch cầu dưới kính hiển vi soi nổi, sau đó ly giải tế bào, nhân gen beta-globin bằng nested PCR, chạy minisequensing, điện di tự động phát hiện đột biến gây bệnh đối chiếu với kết quả phân tích từ máu toàn phần bằng phương pháp ARMS-PCR và multiplex ARMS-PCR. Kết quả và kết luận: các đột biến trên đối tượng trong phạm vi nghiên cứu đều được phát hiện khi phân tích với 1 tế bào bạch cầu, phù hợp kết quả phân tích từ máu ngoại vi toàn phần để phục vụ cho chẩn đoán di truyền trước chuyển phôi. * Từ khóa: Beta-thalassemia; Một tế bào; Chẩn đoán di truyền tiền làm tổ; Minisequencing. Single Cell Genetic Analysis for Mutation Detection in Beta-thalassemia Using Minisequencing Method Summary Objectives: Setting up a protocol for detection of beta-thalsassemia induced mutations from unique lymphocyte using minisequencing method. Subjects and methods: 9 peripheral blood lymphocytes of beta-thalassemia patients or beta-globin mutation carriers were isolated using density gradient centrifugation with ficoll. One lymphocyte was taken using stereoscopic microscope, then lysised. Beta-globin gene was amplified with nested PCR. Minisequencing and electrophoresis were performed to detect mutations in comparison with ARMS-PCR and multiplex ARMS-PCR method. Results and conclusions: All kinds of common mutations in the subjects were detected using unique lymphocyte as same result using whole peripheral blood sample. * Key words: Beta-thalssemia; Single cell; Preimplantation genetic diagnosis; Minisequencing. * Học viện Quân y ** Viện Huyết học Truyền máu Trung ương Người phản hồi (Corresponding): Trần Văn Khoa (tvkhoabi@gmail.com) Ngày nhận bài: 09/10/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 18/11/2014 Ngày bài báo được đăng: 27/12/2014 32
2. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015 ĐẶT VẤN ĐỀ trên 1 tế bào. Do đó, chúng tôi thực hiện nghiên cứu này với mục tiêu: Hoàn thiện Beta-thalassemia là một trong những quy trình phát hiện các đột biến gây bệnh bệnh di truyền đơn gen phổ biến nhất trên beta-thalassemia từ 1 tế bào bạch cầu thế giới [1]. Ở Việt Nam, ước tính có bằng phương pháp minisequensing, làm khoảng 5 triệu người mang gen và bị tiền đề cho chẩn đoán di truyền trước bệnh. Hàng năm có khoảng 2.000 trẻ chuyển phôi. được sinh ra mắc bệnh thalassemia. Các đột biến gen beta-globin gây ra bệnh ĐỐI TƢỢNG, HÓA CHẤT VÀ PHƢƠNG beta-thalassemia thường là các đột biến PHÁP NGHIÊN CỨU điểm. Tại khu vực Đông Nam Á, một số đột biến thường gặp là: Cd17, Cd 41/42, 1. Đối tƣợng nghiên cứu. Cd71/72, -28, IVS1-1, IVS1-5, IVS2-654, 9 mẫu máu của 9 thành viên thuộc 3 CD26, CD95 [2]. gia đình gồm bố, mẹ mang gen đột biến Điều trị cho những BN này tạo ra gánh gây bệnh beta-thalassemia có con bị nặng cả về kinh tế cũng như tinh thần cho bệnh beta-thalassemia đang điều trị tại gia đình và toàn xã hội. Chính vì vậy, việc Trung tâm Thalassemia, Viện Huyết học phòng bệnh và khống chế sự phát tán Truyền máu Trung ương, có kết quả sàng bệnh ra cộng đồng là rất cấp thiết. lọc đột biến