Nghiên cứu xây dựng quy trình phát triển hiện kiểu Vegf và kiểu đột biến gen Egfr ứng dụng trong điều trị đích ung thư phổi

Nội dung text: Nghiên cứu xây dựng quy trình phát triển hiện kiểu Vegf và kiểu đột biến gen Egfr ứng dụng trong điều trị đích ung thư phổi

1. TẠP CHÍ Y DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2014 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CHƢƠNG TRÌNH KHCN KC.10/11-15 NGHIÊN CỨU ÂY DỰNG QUY TRÌNH PH T HI N KI U GEN VEGF V KI U T IẾN GEN EGFR ỨNG D NG TRONG IỀU TRỊ ÍCH UNG THƢ PHỔI Ngô Tất Trung*; Định Ngọc S ** Ng iết Nhung** Đặ g ă Khiêm**; ũ X â Phú** Ng Chi Lă g** TÓM TẮT Xây dựng quy trình xét nghiệm phát hiện kiểu gen VEGF và kiểu đột biến mất đoạn (Del19(746- 750)), đột biến điểm trên exon 21 (L858R) của gen EGFR. Các dòng tế bào (TB) ung thư phổi không tế bào nhỏ (UTPKTBN) mang đột biến gen EGFR được nuôi cấy trong điều kiện chuẩn. Xác định tính đa hình của gen VEGF bằng phương pháp động học alen đặc hiệu RT-PCR. Xác định đột biến gen EGFR bằng PCR đa mồi đặc hiệu alen hai hướng tích hợp công nghệ ARMS và kiểm tra lại bằng giải trình tự gen. Xác định ngưỡng phát hiện và độ đặc hiệu của phương pháp bằng cách pha loãng nồng độ TB theo tỷ lệ 0:100, 0.1:100, 1:100, 10:100 và 100:100, sau đó tiến hành tách ADN làm khuôn cho phản ứng PCR. Kết quả: đã hoàn thiện kỹ thuật động học alen đặc hiệu RT-PCR cho phép phát hiện đồng thời hai thể đa hình Rs833061 và Rs3025039 của gen VGFR. Công nghệ PCR đặc hiệu hai hướng alen cũng cho phép xác định được đột biến gen EGFR tại exon 19, exon 21 với ngưỡng phát hiện 0,1%. Độ đặc hiệu kỹ thuật 100%. Giải trình tự gen đã khẳng định kết quả của PCR đa mồi. PCR đa mồi đặc hiệu alen hai hướng tích hợp công nghệ ARMS có ngưỡng phát hiện thấp hơn so với giải trình tự gen (0,1% so với 25%). * Từ khóa: Ung thư phổi; Ung thư phổi không tế bào nhỏ; EGFR; VEGF; PCR đa mồi. ESTABLISHING ASSAYS FOR GENOTYPING VEGF AND IDENTIFYING EGFR MUTATIONS APPLYING FOR TARGET THERAPY OF LUNG CANCER SUMMARY The aims of study are to set-up a molecular diagnostic protocol for detecting exon 19 Del19 (746-750), exon 21 point mutation (L858R) of epithelial growth factor receptor (EGFR) and geneotyping VEGF SNPs Rs3025039, RS833061. Cell lines carrying mutation of EGFR were cultured by standard conditions and treated as reference for optimizing the assays. Mutations of EGFR gene were detected by bidirectional allele specific PCR combined with amplification refractory mutation system, its sensitivity and specificity were monitored by titrating mutant positive cells in to mutant negative counterpart into a series from 0:100, 0.1:100, 1:100, 10:100 and 100. On the other hand, allelic variants of VEGF was acquired by allele specific kinetics PCR with referring to Sanger sequencing. Results: Multiplex-PCR EGFR mutation assay