Nuôi cấy và bảo quản đông lạnh tế bào gốc trung mô não bụng chuột

Nội dung text: Nuôi cấy và bảo quản đông lạnh tế bào gốc trung mô não bụng chuột

1. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Nguyễn Phúc Hoàn*; Nguyễn Thị Bình*; Nguyễn Mạnh Hà* TÓM TẮT Nghiên cứu được tiến hành nhằm nuôi cấy tăng sinh và bảo quản lạnh tế bào gốc não giữa phôi chuột cống trắng để tạo nguồn nơ ron tiết dopamin phục vụ điều trị bệnh Parkinson thực nghiệm. Các tế bào gốc sàn não giữa phôi chuột cống trắng 12,5 - 13,5 ngày tuổi được phân lập và nuôi cấy trong môi trường cơ bản (DMEM/F12; 1:1) có bổ sung b-FGF2, EGF và một số yếu tố tăng trưởng khác. Bảo quản lạnh các tế bào bằng môi trường cơ bản có bổ sung 10% DMSO. Sau 4 - 8 ngày nuôi cấy, thu được các nơ ron, tế bào sao, tế bào ít nhánh. Đa số tế bào này dương tính với marker vimentin và một số nơ ron dương tính với marker thyroxin hydroxylase (TH) khi nhuộm hóa mô miễn dịch. Tỷ lệ sống của tế bào sau bảo quản lạnh 64,9%. * Từ khoá: Tế bào gốc ngoại bì thần kinh não giữa; Nuôi cấy; Bảo quản lạnh. Culture and Cryopreservation of Rat Ventral Mesencephalic Stem Cells Summary The aim of this research was to culture and cryopreserve rat ventral mesencephalon cells to treat Parkinson’s diseases in rat. We have isolated rat ventral mesencephalic cells from rat embryonic days 12.5 - 13.5, then cultured them in the basic medium culture composed of DMEM/F12; 1:1, supplemented with b-FGF2, EGF and growth factors. Then, harvest cells were cryopreserved in media with 10% DMSO. Neuron, astrocyte, oligocyte expressed after 4 - 8 days in in vitro culture, some of them were positive with vimentine, TH by immunohistochemistry staining. Survival cell rate after being frozen was 64,9%. * Keywords: Ventral mesencephalic stem cells; Culture; Cryopreservation. ĐẶT VẤN ĐỀ thành công công nghệ bảo quản lạnh tế bào gốc từ tủy xương, tế bào gốc trung Trong những năm gần đây, có nhiều mô hay tế bào gốc phôi thời gian bảo kỹ thuật mới đ và đang được ứng dụng quản lên tới vài chục năm với chi phí rẻ trong tái tạo, sửa chữa hoặc thay thế và kỹ thuật đơn giản. Khi cần người bệnh mô hoặc cơ quan bị tổn thương. Một trong có thể dùng tế bào gốc trên để điều trị các số đó là ứng dụng công nghệ tế bào gốc bệnh như: bỏng, g y xương, teo cơ, tiểu trong trị liệu. Thực tế lâm sàng đ ứng dụng đường, lơxemi, Alzeimer, Parkinson [2]. * Trường Đại học Y Hà Nội Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Phúc Hoàn (phuchoan85@gmail.com) Ngày nhận bài: 25/07/2017; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 30/08/2017 Ngày bài báo được đăng: 01/09/2017 Ý tưởng sử dụng tế bào gốc trong điều ghép tế bào gốc có chức năng tiết dopamin trị bệnh Parkinson đ được bắt đầu từ vào n o động vật thực nghiệm cũng như những năm 1980. Hơn thế nữa, việc cấy trên bệnh nhân Parkinson tình nguyện đ 188
2. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 có được nhiều thành công như: tế bào, nếu thấy tinh trùng, chuột được tính có thai mô sống tốt trong não sau ghép và có khả 0,5 ngày. năng tiết dopamin, cải thiện triệu chứng * Phân lập TBGNBTKNG: bệnh trên lâm sàng. Hiện nay, tế bào gốc thần kinh tiết dopamin được phân lập từ Mổ chuột lấy tử cung chứa phôi, tách nhiều nguồn: tế bào gốc não giữa phôi, tế rời từng phôi và phẫu tích lấy đoạn ống bào gốc phôi giai đoạn sớm (phôi nang) thần kinh chứa não giữa. Tách bỏ lớp hay gần đây là tế bào gốc vạn năng cảm ngoại bì da và màng não, phẫu tích lấy ứng và tế bào gốc cảm ứng tiết dopamin. sàn não giữa, sau đó dùng enzym dispase Trong số này tế bào gốc não giữa phôi và trypsin - EDTA để ly giải mô sàn não và tế bào gốc phôi giai đoạn sớm - phôi giữa. Tạo dịch treo tế bào bằng phương nang - được sử dụng nhiều nhất. Vì vậy, pháp cơ học. Nhuộm dịch treo tế bào bằng song song với việc nuôi cấy để tăng sinh tryphan blue để xác định tỷ lệ tế bào sống số lượng tế bào cần thiết cho cấy ghép, và mật độ tế bào bằng buồng đếm hồng cầu. việc lưu giữ, bảo quản lạnh tế bào rất quan trọng để có sẵn nguồn tế bào và mô * Nuôi cấy TBGNBTKNG: trong điều trị. Các kỹ thuật bảo quản lạnh - Nuôi cấy dịch treo tế bào trong môi không ngừng phát triển, đảm bảo được trường cơ bản: DMEM/F12 (1:1 - invitrogen, chất lượng của tế bào, mô và nâng cao Mỹ) có bổ sung thêm các yếu tố: fetal tỷ lệ sống của tế bào sau một thời gian bovin serum (FBS - invitrogen, Mỹ) 10%; dài lưu giữ [3]. Với mục đích nuôi cấy insulin (25 ng/ml), progesteron (20 nM), tăng sinh và lưu trữ lâu dài nguồn tế putrescin (62 nM), muối selenit (30 nM); bào gốc ngoại bì thần kinh não giữa epithelial grow factor (EGF) 20 ng/ml (TBGNBTKNG), chúng tôi đ tiến hành và basic fibroblast grow factor - 2 (bFGF-2) nghiên cứu này với mục tiêu: Nuôi cấy (20 ng/ml); penicillin (100 IU/ml); streptomycin tăng sinh và bảo quản lạnh thành công TBGNBTKNG phôi chuột cống trắng để (100 µg/ml); amphotericin B (0,25 µg/ml) tạo nguồn nơ ron tiết dopamin. (Sigma, Mỹ). - Cấy TBGNBTKNG phôi chuột với mật ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP độ 1,5 x 104/cm2 trên giếng nuôi cấy NGHIÊN CỨU hoặc trong chai flask, trong tủ ấm 370C, 1. Đối tƣợng nghiên cứu. 5% CO2. Chuột cống đực và cái trưởng thành. - Thay môi trường 2 ngày/lần, đồng 600 phôi chuột cống trắng 12,5 - 13,5 ngày thời đánh giá sự phát triển của tế bào qua tuổi. kính hiển vi soi ngược ở độ phóng đại x10; 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. x20 và x40. * Tạo phôi: * Bảo quản lạnh TBGNBTKNG: Nhốt chuột đực với chuột cái qua một - Tách tế bào sau nuôi cấy khỏi chai đêm. Sáng hôm sau làm phiến đồ âm đạo, flask bằng trypsin - EDTA 0,05%. 190
3. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 - Ly tâm hỗn hợp dịch treo tế bào acetat chì. Đối với kính hiển vi điện tử 1.500 vòng/phút trong 5 phút; lấy cặn và quét: khử nước, phủ vàng. Các mẫu tế rửa lại 3 lần bằng môi trường cơ bản. bào được kiểm tra trên kính hiển vi - Bổ sung thêm môi trường cơ bản, điện tử. đếm mật độ tế bào bằng buồng đếm hồng - Hóa mô miễn dịch: cố định các tế bào cầu và nhuộm tryphan blue đánh giá tỷ lệ bằng PFA 4% trong 20 phút. Rửa nhiều tế bào sống. lần bằng PBS. Sau đó nhuộm bằng các - Bảo quản lạnh mẫu dịch treo tế bào marker vimentin hoặc TH (kháng thể 1), 0 trong môi trường nuôi cấy có bổ sung ủ mẫu ở nhiệt độ 4 C qua đêm. Sau đó 10% DMSO. tiếp tục phủ kháng thể 2 gắn huỳnh quang. - Hạ nhiệt độ theo chương trình bằng Soi và chụp ảnh mẫu tế bào trên kính hiển máy Minicool 10 (Air liquide, Pháp). vi huỳnh quang. - Bảo quản lạnh tế bào trong hơi nitơ * Chỉ tiêu nghiên cứu: lỏng, ở nhiệt độ -1960C. - Tỷ lệ mọc mẫu sau nuôi cấy. * Rã đông tế bào: - Tế bào phát triển theo thời gian. - Lấy tế bào từ bình nitơ và ngâm vào - Hình thái vi thể tế bào sau nuôi cấy. cốc nước ấm 370C trong 15 phút. - Hình thái siêu vi các tế bào sau nuôi - Dung dịch tế bào được rửa sạch chất cấy. bảo quản bằng môi trường nuôi cấy 3 lần. - Sự hiện diện của marker vimentin và - Nhuộm tryphan blue phần cặn tế bào TH trong tế bào sau nuôi cấy. thu được để đánh giá tỷ lệ sống. - Tỷ lệ sống của tế bào sau bảo quản * Định danh các tế bào sau nuôi cấy: lạnh. - Nhuộm Giemsa: cố định các tế bào - Tỷ lệ mọc mẫu tế bào sau bảo quản sau nuôi cấy bằng cồn ethylen 1000 trong lạnh. 5 phút. Sau đó nhuộm bằng dung dịch * Thời gian và địa điểm nghiên cứu: Giemsa 3 phút. Rửa nhiều lần bằng nước Nghiên cứu được tiến hành từ tháng cất, để khô và đánh giá hình thái vi thể 10 - 2014 đến 12 - 2016 tại Bộ môn Mô dưới kính hiển vi quang học. phôi, Trường Đại học Y Hà Nội và Phòng - Cấu trúc hình thái siêu vi thể: kỹ thuật Kính hiển vi Điện tử, Viện Vệ sinh Dịch tễ hiển vi điện tử xuyên và quét: cố định bằng TW. glutaraldehyt 2,5%, hậu cố định bằng axít * Đạo đức nghiên cứu: osmic 1%. Đối với kính hiển vi điện tử xuyên: Nghiên cứu đ được Hội đồng Đạo đức khử nước, chuyển, đúc khối, cắt lát mỏng Trường Đại học Y Hà Nội thông qua. 300 - 400 µm, nhuộm bằng uranyl và KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 191
4. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Từ tháng 10 - 2014 đến 8 - 2016, chúng tôi đ phẫu tích được 600 phôi chuột, thu được 600 mảnh mô sàn não giữa. Trong đó, 562 mảnh mô phân lập thành dịch treo tế bào để nuôi cấy. Còn lại 38 mảnh mô phân lập thành dịch treo tế bào để bảo quản lạnh. 1. Nuôi cấy TBGNBTKNG phôi chuột. Hình 1: TBGNBTKNG phôi chuột sau 6 - 7 ngày nuôi cấy. (A: sau 7 ngày nuôi cấy, các tế bào tạo cụm, với nhiều nhành bào tương (kính hiển vi soi ngược, x500); B: sau 6 