Phân lập tế bào gốc từ màng ối người: Tác dụng của một số enzym phân cắt mễ và biểu hiện dấu ấn oct-4 của tế bào gốc màng ối

Nội dung text: Phân lập tế bào gốc từ màng ối người: Tác dụng của một số enzym phân cắt mễ và biểu hiện dấu ấn oct-4 của tế bào gốc màng ối

1. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2012 PHÂN LẬP TẾ BÀO GỐC TỪ MÀNG ỐI NGƯỜI: TÁC DỤNG CỦA MỘT SỐ ENZYM PHÂN CẮT Mễ VÀ BIỂU HIỆN DẤU ẤN OCT-4 CỦA TẾ BÀO GỐC MÀNG ỐI Phạm Văn Trân*; Đỗ Minh Trung**; Nguyễn Bảo Trân** Dương Thị Tuyết***; Nguyễn Văn Hòa****; Trần Ngọc Tuấn** TÓM TẮT Tế bào gốc (TBG) là những tế bào chưa biệt hoá, có khả năng trở thành tế bào chuyên biệt và có chức năng mới tương ứng. Tiến hành phân lập tế bào bằng trypsin, collagenase B, percoll với tỷ trọng khác nhau. Xác định TBG bằng dấu ấn OCT-4. Kết quả: quy trình tách phân lập TBG từ màng ối đạt hiệu quả cao, tế bào thu được có biểu hiện dấu ấn của TBG. * Từ khóa: Màng ối;Tế bào gốc; Trypsin; Collagenase B; Hyaluronidase. Role of proteases during isolation of amniotic membrane stem cells and expression of OCT-4 by these cells summary The amniotic membrane stem cell can differentiate into different mature cells. We isolated stem cell by trypsin, percoll and characterised its by marker OCT-4. Results: Protocol for isolation of stem cells from amniotic membrane had high efficiency. Amniotic membrane stem cells collected express OCT-4, stem cell markers. Amniotic stem cells can be isolated from amniotic membrane by trypsin, collagenase B and percoll. * Key words: Amniotic membrane; Stem cells; Trypsin; Collagenase B; Hyaluronidase. ĐẶT VẤN ĐỀ mầm phôi (Embryonic germ cells), TBG thai (Foetal stem cells), TBG trưởng thành Tế bào gốc là tế bào nền móng của tất (Adult stem cells/Somatic stem cells). Dựa cả tế bào, mô và cơ quan trong cơ thể, đây vào đặc tính hay mức độ biệt hoá, TBG là những tế bào chưa biệt hoá, nhưng có được chia thành: TBG toàn năng hay TBG khả năng trở thành tế bào chuyên biệt và có thủy tổ (totipotent stem cells), TBG vạn chức năng mới tương ứng [1, 2]. Dựa vào năng (pluripotent stem cells), TBG đa năng nguồn gốc, TBG được phân chia thành 4 (multipotent stem cells), TBG đơn năng loại: TBG phôi (Embryonic stem cells) và tế bào (mono/unipotential progenitor cells). * Bệnh viện 103 * Học viện Quân y ** Bệnh viện Bạch Mai *** Viện 17 Phản biện khoa học: GS. TS. Hoàng Văn Lương 57
2. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2012 TS. Lê Văn Đông Màng ối là một sản phẩm thường bỏ đi ối có kích thước 1 cm2 vào các tuýp 50 ml trong quá trình sinh nở, là một nguồn cung chứa enzym phân cắt mô trypsin 0,02%, cấp TBG lý tưởng [3]. Sử TBG màng ối collagenase B 0,1%, hyaluronidase 0,1% [5, không gặp phải những vấn đề về đạo đức, 6]. Để tuýp ở nhiệt độ 37oC cho tới khi các xã hội [4]. TBG phân lập từ màng ối có tính mảnh màng ối tan rã hoàn toàn. Lọc dung sinh miễn dịch thấp, không có khả năng ung dịch qua màng lọc có kích thước lỗ lọc 100 thư hóa và có khả