Phân tích cấu trúc gen lmp - 1 và mối quan hệ nguồn gốc phả hệ của 34 chủng virut epstein - barr từ bệnh nhân ung thư vòm họng ở Việt Nam

Nội dung text: Phân tích cấu trúc gen lmp - 1 và mối quan hệ nguồn gốc phả hệ của 34 chủng virut epstein - barr từ bệnh nhân ung thư vòm họng ở Việt Nam

1. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ PHỤ TRƢƠNG 2014 PHÂN TÍCH CẤU TRÚC GEN LMP-1 VÀ MỐI QUAN HỆ NGUỒN GỐC PHẢ HỆ CỦA 34 CHỦNG VIRUT EPSTEIN-BARR TỪ BỆNH NHÂN UNG THƢ VÒM HỌNG Ở VIỆT NAM Lê Thanh Hà*; Nguyễn Lĩnh Toàn** Nguyễn Đình Phúc***; Lê Thanh Hòa**** TÓM TẮT Tách chiết ADN tổng số chứa hệ gen Epstein-Barr virut (EBV) từ mẫu mô sinh thiết của 64 BN được chẩn đoán ung thư vòm mũi họng (UTVMH) ở 3 miền Bắc Trung Nam (Việt Nam). Bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi LPMP1F/LMP1R, thu nhận, dòng hóa và giải trình tự 34 sản phẩm PCR. Trình tự nucleotid của 34 chuỗi gen LMP-1 có độ dài biến động từ 1.238 - 1.337 bp. Kết quả phân tích gen LMP-1 của 34 chủng này cho thấy có 3 exon và 2 intron trong khung gen của LMP-1, trong đó exon 1 là 268 bp; intron là 76 - 78 bp; exon 2 là 87 bp; intron 2 là 76 -77 bp và exon 3 có độ biến động độ dài cao nhất từ 728 - 827 bp. Kích thước ARN thông tin từ 1.083 - 1.182 bp, mã hóa protein LMP-1 có độ dài 353 - 387 a.a. So sánh đối chiếu với các chủng quốc tế đã được đăng ký trong Ngân hàng Gen cho thấy, 34 chủng nghiên cứu này của Việt Nam có độ đồng nhất cao nhất với chủng China 1 (Trung Quốc) và 3 chủng khác (NPC1, NPC2, NPC3) của Việt Nam. Phân tích phả hệ cho thấy 34 chủng nghiên cứu thuộc về 3 nhóm, trong đó, nhóm I: 20/34 thuộc về nhóm gồm các chủng di truyền China 1, nhóm I: 9/34 thuộc về nhóm các chủng di truyền China 2, Alaska và North Carolina và nhóm III: 5/34 thuộc về nhóm các chủng di truyền Med+ và Med-. * Từ khóa: Ung thư vòm mũi họng; EBV; Exon; Intron; LMP-1, Phả hệ. STRUCTURE OF LMP-1 AND PHYLOGENETIC ANALYSIS OF 34 EBV STRAINS ISOLATED FROM NASOPHARYNGEAL CARCINOMA PATIENTS IN VIETNAM SUMMARY Genomic DNAs of Epstein-Barr virus were extracted from biopsy tissue of 64 patients with nasopharyngeal carcinoma. Of 64 templates using PCR with primers LPMP1F/LMP1R, 34 products were successfully obtained, cloned and sequenced. The entire LMP-1 sequence for 34 isolates was between 1,238 and 1,337 bp. There were 3 exons and 2 introns inside the LMP1 frame of which, exon 1 was 268 bp, itron 1 was 76 -78 bp, exon 2 was 87 bp, intron 2 was 76 - 77 bp and exon 3 was variable, between 728 and 827 bp. The full length of mRNA varied between 1,083 and 1,182 bp, encoding for 353 - 387 amino acid. Comparative analysis revealed that 34 EBV strains of the Vietnamese patients have highest identity and homology with China 1 (China) and 3 others of Vietnam (NPC1, NPC2, NPC3). Phylogenetic