can identify nucleotide modification at exon 19, exon 21 with sensitivity is 0.1%; 1% and 1%, respectively. Sequencing had confirmed the results of multiplex-PCR but its sensitivity is less than multiplex-PCR (> 5%). The concordance was also established between our novel VEGF allelic screening assay and Sanger sequencing. * Từ khóa: Lung cancer; Non-small cell lung cancer; EGFR; VEGF; Multiplex-PCR. * Bệnh viện TWQĐ 108 ** Bệnh viện Phổi TW Người phả hồi (Corresponding): Ng Tất Tr g ( tatr g@ ahoo.com) Ngà hậ bài: 25/12/2013 Ngà phản biện đá h giá bài báo: 20/1/2014 Ngà bài báo được đă g: 21/1/2014 48
2. t¹p chÝ y d•îc häc qu©n sù sè 2-2014 - kÕt qu¶ nghiªn cøu ch•¬ng tr×nh KHcn kc.10/11-15 ẶT VẤN Ề bề mặt TB ác tính mà tuần hoàn trong môi trường và tác động lên thụ thể đặc hiệu trên Ung thư phổi (UTP) là bệnh gây tử vong TB biểu mô đích, từ đó cảm ứng TB biểu cao nhất trong số các bệnh ung thư. Dựa mô biệt hoá thành các TB mạch máu mới. trên hình thái TB, chia UTP thành UTP TB Việc loại bỏ VEGF bằng kháng thể đặc hiệu nhỏ (UTPTBN) và UTPKTBN. UTPTBN chiếm benvacizumab sẽ gián tiếp ức chế TB ung 15 - 20%, còn lại 80 - 85% số ca UTP là thư thông qua việc ức chế quá trình tạo UTPKTBN. Do phác đồ hóa trị hoặc xạ trị mạch mới, nhờ đó một mặt “gây ngạt” cho tương đối có hiệu quả đối với UTPTBN, nên khối u, mặt khác cắt nguồn dinh dưỡng nuôi các nghiên cứu lâm sàng tập trung nhiều khối u, gây hoại tử khối u. vào việc chữa trị cho bệnh nhân (BN) Một đặc điểm nổi bật của liệu pháp ức UTPKTBN. chế VGFR trong điều trị ung thư là không Một đặc điểm nổi bật của UTPKTBN là phải tất cả BN có biểu hiện VGFR đều sự gia tăng mức độ biểu hiện của thụ thể đáp ứng tốt với phác đồ điều trị sử dụng biểu mô (epithelial growth factor receptor - bevacizumab: các thể đa hình khác nhau sẽ EGFR), thụ thể này mang hoạt tính tyrosine định hình kiểu gen VGFR khác nhau với kinase. Hoạt động của enzym này lại phụ mức tiên lượng đáp ứng điều trị khác nhau. thuộc nhiều vào tương tác giữa EGFR với Đến nay, người ta đã biết có ít nhất 8 thể các phân tử ATP tự do trong bào tương. đa hình khác nhau trên khu vực mã hóa gen Một khi EGFR thu nhận được ATP, nó sẽ VGFR. Tùy từng cộng đồng dân cư khác chuyển sang trạng thái bị kích hoạt và nhau mà tần suất kiểu gen VGFR sẽ khác truyền tín hiệu sống sót tới nhân bào, hỗ trợ nhau, đồng thời đáp ứng của thể mang kiểu cho quá trình tăng sinh của TB đồng thời gen tương ứng với phác đồ bevacizumab tăng khả năng di căn của TB ung thư tới cũng khác nhau. các mô lân cận. Hiện nay, trên thị trường dược phẩm tồn tại hai hợp chất có khả Để xác định đột biến gen EGFR cũng năng ức chế EGFR đã được Cơ quan Quản như VGFR, chủ yếu dựa vào công nghệ lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) giải trình tự gen hoặc mua kít thương mại cho phép sử dụng trong điều trị UTPKTBN