ngày nuôi cấy, tế bào có hình thái của nơ ron, có nhiều nhánh bào tương nối với nhau (nhuộm Giemsa, x500)) Trong số 562 phôi được nuôi cấy, 19 mẫu mô (3,3%) không có tế bào mọc. Còn lại 543 mẫu tế bào đều mọc tốt và có nhiều nơ ron bám trong đĩa nuôi cấy. Tỷ lệ mọc các mẫu mô khoảng 96,7%. Sau 2 ngày nuôi cấy, đa số các tế bào đ bám đáy chai nuôi cấy. Một số đ có nhánh bào tương tỏa ra xung quanh để nối với tế bào bên cạnh. Sau 4 - 6 ngày nuôi cấy, các tế bào tiếp tục phát triển mạnh. Trong mẫu nuôi cấy có thể quan sát hình ảnh nhiều tế bào “giống nơ ron”: hình đa diện, có nhiều nhánh, nối với nhau thành mạng lưới. Các tế bào có thể đứng riêng rẽ, nhưng đa phần đều tạo thành cụm tế bào. Sau khoảng 8 ngày nuôi cấy, có thể tách chiết tế bào phục vụ ghép thử nghiệm trên chuột hoặc bảo quản lạnh. 192
5. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Hình 2: Nhuộm hóa mô miễn dịch marker vimentin và TH tế bào não giữa phôi chuột sau nuôi cấy. ((2): tế bào dương tính với marker vimentin; (4): tế bào dương tính với marker TH (màu đỏ); (1, 3) nhân tế bào được màu xanh với sytox. Ảnh chụp trên kính hiển vi huỳnh quang, x500) Các tế bào sau nuôi cấy dương tính với marker vimentin mạnh. Rất nhiều tế bào dương tính với marker TH. Hình 2 (1) và (2) là 2 kênh màu của cùng một cấu trúc. Hình 2 (3) và (4) là 2 kênh màu của cùng một cấu trúc. 2. Bảo quản lạnh TBGNBTKNG phôi chuột. Trong số 543 mẫu tế bào gốc não giữa phôi chuột nuôi cấy được, chúng tôi bảo quản lạnh mẫu dịch treo tế bào. Như vậy, tại thời điểm này, chúng tôi đ bảo quản được 150 mẫu, trong đó 72 mẫu bảo quản ở giai đoạn ngay sau khi phân lập tạo dịch treo tế bào (nhóm A), chia 78 mẫu bảo quản sau nuôi cấy làm 2 nhóm: nhóm chưa cấy chuyển (nhóm B) và nhóm cấy chuyển lần 1 (nhóm C). Sau r đông, chúng tôi thu được tỷ lệ sống trung bình 64,9%. Không có sự khác biệt giữa tỷ lệ sống nhóm A và nhóm B, tuy nhiên tỷ lệ sống sau bảo quản lạnh của nhóm C thấp hơn có ý nghĩa thống kê với 2 nhóm còn lại. Bảng 1: Tỷ lệ sống của các tế bào thần kinh sau r đông. Nhóm Số mẫu (n) Tỷ lệ sống (%) p Sau phân lập (nhóm A) 72 66,6 ± 11,6 = 0,1 > 0,05 Chưa cấy chuyển (nhóm B) 68 69,8 ± 11,4 < 0,001 Sau cấy chuyển 1 lần (nhóm C) 10 19,9 ± 8,2 < 0,001 Tỷ lệ sống trung bình 64,9 % 193
6. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Biểu đồ 1: Tỷ lệ mọc mẫu trong nuôi cấy sau r đông. Tiến hành nuôi cấy tăng sinh các mẫu tế bào sau r đông, kết quả thu được tỷ lệ mọc mẫu của nhóm A và nhóm B tương đương nhau, tỷ lệ mọc mẫu của nhóm C thấp hơn có ý nghĩa thống kê với 2 nhóm còn lại (p < 0,001). BÀN LUẬN thần kinh và làm chậm quá trình biệt hóa thành nơ ron tiết dopamin, sự trì hoãn 1. Nuôi cấy TBGNBTKNG phôi chuột. này có thể lên tới 8 ngày trên thực Mục đích của nghiên cứu này là nuôi cấy nghiệm [4]. Trong nghiên cứu của chúng tăng