tree showed that there were 3 groups, including group I of 20/34 strains clustered with the China 1; group II with 9/34 belonging to the China 2, Alaska and NC (North Carolina); and group III of 5/34 strains with the Med + and Med- . * Key words: Nasopharyngeal carcinoma; EBV; Exon; Intron; LMP-1; Phylogeny. * Bệnh viện Quân y 103 ** Học viện Quân y *** Viện Tai Mũi Họng Trung ương **** Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm KHCN Việt Nam Người phản hồi (Corresponding): Lê Thanh Hà (lethanhhash@yahoo.com) Ngày nhận bài: 24/01/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 12/02/2014 Ngày bài báo được đăng: 25/02/2014 18
2. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ PHỤ TRƢƠNG 2014 ĐẶT VẤN ĐỀ vào nguyên sinh chất tế bào; ii) Vùng 6 nhóm axít amin kỵ nước nằm ở giữa và liên quan đến chức năng tự liên kết; iii) Epstein-Barr virut (EBV) là một loại Vùng C tận (từ axít amin 187 - 386): chứa Herpesvirut thuộc họ Herpesviridae, tồn 200 axít amin, có chức năng kích hoạt tại trong cơ thể người và thường không các con đường dẫn truyền tín hiệu chính gây ra các triệu chứng lâm sàng. EBV có gây chuyển dạng và thay đổi kiểu hình tế tỷ lệ nhiễm cao trong cộng đồng và hầu bào lympho B. Nếu loại bỏ đoạn này của như tất cả mọi người đến tuổi trưởng thành LMP-1, sẽ làm EBV mất khả năng gây đều có khả năng mang EBV (Adham và CS, biệt hóa tế bào lympho B. Kỹ thuật phân 2012; Ai và CS, 2012; Young, Rickinson, tích gen xác định được ba vùng chức 2004). Trạng thái nhiễm tiềm tàng EBV năng riêng biệt trong đầu tận cùng C của là hiện tượng đặc trưng ở loại virut này, LMP-1 gọi là CTAR (C-terminal activator khi gặp điều kiện thuận lợi, chúng chuyển regions), bao gồm CTAR1, CTAR2 và sang dạng hoạt động và làm tăng nguy CTAR3 (Young, Rickinson, 2004). cơ mắc một số bệnh như ung thư dạ dày, EBV được phân chia thành 7 nhánh UTVMH và u lympho Burkitt (Kondo và chính đại diện 7 nhóm di truyền, bao gồm CS, 2012). Raji, China 1, China 2, Alaska, Med+, Med- Nhiễm tiềm tàng EBV là hiện tượng (Mediterranean) và NC (North Carolina), khởi đầu cho quá trình tiến triển ung thư phân lập theo vùng địa lý, nhưng hiện nay (Kondo và CS., 2012). Sự truyền nhiễm có xu hướng xâm nhập xuyên quốc gia EBV chủ yếu đặc trưng bởi biểu hiện của (Mainou, Raab-Traub, 2006). những gen tiềm tàng, bao gồm EBNA-1, Bài báo này trình bày quá trình giải LMP-1, LMP-2 và EBER (Junker, 2005). trình tự, thu nhận chuỗi nucleotid, phân Trong các gen và protein ảnh hưởng đến tích đặc điểm khung gen LMP-1 và thu sự tiến triển thành ung thư, LMP-1 có vai nhận chuỗi gen ARN thông tin của 34 trò đặc biệt quan trọng, được chứng minh chủng EBV phân lập từ BN UTVMH ở có khả năng đơn phương gây ung thư Việt Nam. Trình tự nucleotid, đặc điểm trên chuột thực nghiệm (Shair và CS, cấu trúc