dựa trên nguyên lý RT-PCR hoặc PCR kết giai đoạn muộn là gefitinib, erlotinib. Việc chỉ hợp ELISA. Do tính chất phức tạp của định sử dụng các dược phẩm này phụ thuộc những đột biến gen EGFR và VGFR, nên vào trạng thái đột biến của gen EGFR. các phương pháp trên có nhiều hạn chế Nhiều nghiên cứu cho thấy, tăng sinh như: (1) giải trình tự gen phải nhân nhiều mạch là một trong những tính chất bệnh đoạn gen, độ nhạy kỹ thuật thấp (yêu cầu sinh ác tính điển hình ở UTP: do nhu cầu tối thiểu phải có > 25% gen mang đột biến dinh dưỡng và nhu cầu trao đổi chất cao mới phát hiện được); (2) các kít thương mại hơn mức bình thường, do đó đòi hỏi sự có giá thành cao, đòi hỏi trang thiết bị phù hình thành nhiều hệ thống mạch máu mới, hợp, phụ thuộc nhập ngoại và có hạn sử vì thế TB ác tính bài tiết ra tác nhân tăng dụng ngắn. Do đó, việc tìm hiểu và thiết lập sinh mạch (Vascular endothelial growth factor - một phương pháp phát hiện kiểu gen VEGF VEGF). Tuy nhiên, VEGF không bộc lộ trên và xác định đột biến gen EGFR không sử 50
3. t¹p chÝ y d•îc häc qu©n sù sè 2-2014 - kÕt qu¶ nghiªn cøu ch•¬ng tr×nh KHcn kc.10/11-15 dụng phản ứng sequencing là điều cần thiết. Germer đề xướng (Germer, Holland và CS, Vì thế, chúng tôi nghiên cứu đề tài này với 2000 [3]; O'Brien, Everhart và CS, 2011 [9]): mục tiêu: Thiết lập quy trình phát hiện kiểu đầu 3’ của mồi xuôi bắt cặp chính xác với gen VEGR và kiểu đột biến gen EGFR ứng nucleotid tại vị trí SNP. dụng trong điều trị BN UTPKTBN. Để kiểm tra sự có mặt của một alen tại VẬT LI U V PHƢƠNG PH P mỗi vị trí SNP, thực hiện đồng thời hai phản NGHIÊN CỨU ứng hai RT-PCR (tương ứng với hai bộ mồi 1. Vật liệu nghiên cứu. alen 1 specific primer, alen 2 specific primer và nhận được hai đường tín hiệu huỳnh quang). Các dòng TB UTPKTBN mang đột biến EGFR: PC9, NCI-1650, HCC827 (delE746- Trường hợp đồng hợp tử, sẽ xuất hiện hai A750), H1975 (L858R). Các hóa chất chuẩn phổ huỳnh quang riêng biệt: đường sớm dùng trong RT-PCR, gel-PCR do Hãng mô tả tín hiệu đặc hiệu, đường muộn mô tả Invitrogene inc cung cấp. tín hiệu bắt cặp lệch primer. Trường hợp dị 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. hợp tử hai đường cong, tín hiệu huỳnh quang * Phương pháp xác định đột biến gen sẽ gần như trùng khít lên nhau. EGFR: * Phương pháp phát hiện kiểu gen VEGF: Nuôi cấy các dòng TB theo phương pháp Xác định tính đa hình của gen VEGF chuẩn, sau 4 - 7 ngày, kiểm tra đạt mật độ theo nguyên lý động học alen đặc hiệu RT- đạt khoảng 5 - 8 x 105 TB/ml. Toàn bộ TB, PCR. Phương pháp này do Søren Germer ADN tổng số được tách chiết và dùng làm (Germer, Holland và CS, 2000 [3]) thiết lập khuôn cho phản ứng multiplex-PCR với bộ mồi đặc hiệu cho thể hoang dại (wild type = lần đầu tiên năm 2000. Nguyên lý của WT) hoặc đột biến mất đoạn trên exon 19 phương pháp này được tóm tắt như sau: (delE746-A750) và đột biến điểm trên exon hai bộ mồi đặc hiệu cho từng alen được 21 tại vị trí L858R. Trình tự mồi do chúng tôi thiết kế sao cho đầu 3’ của mồi xuôi bắt cặp tự thiết kế. chính xác với hai alen riêng biệt tại vị trí có SNP, trong khi đó, mồi ngược sẽ được dùng chung cho cả hai alen. Tại mỗi một vị trí SNP, sẽ tồn tại một trong ba trình tự nucleotid như sau: đồng hợp tử alen trội, dị hợp tử và đồng hợp tử alen hiếm. Khi chẩn đoán SNP, tiến hành đồng thời hai phản ứng RT-PCR (sử dụng Sybr green I để nhận biết sản phẩm PCR) bắt cặp tương ứng với hai alen tại vị trí nghi ngờ có SNP. Lúc đó sẽ xảy ra hai khả năng: (1) nếu mẫu Hình 1: Cở sở lý thuyết của phương pháp ADN là đồng hợp tử, từ tín hiệu huỳnh động học alen đặc hiệu RT-PCR do Søren quang (trên lý thuyết) chỉ được ghi nhận 51
4. t¹p chÝ y d•îc häc qu©n sù sè 2-2014 - kÕt qu¶ nghiªn cøu ch•¬ng tr×nh KHcn kc.10/11-15 duy nhất một alen tương ứng. Tuy nhiên, * Phương pháp đánh giá ngưỡng phát trong thực hành sẽ xảy ra hiện tượng bắt hiện (độ nhạy) và độ đặc hiệu kỹ thuật: cặp lệch của primer, do đó, ngay cả khi Để xác định mật độ tối thiểu TB ác tính mà mẫu ADN là đồng hợp tử thì tín hiệu huỳnh tại đó xét nghiệm có khả năng phát hiện được quang vẫn xuất hiện ở cả hai alen, trong đó, đột biến gen EGFR, chúng tôi tiến hành pha tín hiệu giả sẽ chậm hơn tín hiệu thật loãng dòng TB mang đột biến gen vào mẫu khoảng từ 3 - 15 chu kỳ (hình 1, panel trái) TB thể hoang dại theo tỷ lệ: 0:100, 0.1:100, (Germer, Holland và CS, 2000 [3]; O'Brien, 1:100, 10:100 và 100:100. Sau đó, tách ADN Everhart và CS, 2011 [9]). (2) trường hợp tống số làm khuôn cho phản ứng PCR. mẫu ADN là dị hợp tử, tín hiệu huỳnh * Giải trình tự gen: quang sẽ có mặt đồng đều ở cả hai alen, đường cong phổ huỳnh quang của hai alen Các đột biến gen sau khi được phát hiện sẽ gần trùng khít nhau hoặc chỉ khác nhau bằng phương pháp trên sẽ được giải trình nhá h¬n một chu kỳ (∆Ct ≤ 1) (hình 1) tự theo phương pháp Sanger trên hệ thống (Germer, Holland và CS, 2000 [3]; O'Brien, CEQ 8800 (Beckman Coulter, Mỹ) để khẳng Everhart và CS, 2011 [9]). định kết quả và so sánh độ nhạy kỹ thuật. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1. Kết quả phát hiện đột biến gen EGFR trên exon 19 và 21. Exon 19 deletion Exon 21 mutation Hình 2: Kết quả sau khi chạy PCR đa mồi và điện di phát hiện đột biến gen EGFR tại exon 19 và 21. Các băng điện di rõ nét cho phép xác định đột biến gen EGFR tại vị trí exon 19 (băng có mũi tên đỏ hình bên trái) và vị trí exon 21 (băng có mũi tên đỏ hình bên phải). Negative control: chứng âm, WT: thể dại, mutant: đột biến. ADN ladder: thang chuẩn. 52