năng biệt hóa thành μm. Ly tâm với percoll 40,8% và 50,8% nhiều loại tế bào khác nhau. Vì vậy, chúng (Sigma, Việt Nam) để thu khối tế bào có tôi tiến hành đề tài với mục tiêu: Nghiên tỷ trọng khác nhau [5, 6]. Nuôi cấy tế bào cứu quy trình phân lập, nuôi cấy tăng sinh thu được trong môi trường DMEM có bổ TBG từ màng ối người, phục vụ cho nghiên sung thêm penicillin (50 U/ml), streptomycin cứu và điều trị. (50 µg/ml), L-glutamin (2 x 10-3M), huyết thanh bào thai bê (10%), đồng thời cấy VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP chuyển tế bào 2 tuần/lần để duy trì trong NGHIÊN CỨU phòng thí nghiệm. - Bảo quản TBG màng ối trong điều kiện 1. Vật liệu nghiên cứu. lạnh âm sâu (-1960C) trong môi trường DMEM * Thiết bị: có 10% DMSO. 0 - Tủ ấm nuôi cấy tế bào 37 C, 5% CO2 (Forma, Mỹ). 3. Kỹ thuật RT-PCR xác định biểu hiện - Tủ hotte vô trùng (Sanyo, Nhật), máy ly của ARN thông tin. tâm lạnh. Tách chiết ARN tổng số từ các tế bào - Kính hiển vi đối pha có gắn hệ thống (Kit-Qiagen), sau đó tổng hợp cADN từ ARN truyền hình ảnh kết nối với máy tính (Olympus tổng số (Kit-Fermentas). Phản ứng PCR định 30, Nhật). lượng thực hiện trên máy LightCycler 1.5 ® - Dụng cụ tiêu hao: màng lọc 100 μm, (Roche Diagnostics) sử dụng kít QuantiTect ® pipette 1 ml, 5 ml, 10 ml, đĩa petri đường kính SYBR Green PCR (Qiagen). 10 cm, 6 cm. Bảng 1: Các mồi dùng để chạy RT-PCR. * Hóa chất: - Dung dịch dung phân lập tế bào: trypsin, Sens : 5'-TGAGAAACGGCTACCACATC-3' 18S rARN collagenase B, hyaluronidase, percoll (Sigma, Anti-sens : 5'-TTACAGGGCCTCGAAAGAGT-3' Việt Nam), PBS. Oct-4 octamer- Sens : 5'-AGGTGTTCAGCCAAACGACC-3' - Môi trường nuôi cấy: DMEM-Dulbecco's binding transcription Anti-sens : 5'-TGATCGTTTGCCCTTCTGGC-3' Modified Eagle Medium (Gibco); soybean factor 4 trypsin inhibitor (Gibco); huyết thanh bào thai bê (Gibco); axít amin không cần thiết Sau khi làm biến tính cADN 15 phút ở (Gibco), penicillin, streptomycin. 95°C, thực hiện 40 - 50 chu kỳ PCR (15 giây: 95°C, 25 giây: 58°C và 20 giây: 72°C). 2. Quy trình phân lập TBG từ màng ối. Điện di sản phẩm PCR trên gel arcrylamid. 30 màng ối của sản phụ mổ đẻ, bảo đảm Tính toán nồng độ ARNtt của dấu ấn OCT-4 tiêu chuẩn xét nghiệm sàng lọc âm tính với dựa trên nồng độ ARNtt của gen 18S. HIV, HBV, HCV, HTLV và giang mai được sử dụng để phân lập tế bào. Vận chuyển 4. Kỹ thuật hóa miễn dịch tế bào. màng ối trong dung dịch PBS vô khuẩn về Cố định tế bào trên đĩa nuôi cấy bằng trung tâm nghiên cứu. Cho các mảnh màng etanol 98%, sau đó được ủ với kháng thể thứ 10
3. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2012 nhất kháng OCT-4. Kháng thể thứ hai gắn với Sau khi phân lập, nuôi cấy tế bào màng chất huỳnh quang. Quan sát tế bào và chụp ối trong đĩa plastic. Sau 24 giờ, các TBG hình ảnh trên kính hiển vi huỳnh quang. bám dính vào bề mặt đáy đĩa nuôi cấy, TBG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU màng ối có hình tròn hoặc hình đa diện. Sau 2 - 3 ngày, tiến hành thay môi trường 