phân tử gen LMP-1 và mối quan 2008). LMP-1 chính là gen tiềm ẩn đầu hệ nguồn gốc phả hệ của 34 chủng dựa tiên của EBV được phát hiện có chức vào dữ liệu gen ARN thông tin LMP-1 năng chuyển đổi và thay đổi kiểu hình của cũng được xây dựng, so với các chủng dòng tế bào lympho B. thế giới nhằm xác định phân nhánh của Sản phẩm ARN thông tin của LMP-1 là EBV Việt Nam. kết quả ghép-nối (splicing) của 3 chuỗi ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP exon 1, 2 và 3, chịu trách nhiệm tổng hợp NGHIÊN CỨU protein LMP-1 (Ai và CS., 2012). Protein 1. Đối tƣợng nghiên cứu. LMP-1 có phân tử lượng 63 kDa, cấu tạo từ khoảng 386 axít amin, chia thành 3 34 chủng EBV phân lập từ mô sinh vùng: i) Vùng N tận (từ axít amin 1 - 23): có thiết khối u của 64 mẫu bệnh phẩm từ BN vai trò gắn phần gốc của protein LMP-1 UTVMH (đã được chẩn đoán xác định 21
3. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ PHỤ TRƢƠNG 2014 dựa vào triệu chứng lâm sàng và kết quả gen của EBV theo hướng dẫn của nhà giải phẫu bệnh lý) tại Bệnh viện Tai Mũi sản xuất. Đo hàm lượng ADN bằng quang Họng TW. phổ kế (Spectrophotometer). 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. * Thực hiện phản ứng PCR đối với gen * Tách chiết ADN tổng số: LMP-1: Sử dụng bộ kit tách chiết ADN tổng số Thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi (Hãng BIONEER, Hàn Quốc) hoặc QIAGEN LMP1-F và LMP1-R để phát hiện gen (Mỹ) để tách chiết ADN tổng số chứa hệ LMP-1 có mặt trong các mẫu UTVMH (bảng 1). Sản phẩm thu được sẽ được giải gen của EBV từ 64 mẫu bệnh phẩm trình tự trực tiếp hoặc sau khi dòng hóa. UTVMH. Tách chiết và tinh sạch ADN hệ Bảng 1: Trình tự nucleotid cặp mồi LMP1-F/LMP1-R và điều kiện phản ứng PCR. Tªn måi Tr×nh tù nucleotid (5’>3’) ®iÒu kiÖn PCR LMP1-F ATGGAACGCGACCTTGAGAG 940C 5 phút, 35 chu kỳ gồm các bước: 940C 1 phút, 0 0 0 LMP1-R TTAGTCATAGTAGCTTAGCTGAAC 55 C 1 phút, 72 C 1 phút, 72 C 10 phút. * Dòng hoá sản phẩm, tách dòng, giải trình và phân tích trình tự: Sản phẩm PCR đoạn gen LMP-1 của các mẫu sau khi tinh sạch được dòng hoá vào plasmid vector pCR2.1 (Invitrogen Inc.). Chọn lọc khuẩn lạc và tách chiết ADN plasmid tái tổ hợp theo quy trình của Hãng Bioneer (Hàn Quốc). Trình tự nucleotid của ADN của plasmid tái tổ hợp mang khung gen LMP-1 được giải trình trên máy tự động ABI-3100 Genetic Analyzer. Xử lý chuỗi nucleotid bằng các chương trình SeqEd1.03, AssemblyLIGN1.9, MacVector 8.2 (Accelrys Inc.) và so sánh đối chiếu bằng chương trình GENEDOC2.6, xác lập cây phả hệ bằng chương trình MEGA5.0 (Tamura và CS, 2011). KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 1. Kết quả phân tích đặc điểm gen LMP-1. Toàn bộ 64 mẫu mô sinh thiết UTVMH được tách chiết ADN tổng số. Sử dụng ADN tổng số này làm khuôn để chạy PCR với cặp mồi LMP1-F và LMP1-R (bảng 1). Kết quả: 34/64 mẫu cho sản phẩm PCR chứa toàn bộ gen LMP-1, 30 mẫu còn lại không phát hiện được LMP-1 (phản ứng PCR âm tính) (hình 1). Hình 1: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR gen LMP-1 với cặp mồi LMP1-F/LMP1-R của một số mẫu UTVMH trên thạch agarose 1%. (Ghi chú: M: chỉ thị phân tử ADN (ở đây sử dụng hệ gen Lamda cắt bằng enzym giới 22
4. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ PHỤ TRƢƠNG 2014 hạn HindIII); (-): Đối chứng âm; (+): Đối chứng dương; Các mẫu ký hiệu S5, S7, S11, S16, H2, S9, S18, H9,S1, B4, B5, B6, B9, B10, B12, E61, H12, M12, M14: sản phẩm PCR của các mẫu UTVMH tương ứng). Sản phẩm PCR của 34 mẫu EBV được và 3 xác định trước và sau intron 1 và dòng hóa và giải trình tự để phân tích đặc intron 2. Đối với exon 3, trình tự nucleotide điểm cấu trúc gen LMP-1 cũng như phân tích biến đổi giữa các chủng. Đây là đặc điểm nguồn gốc phả hệ. Xác định giới hạn exon cần khai thác để phân tích biến đổi di và intron bằng phương pháp so sánh đối truyền (phân tử) giữa các chủng. Với chiếu chuỗi nucleotid của toàn bộ khung phương pháp xác định như vậy, chúng tôi gen LMP-1 với ARN thông tin của một chủng tiến hành thu thập chuỗi nucleotid exon Trung Quốc, chủng China 1 (AY337723), của từng chủng và ghép lại để thu nhận có độ dài 1.116 bp. Khi đối chiếu, phần toàn bộ chuỗi nucleotid của ARN thông tin intron 1 và intron 2, sẽ được xác định dựa từng chủng. Kết quả tổng hợp cấu trúc trên khoảng trống tạo ra giữa chuỗi gen và protein LMP-1 của chủng EBV nucleotid của các chủng và phần exon 1, 2 Việt Nam được trình bày ở bảng 2. Bảng 2: Đặc điểm cấu trúc gen và protein LMP-1 của 34 chủng EBV Việt Nam. ®é dµi Ký N•íc/ Toµn bé ®é dµi ARN ®é protein ®é dµi ®é dµi ®é dµi E2 ®é dµi hiÖu L·nh thæ khung th«ng tin dµi E3 LMP1 E1 (bp) I1 (bp) (bp) I2 (bp) chñng ph©n lËp gen (bp) (bp) (bp) (aa) BC4 Việt Nam 1271 1116 364 268 78 87 77 761 BC5 Việt Nam 1303 1148 377 268 78 87 77 793 BC6 Việt Nam 1270 1116 364 268 78 87 76 761 EB4 Việt Nam 1301 1146 375 268 78 87 77 791 EB8 Việt Nam 1304 1149 375 268 78 87 77 794 EB9 Việt Nam 1334 1179 386 268 78 87 77 824 EB10A Việt Nam 1304 1149 375 268 78 87 77 794 EB10B Việt Nam 1304 1149 375 268 78 87 77 794 EB61 Việt Nam 1304 1149 375 268 78 87 77 794 EB102 Việt Nam 1304 1149 375 268 78 87 77 794 EB103 Việt Nam 1304 1149 375 268 78 87 77 794 HN2 Việt Nam 1337 1182 387 268 78 87 77 827 HN9 Việt Nam 1271 1116 364 268 78 87 77 761 HN11 Việt Nam 1303 1149 376 268 78 87 76 794 HN12 Việt Nam 1304 1149 375 268 78 87 77 794 HP1 Việt Nam 1301 1146 375 268 78 87 77 791 HP2 Việt Nam 1304 1149 375 268 78 87 77 794 8
5. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ PHỤ TRƢƠNG 2014 HP3 Việt Nam 1304 1149 375 268 78 87 77 794 HP6 Việt Nam 1271 1116 364 268 78 87 77 761 MT7 Việt Nam 1333 1179 387 268 78 87 76 824 MT8 Việt Nam 1299 1146 375 268 76 87 77 791 (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) MT9 Việt Nam 1304 1149 375 268 78 87 77 794 MT10 Việt Nam 1301 1146 375 268 78 87 77 791 MT12 Việt Nam 1301 1146 375 268 78 87 77 791 MT14 Việt Nam 1303 1148 374 268 78 87 77 793 S1 Việt Nam 1238 1083 353 268 78 87 77 728 S5 Việt Nam 1304 1149 375 268 78 87 77 794 S7 Việt Nam 1268 1113 364 268 78 87 77 758 S9 Việt Nam 1271 1116 364 268 78 87 77 761 S11 Việt Nam 1337 1182 387 268 77 87 77 827 S16 Việt Nam 1334 1179 386 268 78 87 77 824 S17 Việt Nam 1304 1149 374 268 78 87 77 794 S18 Việt Nam 1300 1146 375 268 78 87 76 791 S20 Việt Nam 1303 1149 376 268 78 87 76 794 (Ghi chú: ký hiệu in đậm: các chủng EBV trong nghiên cứu; E: exon; I: Intron). Toàn bộ khung gen LMP-1 của 34 chuỗi nguồn gốc của chủng EBV được phân lập nghiên cứu có kích thước dao động từ trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng 1.238 - 1.337 bp, exon 1: 268 bp, itron 10 chủng EBV đã đăng ký trong Ngân 1: 76 - 78 bp, exon 2: 87 bp, intron 2: hàng Gen, bao gồm các chủng đại diện 76 - 77 bp và exon 3: 728 - 827 bp. Âu -Mỹ (Raji, Alaska, Med-, Med+, NC), Từ đó, ARN thông tin sau khi ghép 3 exon một số chủng đại diện phân lập ở các với nhau, có độ dài từ 1.083 - 1.182 bp nước châu Á (China 1, China 2) và một mã hóa cho protein LMP-1 là 353 - 387 a.a số chủng của Việt Nam (NPC1, NPC2, suy diễn. NPC3). Kết quả cho thấy: 2. Kết quả phân tích mối quan hệ - Nhóm I: gồm phần lớn các chủng phả hệ nguồn gốc của EBV dựa vào EBV trong nghiên cứu (20/34), bao gồm trình tự gen LMP-1. các chủng phân lập ở miền Bắc (ký hiệu Bằng chương trình GENEDOC 2.6 và là HN, EB và HP), miền Trung (ký hiệu là MEGA 5.0, ARN thông tin của gen LMP-1 MT) và miền Nam (ký hiệu là S) thuộc (nucleotid và axít amin) các chủng Việt về nhóm chủng di truyền China 1 (Trung Nam và thế giới được sử dụng để phân Quốc) cùng với một chủng Việt Nam tích phả hệ và xác lập mối quan hệ của nghiên cứu trước đây (NPC1, NPC2, chúng. Để phân tích mối quan hệ phả hệ NPC3). 23
6. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ PHỤ TRƢƠNG 2014 - Nhóm II: 9/34 chủng thuộc về nhóm cứu này với 7 chủng quốc tế (Raji, Alaska, các chủng China 2, Alaska và NC. Med -, Med+, NC, China 1, China 2), kết - Nhóm III: 5/34 chủng thuộc về nhóm quả cho thấy mức độ đồng nhất trung bình các chủng Med+ và Med-. cao nhất với chủng China 1 (gần 95% về nucleotid và 94% về axít amin). Bên cạnh Mặt khác, trình tự nucleotid của 34 đó, 34 chủng nghiên cứu đều có sự đồng chủng trong nghiên cứu này cùng với 10 nhất cao với 3 chủng khác của Việt Nam chủng sử dụng tham khảo đưa vào chương (NPC1, NPC2, NPC3) đã đăng ký trong trình GENEDOC 2.6 để phân tích đồng Ngân hàng Gen: > 94% về nucleotid và nhất (identity) về thành phần nucleotid khoảng 93% về axít amin (tương đương và tương đồng (homology) về axít amin. với chủng China 1). Khi so sánh giữa 34 chủng trong nghiên LMP-1 nucleotid LMP-1 axít amin 24
7. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ PHỤ TRƢƠNG 2014 Hình 2: Mối quan hệ nguồn gốc phả hệ giữa các chủng EBV Việt Nam và thế giới trên cơ sở trình tự ARN thông tin chuỗi gen LMP-1 về thành phần nucleotid và amino axít. (Ghi chú: Sử dụng chương trình MEGA5.0 (phương pháp kết nối liền kề NJ, neighbour-joining, sử dụng độ tin cậy 1000 bootstrap). Chỉ số trên các nhánh biểu hiện độ tin cậy của phương pháp; các chủng của thế giới đại diện cho các nhánh di truyền của EBV được đóng khung). KẾT LUẬN 4. Kondo S, Wakisaka N, Muramatsu M et - Kích thước toàn bộ khung gen LMP-1 al. Epstein-Barr virus latent membrane protein 1 induces cancer stem/progenitor-like cells in của 34 chuỗi nghiên cứu là 1.238 - 1.337 nasopharyngeal epithelial cell lines. Virology bp, từ đó, ARN thông tin có độ dài 1.083 - Journal. 2012, 85 (21), pp.11255-11264. 1.182 bp, protein LMP-1 là 353 - 387 a.a, 5. exon 1 là 268 bp, itron 1 là 76 - 78 bp, Shair HY, Schnegg CI and Traub NR. Epstein-Barr virut latent membrane protein-1 exon 2 là 87 bp, intron 2 là 76 - 77 bp và effects on plakoglobin, cell growth and migration. exon 3 là 728 - 827 bp. Cancer Res. 2008, 68 (17), pp.6997-7005. - Trong số 34 chủng nghiên cứu tham 6. Young LS and Rickinson AB. Epstein- gia xây dựng phả hệ, 20/34 chủng thuộc Barr virus: 40 years on. Nature Review. 2004, 4, về nhóm I gồm các chủng di truyền China 1; pp.757-768. 9/34 thuộc về nhóm các chủng di truyền 7. Mainou BA, Raab-Traub N. LMP1 strain China 2, Alaska và NC; 5/34 thuộc về variants: biological and molecular properties. nhóm các chủng di truyền Med+ và Med-. J Virol. 2006, 80 (13), pp.6458-6468. - 34 chủng nghiên cứu có mức độ 8. Tamura K, Peterson D, Peterson N, đồng nhất cao nhất cả về nucleotid và Stecher G, Nei M, Kumar S). MEGA5: molecular axít amin với chủng China 1 (Trung Quốc) evolutionary genetics analysis using maximum và 3 chủng khác của Việt Nam (NPC1, likeli-hood, evolutionary distance and maximum NPC2, NPC3). parsimony methods. Mol Biol Evol. 2011, 28, pp.2731-2739. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Adham M, Kurniawan AN et al. Nasopharyngeal carcinoma in Indonesia: epidemiology, incidence, signs and symptoms at presentation. Chin J Cancer. 2012, 31 (4), pp.185-196. 2. Ai J, Xie Z, Liu C, Huang Z and Xu J. Analysis of EBNA-1 and LMP-1 variants in diseases associated with EBV infection in Chinese children. Virology Journal. 2012, 9 (13), pp.1.743-1.751. 3. Junker AK. Epstein-Barr Virus. Pediatrics in Review. 2005, 26 (3), pp.79-84. 8
8. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ PHỤ TRƢƠNG 2014 26