5. t¹p chÝ y d•îc häc qu©n sù sè 2-2014 - kÕt qu¶ nghiªn cøu ch•¬ng tr×nh KHcn kc.10/11-15 2. ộ nhạy, độ đặc hiệu kỹ thuật xác định đột biến gen EGFR tại exon 19 bằng PCR đa mồi (delE746-A750). M 50% 25% 5% 1% 0.5% 0.1% 0% BT §B Hình 3: Kết quả minh họa phát hiện đột biến gen EGFR theo nồng độ. Mật độ băng điện di của thể đột biến giảm dần theo nồng độ từ cao đến thấp. Nồng độ cuối cùng 0,1% TB đột biến vẫn có thể nhìn thấy rõ băng điện di. Kết quả cũng chứng minh, ở nồng độ 0% TB mang gen đột biến, không nhìn thấy băng điện di. Chứng tỏ độ nhạy của phương pháp là một TB mang gen đột biến trong 1.000 TB bình thường và độ đặc hiệu là 100%, không có kết quả dương tính giả. 3. Khẳng định kết quả của phƣơng pháp bằng giải trình tự gen. Hình 4: Kết quả giải trình tự gen EGFR theo nồng độ gen mang đột biến. Khi có 25% gen đột biến trong tổng số gen không đột biến thì giải trình tự gen có thể phát hiện được. Tuy nhiên, khi nồng độ gen đột biến giảm chỉ còn 5%, bằng giải trình tự không phát hiện được. 52
6. t¹p chÝ y d•îc häc qu©n sù sè 2-2014 - kÕt qu¶ nghiªn cøu ch•¬ng tr×nh KHcn kc.10/11-15 4. Hình ảnh của phƣơng pháp động học alen đặc hiệu RT-PCR (kinetics alen specific RT-PCR). Delayed amplification Early amplification Hình 5: Kết quả xây dựng phương pháp động học alen đặc hiệu RT-PCR. So với lý thuyết, hình ảnh chúng tôi thu được hoàn toàn phù hợp và cho tín hiệu rất rõ ràng. VP1 Rs3025039 Major allele C VP-2 RS833061 heterogenous allele C/T VP1 Rs3025039 Major allele C VP-2 RS833061 heterogenous allele C/T Hình 6: Kết quả giải trình tự gen tại SNP rs3025039 và RS833061 trên các mẫu VP1 và VP2. Kết quả giải trình tự gen hoàn toàn phù hợp với phương pháp động học alen đặc hiệu RT-PCR. Mẫu bệnh phẩm VP1 được chẩn đoán là đồng hợp tử C/C (hình 6 đầu mũi tên panel trái) và mẫu VP2 được chẩn đoán là dị hợp tử C/T (hình 6 đầu mũi tên panel phải) đối với SNP RS833061. 53
7. t¹p chÝ y d•îc häc qu©n sù sè 2-2014 - kÕt qu¶ nghiªn cøu ch•¬ng tr×nh KHcn kc.10/11-15 N LUẬN Ung thư phổi là một trong những bệnh ác tính có thời gian tiến triển bệnh nhanh và gây tử vong cao nhất trong số nhóm bệnh ung thư. Nếu áp dụng phác đồ kinh điển sử dụng carboplatin- paclitaxel, thời gian sống không bệnh và thời gian sống thêm của BN UTPKTBN tương ứng là 5,4 tháng và 23,6 tháng. Trong khi đó, ở BN được điều trị bằng dược phẩm tyrosine kinase inhibitor (gefitinib và erlotinib) ức chế thụ thể biểu mô tương ứng là 10,8 và 30,5 tháng (Caicun Zhou*, 2010 [2]; Maemondo, Inoue và CS, 2010 [7]). Tuy nhiên, đáp ứng điều trị của BN UTPKTBN với những dược phẩm nói trên hoàn toàn khác nhau: (1) chỉ có các cá thể mang đột biến (delE746- A750) và (L858R) trên exon 18 và 21 mới đáp ứng tốt với phác đồ này; (2) những BN khác hoặc không đáp ứng điều trị (nếu mang thụ thể EGFR hoang dai); (3) hoặc bệnh sẽ trở nên tồi tệ hơn (đối với thể mang đột biến trên exon 18 hoặc 20). Vì thế, việc sàng lọc đột biến EGFR rất có ý nghĩa trong điều trị UTPKTBN. Trên thực tế, văn bản mới nhất hướng dẫn điều trị UTP do Mạng