1. Phân lập và nuôi cấy tăng sinh TBG màng ối. và kiểm tra tình trạng phát triển của TBG. Các enzym khác nhau có thời gian tác Sau 2 tuần nuôi cấy, mật độ tế bào phát dụng khác nhau lên quá trình phân rã các triển bao phủ 50 - 60% bề mặt đĩa nuôi cấy, mảnh màng ối, giải phóng tế bào. tiến hành cấy chuyển nhằm tạo không gian Bảng 2: Thời gian tác dụng của enzym cho TBG phát triển và nuôi cấy sang môi phân cắt mô. trường đặc biệt để biệt hóa TBG thành các loại tế bào khác nhau. (phút) 2. BiÓu hiÖn dÊu Ên OCT-4 cña TBG Trypsin 0.2% 45 ± 10 màng èi. Collagenase B 0,1% 50 ± 10 Kết quả PCR cho thấy, TBG có biểu hiện Trypsin 0.2% + collagenase B 0,1% 20 ± 10 dấu ấn OCT-4, phù hợp với kết quả nhuộm (tỷ lệ 1:1) hóa miễn dịch tế bào với kháng thể kháng Hyaluronidase 0,6% Không tác dụng OCT-4 của người. A B C DAPI OCT-4 MERGE Hình 1: Biểu hiện dấu ấn OCT-4. A, B, C: Hình ảnh tế bào nhuộm hóa miễn dịch với OCT-4. D: Hình ảnh điện 335 di sản phẩm PCR của OCT-4. 3 mẫu TBG màng ối khác bp nhau cho vào 3 giếng điện di đánh số 1, 2, 3. D 60
4. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2012 BÀN LUẬN từ màng ối bằng enzym. Các vị trí trên màng ối thu được nhiều tế bào nhất là vị trí 1. Quy trình phân lập và nuôi cấy tăng gần trung tâm màng ối gần cuống rốn, còn sinh TBG màng ối. vị trí vùng rìa càng xa cuống rốn, thu được Để thu được tế bào có khả năng sống ít tế bào hơn. tốt trong môi trường nuôi cấy, cần phân lập 2. Định danh TBG màng ối. tế bào trong 4 giờ kể từ khi mổ lấy thai. Nếu để sau 4 giờ mới bóc tách và phân lập tế - Các tế bào màng ối biểu hiện nhiều bào, tỷ lệ nuôi cấy tế bào phát triển kém và marker TBG như octamer-binding transcription dễ bị nhiễm khuẩn, nhiễm nấm. factor 4 (OCT-4), GATA-4, hepatocyte nuclear Về phân tách TBG từ màng ối bằng factor-3β (HNF-3β) [7, 8]. Những yếu tố enzym: nếu chỉ phân cắt màng ối bằng này cho thấy không chỉ TBG biểu mô màng trypsin, số lượng tế bào thu được thấp và ối, mà còn cả TBG trung mô màng ối cũng thời gian phải kéo dài, có khi mất 60 phút là TBG đa tiềm năng [9]. Chúng tôi định các tế biểu mô màng ối mới bị phân cắt hết. danh TBG màng ối bằng quan sát trực tiếp Nếu cho thêm collagenase B vào trypsin, trên kính hiển vi đảo ngược, sau đó tiến số lượng tế bào thu được sẽ nhiều hơn và hành các phản ứng RT-PCR, hóa miễn dịch thời gian tan rã màng ối sẽ nhanh hơn. tế bào để phát hiện marker của TBG. Trong Hyaluronidase hầu như không có tác dụng khuôn khổ của đề tài, chúng tôi chỉ xác định phân rã màng ối, mặc dù đã có một số tác biểu hiện của marker OCT-4, là marker biểu giả trên thế giới dùng enzym này để phân hiện tính gốc của tế bào. lập tế bào từ các mô liên kết (bảng 2). Việc xác định tính gốc của TBG màng ối TBG được nuôi cấy trong đĩa plastic đường bằng OCT-4 đã được nhiều tác giả sử dụng. kính 10 cm, với môi trường DMEM glucose Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã xác định cao có thêm 10% FBS + 1% penicilline- sự thay đổi của marker OCT-4 trong quá streptomycine + 1% L-glutamate, trong tủ O trình nuôi cấy. Kết quả cho thấy, marker nuôi cấy HEPA-NUAIRE ở 37 C, không khí OCT-4 giảm dần theo thời gian. Trong thời có 5% CO , độ ẩm bão hòa. Ngay sau khi 2 gian nuôi cấy TBG màng ối, mặc dù đã cố nuôi cấy 24 giờ, c¸c TBG màng ối có xu gắng đảm bảo những điều kiện tốt nhất cho hướng bám dính vào bề mặt đĩa nuôi cấy, nuôi cấy, như thời gian phân lập TBG từ phát triển thành những cụm tế bào hình tròn màng ối, phòng nuôi cấy tế bào luôn được và có kích thước trung bình. Sau 2 tuần vệ sinh tiệt khuẩn, môi trường nuôi cấy thích nuôi cấy, mật độ tế bào phát triển bao phủ hợp, tủ nuôi cấy có nhiệt độ 370C, CO 5% khoảng 50 - 60% bề mặt đĩa nuôi cấy, cấy 2 luôn ổn định, bảo đảm vô trùng, nhưng cũng chuyển nhằm cung cấp đủ chất dinh dưỡng và đảm bảo không gian cho tế bào tăng chỉ nuôi cấy TBG màng ối được trong khoảng sinh. Kết quả nuôi cấy và môi trường nuôi 30 - 40 ngày. cấy cũng tương tự như kết quả các nghiên cứu khác. KẾT LUẬN Trong nghiên cứu của chúng tôi, với 30 Sử dụng enzym phân cắt mô trypsin 0,2% mẫu màng ối, đã phân lập thành công TBG và collagenase B 0,1% (tỷ lệ 1:1) cho hiệu 61
5. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2012 quả tối ưu trong quá trình phân lập tế bào 5. Toshio Miki, Keitaro Mitamura, Mark A. từ màng ối. Đã thành công trong xây dựng Ross, Donna B. Stolz, Stephen C. Strom. quy trình phân lập tế bào từ màng ối người Identification of stem cell marker-positive cells by immunofluorescence in term human amnion. và nuôi cấy tăng sinh được TBG màng ối Journal of Reproductive Immunology. 2007, 75, trong môi trường DMEM glucose cao có pp.91-96. thêm 10% FBS và penicilline-streptomycine 6. Toshio Miki, Thomas Lehmann, Hongbo thành công. TBG màng ối người biểu hiện Cai, Donna B. Stolz, Stephen C. Stroma. Stem dấu ấn OCT-4. cell characteristics of amniotic epithelial cells. Stem Cells. 2005, 23, pp.1549-1559. TÀI LIỆU THAM KHẢO 7. Anna M. Wobus et al. Embryonic stem cell as a model to study cardiac, skeletal muscle, 1. Trần Văn Bé. Tình hình ghép TBG tại TP. and vascular smooth muscle cell differentiation. Hồ Chí Minh Việt Nam. Y học Việt Nam, số Method in Molecular Biology. 2002, 184, pp.127-155. 5/2006, tr.1-4. 8. Ben Num IF, Benvenisty. Human embryonic 2. Nguyễn Thị Thu Hà. TBG và ứng dụng stem cells as cellular model for human disorder. trong y sinh học. Tạp chí Nghiên cứu Y dược Mol Cell Endocrinol. 2006. học, phụ bản 32. 2004, 6, tr.13-26. 9. Ayaka Toda, Motonori Okabe, Toshiko 3. Phan Kim Ngọc và CS. Thu nhận TBG Yoshida, and Toshio Nikaido. The potential of trung mô đa năng từ máu cuống rốn người. Tạp amniotic membrane/amnion-derived cells for chí Y - Dược học quân sự. 2008, 33 (2), tr.119-124. regeneration of various tissues. J Pharmacol 4. Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc, Trương Sci. 2007, 105, pp.215-228. Định. Công nghệ TBG. Nhà xuất bản Giáo dục Việt Nam. 2009. 62
6. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2012 63