beta-thalassemia từ ADN Hiện nay, bằng một số biện pháp can máu toàn phần bằng phương pháp thiệp chẩn đoán trước sinh như chọc hút ARMS-PCR và multiplex ARMS-PCR nước ối hay sinh thiết gai rau đã phần (làm đối chứng). Tất cả các trường hợp nào hạn chế sinh ra những trẻ bị bệnh. được lấy 5 ml máu cho vào ống chống Tuy nhiên, những phương pháp này đông bằng EDTA để tiến hành các bước thường tiến hành khá muộn, nếu dừng tiếp theo (tách tế bào, ly trích ADN, nhân thai kỳ sẽ ảnh hưởng lớn tới sức khỏe gen, tiến hành giải trình tự tại Trung tâm thai phụ. Chẩn đoán di truyền trước Nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học chuyển phôi (Preimplantation genetic viện Quân y). diagnosis - PGD) là phương pháp sàng 2. Hóa chất. lọc phôi bất thường về mặt di truyền được thực hiện trước khi cấy phôi vào tử - Hóa chất tách bạch cầu: dung dịch cung người mẹ, đây là một phương pháp cân bằng, dung dịch ficoll (d = 1,077). dự phòng hiệu quả các bệnh di truyền, - Hóa chất ly giải tế bào: dung dịch trong đó có beta-thalassemia [3, 4, 5, 6]. KOH 0,2 M, dung dịch tricine 0,2 M. Tuy nhiên, đây là một kỹ thuật khó, chỉ - Hóa chất tinh sạch: SAP, EXO1. tiến hành trên 1 hoặc 2 tế bào [1]. - Hóa chất điện di tự động: hidi-formamid, Minisequencing là phương pháp trực tiếp, geneScan-120 LIZ. sử dụng các mồi đặc hiệu và nucleotid gắn huỳnh quang để phát hiện đột biến - Hóa chất cho PCR: PCR Reaction điểm [2]. Để thực hiện kỹ thuật này, cần mix, ADN polymerase, primers, minisequensing có một quy trình phát hiện đột biến gen primers, SNaPshot multiplex kit. 33
3. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015 - Thiết bị: máy ly tâm văng, kính hiển vi + PCR vòng 1: nhân gen beta-globin soi nổi có độ phóng đại 320X, buồng thao với thể tích 50 μl chứa dịch ly giải 1 tế tác PCR (Mỹ), máy PCR ABI 9700 bào bạch cầu; 0,2 μm mỗi primer vòng 1; (Applied Biosystem), hốt ủ hóa chất (Hàn 0,2 mM mỗi loại deoxyribonucleotid Quốc), máy điện di tự động 3130xl Genetic triphosphat (dNTP) và 2,5 đơn vị HotStarTaq analyzer, hệ thống điện di trên gen. ADN polymerase (Qiagen) trong 1X PCR 3. Phƣơng pháp nghiên cứu. buffer chứa 1,5 mM MgCl2. - Tách tế bào bạch cầu bằng phương + PCR vòng 2: nhân gen beta-globin, pháp ly tâm tỷ trọng sử dụng ficoll-paque sử dụng 3 μl sản phẩm PCR vòng 1 với theo quy trình của nhà sản xuất. thể tích 50 μl. Thành phần phản ứng tương tự như vòng 1, ngoại trừ ADN - Pha loãng bạch cầu bằng dung dịch polymerase giảm còn 1 đơn vị. Chu trình PBS 1X, gắp 1 tế bào bạch cầu trên kính nhiệt tương tự như PCR vòng 1. hiển vi soi nổi đặt vào ống PCR 0,2 ml. - Minisequencing được tiến hành với - Ly giải tế bào bằng 5 μl KOH 0,2 M, ủ SNaPshotTM multiplex ready reaction mix 650C trong 10 phút, trung hòa KOH bằng (Applied Biosystems) và 0,2 μm mỗi 5 μl tricine 0,2 M. minisequencing primer theo quy trình của - Tiến hành phản ứng nested PCR nhà sản xuất. theo Wang và CS (2003), có cải biên [2]. - Trình tự mồi gen beta-globin 2 vòng: Cụ thể: beta-F1* ACGGCTGTCATCACTTAGAC HUMHBB: 62010-62029 1.457 