lưới Ung thư Quốc gia Mỹ ban hành năm 2013 cũng khuyến cáo thực hiện xét nghiệm sàng lọc đột biến (delE746-A750) và (L858R) trước khi cân nhắc phác đồ điều trị thích hợp cho BN UTPKTBN. Tuy nhiên, xét nghiệm này có giá thành rất cao nếu sử dụng kít thương mại (mặc dù độ nhạy của những kít này chỉ cho phép phát hiện phân tử ADN đột biến khi quần thể của chúng đạt ngưỡng > 1%). Chi phí cho một lần xét nghiệm là 5 - 10 triệu đồng/BN, đây là mức giá quá cao đối với đa số BN. Do đó, Khoa Sinh học Phân tử, Bệnh viện TWQĐ 108 đã nghiên cứu xây dựng xét nghiệm chẩn đoán hai dạng đột biến chính (delE746-A750) và (L858R) trên gen EGFR. Kết quả cho thấy, độ nhạy kỹ thuật là 1 - 0,1%, tức là có thể phát hiện đột biến khi có ít nhất 1 phân tử ADN mang đột biến gen EGFR tại exon 19 trong tổng số 1.000 phân tử ADN bình thường và ít nhất 1 phân tử ADN mang đột biến gen EGFR tại exon 21 trong tổng số 100 phân tử ADN bình thường. Độ đặc hiệu 100%, không có hiện tượng dương tính giả. Kết quả này tương đương với khuyến cáo của bộ kít thương mại sử dụng công nghệ Scopion của Qiagene. So với giải trình tự gen, độ nhạy của phương pháp do chúng tôi xây dựng cao hơn rõ rệt (1% so với 25%). Về mặt kinh tế, theo tính toán của chúng tôi, mỗi lần xét nghiệm gen EGFR, BN chỉ phải thanh toán 200.000 - 400.000 VNĐ, rẻ hơn nhiều so với các cơ sở khác trong khu vực Hà Nội. Bevacizumab đã được Cơ quan Quản lý Dược phẩm và Thực phẩm Hoa Kỳ cấp phép điều trị UTP. Tuy nhiên, ngoài kiểu gen VEGF, chưa có dấu hiệu nào giúp tiên lượng đáp ứng của BN với dược phẩm này. Vì thế, cần thiết lập một phương pháp phù hợp cho phát hiện kiểu gen VEGF. Đến nay, Sanger sequencing vẫn được coi là phương pháp chuẩn trong phát hiện kiểu gen. Tuy nhiên, khi thể đa hình của một gen quá lớn và nằm rải rác cách xa nhau, không thể thiết kế một phản ứng giải trình tự gen cho nhiều thể đa hình một lúc. Hơn nữa, giải trình tự gen có chi phí lớn và thời gian cho kết quả dài. Sau khi cân nhắc các phương pháp thay thế và trang thiết bị sẵn có, chúng tôi tiến hành thiết lập phương pháp “động học alen đặc hiệu RT-PCR - kinetics alen specific RT-PCR”. Phương pháp này do Søren Germer thiết lập lần đầu tiên vào năm 2000 (Germer, Holland và CS, 2000 [3]), nguyên lý của nó được mô phỏng ở hình 1. So với các phương pháp xác định kiểu gen truyền thống như: cắt enzym giới hạn (RFLP) hay đọc trình tự, phương pháp mà chúng tôi sử dụng có những ưu thế: (1) quy trình xét nghiệm đơn giản: nếu RFLP bao gồm ba bước chính là chạy PCR, cắt enzym và chạy điện di agarose, còn đọc trình tự phải cần tới hai lần chạy PCR và phân tích số liệu sau giai trình tự thì kinetics alen specific RT- PCR chỉ có một bước chạy RT-qPCR; (2) rẻ tiền hơn mặc dù tính trung bình một phản ứng RT- PCR sẽ có giá thành cao hơn phản ứng PCR thông thường, nhưng RFLP đòi hỏi thêm bước cắt enzym giới hạn và chạy điện di agarose, nên thực tế, phương pháp kinetics alen specific RT-PCR vẫn kinh tế hơn. KẾT LUẬN 54