sinh số lượng tế bào tiết dopamin để tôi, các tế bào bám vào bề mặt nuôi cấy phục vụ điều trị bệnh lý Parkinson thực sớm, khoảng 2 ngày, tăng sinh nhanh và nghiệm trên chuột. Vì vậy, chúng tôi đ sau khoảng 6 ngày nuôi cấy đ biệt hóa lựa chọn mảnh mô sàn não giữa phôi chuột thành các nơ ron và tế bào thần kinh đệm cống khoảng 12,5 - 13,5 ngày tuổi. Tại vị tạo ra mô thần kinh. Các loại tế bào theo trí này đ chứng minh là nơi tập trung các thời gian nuôi cấy dần thể hiện r đặc tế bào đầu dòng tiết dopamin [1]. Tuy nhiên, điểm cấu trúc hình thái: các nơ ron với số lượng tế bào này ở các phôi 12,5 - nhánh dài và liên kết chặt chẽ với nhau, 13,5 ngày không nhiều, cần phải nuôi cấy tập trung thành từng đám, tế bào hình sao tăng sinh đủ lượng tế bào phục vụ điều trị. và tế bào ít nhánh đứng rải rác. Sự xuất Mẫu mô sàn não giữa sau khi phân tách hiện các tế bào sao hay tế bào ít nhánh bằng enzym sẽ tiến hành nuôi cấy trên của mô thần kinh đệm góp phần thúc đẩy phiến nuôi cấy hoặc trong chai flask. Việc quá trình biệt hóa nơ ron thành nơ ron tiết bổ sung bFGF vào môi trường nuôi cấy dopamin do chúng sản xuất một số chất được Bouvier và CS (1995) chứng minh trung gian hóa học như: IGF-I; GDNF giúp tăng sinh số lượng tế bào gốc mô [4, 5]. 194
7. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Bằng phương pháp nhuộm hóa mô nơ ron được nuôi cấy từ tế bào gốc não miễn dịch với hai loại marker vimentine và phôi chuột từ 29 - 34%, thấp hơn rất TH, chúng tôi ghi nhận đa số các tế bào nhiều so với nhóm tế bào gốc sau phân sau nuôi cấy đều thể hiện dương tính với lập (60 - 70%) [9]. Lý giải sự khác biệt marker vimentin. Rất nhiều nơ ron trong này, đa số các nhà khoa học đều cho số đó dương tính với marker TH - thể rằng tế bào đ biệt hóa có sức chịu đựng hiện tế bào có nguồn gốc mô thần kinh và kém hơn trong quá trình hạ nhiệt độ so có khả năng tiết dopamin [5]. Sử dụng tế với tế bào chưa biệt hóa. Vì vậy, màng tế bào gốc sàn não giữa sau nuôi cấy tăng bào dễ bị tổn thương, dẫn đến ly giải sinh để tiêm cho chuột đ được gây bệnh tế bào trong quá trình r đông [9]. Trong Parkinson trên thực nghiệm. nghiên cứu này, chúng tôi tiếp tục nuôi cấy tế bào sau r đông, cho tỷ lệ mọc 2. Bảo quản lạnh TBGNBTKNG phôi mẫu khoảng 80%. Ở nhóm C, tỷ lệ mọc chuột. các mẫu chỉ 10%, đặc biệt không quan Việc ứng dụng tế bào gốc thần kinh sát thấy tế bào tăng sinh ở nhóm có tỷ lệ trong điều trị đ được nghiên cứu từ rất sống ≤ 10%. Trong các mẫu nuôi cấy, sớm và kèm nhiều nghiên cứu vể bảo chúng tôi quan sát thấy rất nhiều nơ ron quản lạnh tế bào gốc thần kinh được đưa và tế bào hình sao cũng như tế bào ít ra với hy vọng sẽ mang lại nguồn cung nhánh. Điều này cho thấy việc bảo quản cấp tế bào gốc dồi dào và ổn định phục lạnh tế bào gốc não giữa phôi chuột không vụ điều trị [6]. Sử dụng DMSO (dimethyl ảnh