bp beta-R1* AAGAGGTATGAACATGATTAGC HUMHBB: 63466-63445 BGLO-2F GTCATCACTTAGACCTCACC HUMHBB: 62016-62035 1.409 bp BGLO-2R CAGAATAATCCAGCCTTATCC HUMHBB: 63424-63404 Bảng 1: Chu trình nhiệt phản ứng PCR nested PCR. phót chu kú 950C 45 giây 560C 45 giây 30 chu kỳ 720C 2 phút 720C 5 phút 1 chu kỳ Sản phẩm nhân vòng 2 được tinh sạch bằng 2 enzym SAP và EXO1, chạy multiplex minisequensing theo quy trình kit ABI PRIMER TSNaPshot Multiplex (Applied Biosystems) với các mồi minisequencing. 34
4. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015 Bảng 2: Trình tự các mồi sử dụng cho kế, băng điện di rõ, nét, đẹp, không thấy minisequencing. sản phẩm phụ. 2. Kết quả điện di tự động phát hiện SNP-654 TGATAATTTCTGGGTTAAGG đột biến. SNP-28 (gact)7 GATGGCTCTGCCCTGACTT A Cd 26) (gact)3 CAACCTGCCCAGGGCCT TT T T THB16 Cd 17R act (gact)7 THM16 CAACTTCATCCACGTTCACCT Cd 28R (gact)6 GATGGCTCTGCCCTGACTT C Cd 71/72F ct (gact)8 AGAAAGTGCTCGGTGCCTTTA IVSI-1R TCTTGTAACCTTGATACCAA Hình 2: Hình ảnh điện di tự động sản Sản phẩm minisequencing được điện phẩm minisequencing mẫu THM16 di huỳnh quang trên máy 3130xl Genetic và THB16. analyzer, phân tích bằng phần mềm GeneMapper ID v 3.2. Đánh giá kết quả THM16 (mẫu máu của người mẹ gia phát hiện đột biến dựa vào kích thước, đình 16) mang kiểu gen dị hợp tử Cd26, màu sắc và độ lớn của các pic thu được pic bên phải màu đen là nucleotid C (bình trên điện di huỳnh quang. thường), pic bên trái màu đỏ là nucleotid T (đột biến). KÕt qu¶ nghiªn cøu vµ bµn luËn THB16 (mẫu máu của người bố gia 1. Kết quả nhân gen beta-globin. đình 16) mang kiểu gen dị hợp tử Cd17, pic bên phải xanh lá cây là nucleotid A (đột biến), pic bên trái đỏ là nucleotid T (bình thường). T A T T THC16 Hình 1: Hình ảnh điện di trên gel agarose C sản phẩm khuếch đại vòng 2 gen beta-globin. Marker ADN 1 kp (dải giữa); chứng âm (dải thứ nhất); chứng dương (dải thứ hai); Hình 3: Hình ảnh điện di tự động sản 9 dải còn lại: băng gen beta-globin, kích phẩm minisequencing mẫu THC16. thước tương đương 1.409 bp của 9 thành viên thuộc 3 gia đình. THC16 (mẫu máu của người con Sản phẩm nhân gen có chất lượng tốt, gia đình 16) mang kiểu gen dị hợp tử kích thước phù hợp với dự kiến theo thiết Cd26/Cd17. 35
5. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015 A T A T Hình 4: Hình ảnh điện di tự động sản phẩm minisequencing mẫu THB24,THM24. THB24,THM24 (mẫu máu của người Hình 6: Hình ảnh điện di tự động sản bố, mẹ gia đình 24) mang kiểu gen dị hợp phẩm minisequencing mẫu THM48 và tử Cd17, pic bên phải xanh lá cây là THB48. nucleotid A (đột biến), pic bên trái đỏ là nucleotid T (bình thường). THM48 (mẫu máu của người mẹ gia đình 48) mang kiểu gen dị hợp tử IVS1-1, A pic phải màu đen là nucleotid C (bình thường), pic trái màu đỏ là nucleotid T (đột biến). THB48 (mẫu máu của người bố gia đình 48) mang kiểu gen dị hợp tử Cd41/42, pic phải xanh da trời là Hình 5: Hình ảnh điện di tự động sản nucleotid G (đột biến), pic trái màu đen là phẩm minisequencing mẫu THC24. nucleotid C (bình thường). THC24 (mẫu máu của