8. t¹p chÝ y d•îc häc qu©n sù sè 2-2014 - kÕt qu¶ nghiªn cøu ch•¬ng tr×nh KHcn kc.10/11-15 Đã xây dựng thành công phương pháp xác định đột biến gen EGFR và phát hiện kiểu gen VEGF với ngưỡng phát hiện 0,1 - 1% (độ nhạy kỹ thuật) và độ đặc hiệu 100%. T I LI U THAM KHẢO 1. Alan Sandler, Robert Gray, Michael C Perry, Julie Brahmer, Joan H Schiller, Afshin Dowlati, Rogerio Lilenbaum, David H Johnson. Paclitaxel - carboplatin alone or with bevacizumab for non-small-cell lung cancer. The New England Journal of Medicine. 2005. 2. Caicun Zhou*, YLW, Gongyan Chen, Jifeng Feng, Xiao-Qing Liu, Changli Wang, Shucai Zhang, Jie Wang, Songwen Zhou, Shengxiang Ren, Shun Lu, Li Zhang, Chengping Hu, Chunhong Hu, Yi Luo, Lei Chen, Ming Ye, Jianan Huang, Xiuyi Zhi, Yiping Zhang, Qin gyu Xiu, Jun Ma Li Zhang, Changxuan You. Erlotinib versus chemotherapy as first-line treatment for patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer (OPTIMAL, CTONG-0802): a multicentre, open-label, randomised, phase 3 study. Lancet Oncol. 2010, pp.2735-2042. 3. Germer S, MJ Holland et al. High-throughput SNP alen-frequency determination in pooled ADN samples by kinetic PCR. Geneome Res. 2000, 10 (2), pp.258-266. 4. Jemal A, R Siegel et al. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 2009, 59 (4), pp.225-249. 5. Klaus Podar, GT, Martin Sattler, Yu-Tzu Tai, Steven LeGouill, Hiroshi Yasui, Kenji Ishitsuka, Shaji Kumar, Rakesh Kumar, Lini N Pandite, Teru Hideshima, Dharminder Chauhan, Kenneth C Anderson. The small-molecule VEGF receptor inhibitor pazopanib (GW786034B) targets both tumor and endothelial cells in multiple myeloma. PNAS. 2005, 103. 6. Lucio Crinò, ED, Pilar Garrido, Frank Griesinger, Janessa Laskin, Nick Pavlakis, Daniel Stroiakovski, Nick Thatcher, Chun-Ming Tsai, CZ Yi-long Wu. Safety and effi cacy of fi rst-line bevacizumab-based therapy in advanced non-squamous non-small-cell lung cancer (SAiL, MO19390): a phase 4 study. Lancet Oncol. 2010, pp.733-740. 7. Maemondo M, A Inoue et al. Gefitinib or chemotherapy for non-small-cell lung cancer with mutated EGFR. N Engl J Med. 2010, 362 (25), pp.2380-2388. 8. Mok TS, YL Wu et al. Gefitinib or carboplatin-paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma. N Engl J Med. 2009, 361 (10), pp.947-957. 9. O'Brien TR, JE Everhart et al. An IL28B geneotype-based clinical prediction model for treatment of chronic hepatitis C. PLoS One. 2011, 6 (7), p.20904. 10. Takano T, T Fukui et al. EGFR mutations predict survival benefit from gefitinib in patients with advanced lung adenocarcinoma: a historical comparison of patients treated before and after gefitinib approval in Japan. J Clin Oncol. 2008, 26 (34), pp.5589-5595. 55