hưởng tới khả năng biệt hóa của sulfoxide), là một loại chất bảo quản lạnh tế bào. trong tế bào trong môi trường bảo quản KẾT LUẬN đ được nhiều nghiên cứu chứng minh có Từ kết quả nghiên cứu, chúng tôi đưa hiệu quả tốt đối với quá trình bảo quản tế ra một số kết luận: bào gốc thần kinh: tỷ lệ tế bào sống cao sau r đông, quy trình thao tác đơn giản - Đ nuôi cấy tăng sinh thành công tế và không ảnh hưởng tới tính “gốc” của tế bào gốc não giữa phôi chuột cống trắng bào [7, 8]. Trong nghiên cứu này, chúng để tạo nơ ron tiết dopamin. tôi sử dụng môi trường bảo quản 10% - Đ bảo quản lạnh thành công tế bào DMSO. Tỷ lệ sống của tế bào sau r đông gốc não giữa phôi chuột cống trắng nuôi 64,9%, khá tương đồng với các tác giả khác cấy phục vụ điều trị bệnh Parkinson thực như Milosevic (2005) và Hancock (2000) nghiệm. (khoảng 50 - 70%). Tuy nhiên, trong 3 nhóm quần thể tế bào ở các giai đoạn khác LỜI CẢM ƠN nhau được bảo quản lạnh, nhóm A và Nhóm nghiên cứu xin gửi lời cảm ơn nhóm B có tỷ lệ sống cao hơn so với tới Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ nhóm C. Daniel Rodiguez và CS (2017) Quốc Gia, Bộ Khoa học và Công nghệ đ đ công bố tỷ lệ sống sau r đông ở nhóm tài trợ cho nghiên cứu này. 194
8. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 TÀI LIỆU THAM KHẢO to recovery in Parkinsonian rats. Nature Neuroscience. 1998, 1 (4), pp.290-295. 1. Nguyễn Thanh Hoa, Nguyễn Thị Bình, 6. Barker S.D. Cell-based therapies for Nguyễn Mạnh Hà. Sự biệt hóa của tế bào tiền Parkinson's disease. Expert Rev Neurother. thân tiết dopamin não giữa phôi chuột cống 2011, 11 (6), pp.831-844. trắng. Tạp chí Y học Việt Nam. 2015, 437, 7. Milosevic J. Cryopreservation does not tr.91-95. affect proliferation and multipotency of murine 2. Hunt C.J. Cryopreservation of human stem neural precusor cells. Stem Cell. 2005, 23, cells for clinical application: A review. Transfus pp.681-688. Med Hemother. 2011, 38 (2), pp.107-123. 8. Hancock C.R. Neuronal differentiation of 3. Han F et al. Development of stem cell- cryopreservation neural progenitor cells dirived based therapy for Parkinson's disease. Transl from mouse embryonic stem cell. Biochemical Neurodegener. 2015, 4, p.16. and Biophysical research Communications. 4. Bouvier M, Mythilineon C. Basic fibroblast 2000, 271, pp.418-421. growth factor increases divison and delays 9. Rodriguez-Martinez D, Martinez-Losa M, differentiation of dopamine precursors in vitro. Alvarez-Dolado M. Cryopreservation of 1995. GABAergic neuronal precursors for cell- 5. Studer L, Tabar V, Mckay G. Transplantation based therapy. PLoS One. 2017, 12 (1), of expanded mesencephalic precusors leads p. e0170776. TẠO ỐNG GHÉP MẠCH MÁU BẰNG PHƢƠNG PHÁP KHỬ TẾ BÀO ĐỘNG MẠCH LỢN KẾT HỢP VỚI TẾ BÀO GỐC TỪ MÔ MỠ Tô Minh Quân*; Trịnh Ngọc Lê Vân*; Lê Thị Vĩ Tuyết* 195