người con gia Kết quả điện di minisequencing phân đình 24) mang kiểu gen đồng hợp tử tích xác định đột biến rõ ràng, phát hiện Cd17, chỉ xuất hiện 1 pic xanh lá cây, được cả 9 trường hợp: người lành mang nucleotid A (đột biến). gen (THM16, THB16, THM24, THB24, THM48, THB48), đồng hợp tử gây bệnh A (THC24) và dị hợp tử của 2 đột biến (THC16, THC48). Dưới đây là kết quả tổng hợp phát hiện các đột biến gen beta-globin từ 1 tế bào bạch cầu tách từ máu ngoại vi của 9 thành viên thuộc 3 gia đình có con mắc bệnh beta-thalassemia. 36
6. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015 Bảng 3: Kết quả phát hiện đột biến gây bệnh beta-thalassemia. 1 THB16 Cd17 Cd17 2 THM16 Cd26 Cd26 3 THC16 Cd17/Cd26 Cd17/Cd26 4 THB24 Cd17 Cd17 5 THM24 Cd17 Cd17 6 THC24 Cd17/Cd17 Cd17/Cd17 7 THB48 Cd41/42 Cd41/42 8 THM48 IVS1-1 IVS1-1 9 THC48 Cd41/42/IVS1-1 Cd41/42/IVS1-1 Tất cả 9 thành viên thuộc 3 gia đình đều phát hiện được đột biến, thấy được di truyền đột biến từ bố mẹ cho con. Các đột biến giống với kết quả sàng lọc trên máu toàn phần bằng phương pháp ARMS-PCR và multiplex ARMS-PCR. KẾT LUẬN 2. Wang W, Kham SK, Yeo GH, Quah TC, Qua phân tích 9 mẫu thuộc 3 gia đình Chong SS. Multiplex minisequencing screen BN hoặc người mang gen đột biến gây for common Southeast Asian and Indian beta bệnh beta-thalassemia, đối chiếu kết quả thalassaemia mutations. Clin Chem. 2003, 49, pp.209-218. phân tích phát hiện đột biến bằng hai phương pháp ARMS-multiplex PCR từ mẫu 3. Kuliev A, Rechitsky S, Verlinsky O, máu toàn phần và minisequencing từ 1 tế Ivakhnenko V, Evsikov S, Wolf G et al. bào bạch cầu, chúng tôi rút ra kết luận: Preimplantation diagnosis of thalassaemias. J Assist Reprod Genet. 1998, 15, pp.219-225. - Đã hoàn thiện được quy trình phát 4. Deng J, Peng WL, Li J, Fang C, Liang hiện đột biến trên gen beta-globin gây XY, Zeng YH et al. Successful preimplantation bệnh beta-thalassemia từ 1 tế bào bằng genetic diagnosis for alpha- and beta- phương pháp minisequensing. thalassaemia in China. Prenat Diagn. 2006, - Bốn loại đột biến gen beta golobin 26, pp.1021-1028. thường gặp gây bệnh beta-thalassemia 5. De Rycke M, Van de Velde H, Sermon đã được phát hiện là Cd17, Cd26, K, Lissens W, De Vos A, Vandervorst M et al. Cd41/42 và IVS1-1 bằng phương pháp Preimplantation genetic diagnosis for sickle- minisequencing từ 1 tế bào phù hợp với cell anemia and for beta-thalassaemia. Prenat phương pháp ARMS PCR và multiplex Diagn. 2001, 21, pp.214-222. ARMS-PCR từ máu toàn phần. 6. Kanavakis E, Vrettou C, Palmer G, Tzetis M, Mastrominas M, Traeger- Synodinos J. TÀI LIỆU THAM KHẢO Preimplantation genetic diagnosis in 10 couples 1. Ng IS, Law HY. Challenges in screening at risk for transmitting beta-thalassaemia major: and prevention of thalassaemia in Singapore. clinical experience including the initiation of Asian-Oceanian Journal of Paediatrics and six singleton pregnancies. Prenat Diagn. Child Health. 2003, 2, pp.29-38. 1999, 19, pp.1217-1222. 37
7. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015 38