Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện đột biến gen braft1799a trong ung thư tuyến giáp thể nhú bằng kỹ thuật asb realtime pcr

Nội dung text: Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện đột biến gen braft1799a trong ung thư tuyến giáp thể nhú bằng kỹ thuật asb realtime pcr

1. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ KC.10 NĂM 2012 NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN BRAFT1799A TRONG UNG THƢ TUYẾN GIÁP THỂ NHÚ BẰNG KỸ THUẬT ASB REALTIME PCR Hoàng Quốc Trường*; Trần Thị Thanh Huyền* Nguyễn Lĩnh Toàn**; Lê Hữu Song* TÓM TẮT Đột biến gen braf T1799A là dấu ấn phân tử đặc hiệu trong ung thư tuyến giáp (UTTG) thể nhú. Việc xác định chính xác đột biến này có vai trò hết sức quan trọng trong chẩn đoán bệnh. Mục tiêu của nghiên cứu là xây dựng kỹ thuật ASB RealTime PCR để phát hiện đột biến gen brafT1799A. Kết quả cho thấy: bằng kỹ thuật ASB RealTime PCR cho phép phát hiện đột biến T1799A với tû lệ 1 đột biến trong quần thể 100 alen kiểu dại. Như vậy, đã xây dựng thành công kỹ thuật ASB RealTime PCR phát hiện đột biến T1799A. * Từ khóa: Ung thư tuyến giáp thể nhú; Đột biến gen BRAF. ASB Realtime PCR assay for detection of BRAFT1799A mutation in papillary thyroid cancer Summary BRAF mutation T1799A is a specific marker in papillary thyroid cancer. Therefore, the identification of this mutation play an important role in diagnosis of this disease. The aim of this study was to establish a ASB RealTime PCR for detecting braf mutation T1799A. This assay allowed us to detect T1799A mutation in samples containing 1 mutated DNA in populations of the 100 wild type allele. Thus, the ASB RealTime assays for detection of mutation braf has been successfully established. * Key words: Papillary thyroid cancer; Mutation of BRAF. ĐẶT VẤN ĐỀ chọc hút tế bào bằng kim nhỏ (FNAC) là xét nghiệm tế bào học thường quy trong chẩn Ung thư tuyến giáp là bệnh ác tính thường đoán trước phẫu thuật đối với u tuyến giáp. gặp nhất, chiếm 90% số bệnh ung thư tuyến Độ nhạy và độ đặc hiệu của FNAC trong xét nội tiết và khoảng 1% các loại ung thư. nghiệm tương ứng đạt 70 - 98% và 55 - Trong đó, UTTG thể nhú (UTTGTN) chiếm 100% [1]. Có tới 15 - 40% trường hợp 80%, cao nhất trong các thể UTTG. Kỹ thuật không xác định được chẩn đoán và 10 - 12% * Bệnh viện TWQĐ 108 ** Học viện Quân y Chịu trách nhiệm nội dung khoa học: PGS. TS. Trần Văn Khoa 19
2. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ KC.10 NĂM 2012 mẫu bệnh phẩm chọc hút không đủ tiêu 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. chuẩn chẩn đoán [2]. Do vậy, có đến 50% * Nuôi cấy dòng tế bào HT-29: trường hợp chẩn đoán bị bỏ sót, ảnh hưởng Nuôi cấy dòng tế bào HT-29 trong môi rất lớn đến kết quả điều trị. Do đó, nhu cầu trường RPMI có bổ sung 10% FBS, 1X cần có các phương pháp hỗ trợ chẩn đoán penicillin/dtreptomycin. Quy trình nuôi cấy, UTTGTN rất lớn. bảo quản và làm stock tế bào được tiến Qua nghiên cứu cho thấy đột biến gen hành theo hướng dẫn của ATCC (Mỹ) braf T1799A là dấu ấn phân tử có giá trị [ ]. trong chẩn đoán UTTGTN. Đột biến T1799A chỉ xuất hiện ở những tế bào UTTGTN mà * Phương pháp phát hiện đột biến gen B không tìm thấy ở tế bào tuyến giáp lành tính Brat T1799A bằng kỹ thuật khuếch đại gen hoặc ở tế bào tiền ung thư [3]. Nhiều công đặc hiệu alen kết hợp blocker: trình nghiên cứu trên thế giới cho thấy, khi Trình tự primer và blocker đặc hiệu phát kết hợp FNAC với các kỹ thuật sinh học hiện đột biến gen braf T1799A được thiết kế phân tử sẽ giúp chẩn đoán 50% trường hợp dựa trên các công trình đã công bố [5, 7], bị bỏ sót khi chẩn đoán tế bào [4]. để khuếch đại đặc hiệu đoạn gen mang đột Hiện nay, nhiều kỹ thuật RealTime PCR biến trực tiếp từ những mẫu bệnh phẩm đã và đang được nghiên cứu ứng dụng trong bằng kỹ thuật RealTime PCR kết hợp phát hiện đột biến gen như: allele-specific blocker. Phản ứng tiến hành với thể tích competitive blocker PCR, blocker-PCR, RealTime 20 µl, tỷ lệ thành phần như sau: 2X PCR genotyping with locked nucleic axít. Trong master mix SYBR green (ABI), mồi No.1: đó, kỹ thuật khuếch đại gen đặc hiệu alen 5'-CTGTTTTCCTTTACTTACTACACCTCA kết hợp blocker (ASB RealTime PCR, Allele- GAT- 3’ (0,375 pM), mồi đặc hiệu alen No.2: Specific Blocker RealTime PCR) ưu việt hơn 5’-CCCACTCCATCGAGATTTCT-3’.(0.375 pM) cả về độ nhạy, độ đặc hiệu, đặc biệt là khả và 300 pM blocker: 5’-CATCGAGATTTCAC năng phát hiện các đột biến trên những TGTAGCTAGA-PO4-3’. 2,5 µl ADN tổng số mẫu mô với số lượng ít tế bào ung thư [5]. và 0,5 µl nước cho phản ứng RealTime Trong công trình này, chúng tôi nghiên cứu PCR. Phản ứng khuếch đại gen đặc hiệu xây dựng quy trình phát hiện đột biến gen alen kết hợp blocker thực hiện trên máy braf T1799A bằng kỹ thuật ASB RealTime RealTime PCR 7500 (Mỹ) với chu kỳ nhiệt PCR và định hướng ứng dụng dấu ấn phân như sau: 50°C/5 phút; 95°C/10 phút, 45 chu tử trong hỗ trợ chẩn đoán UTTGTN tại kỳ (95°C/15 giây, 60°C/phút). Do việc thiết Bệnh viện TƯQĐ 108. kế trình tự mồi đặc hiệu alen kết hợp sử dụng blocker, phản ứng khuếch đại gen chỉ ®èi TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PH¸P xảy ra trên mạch khuôn ADN mang điểm đột biến và hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ nghiªn cøu nhiệt của phản ứng qua việc ghi nhận tín 1. Đối tƣợng nghiên cứu. hiệu huỳnh quang của SYBR Green. Trong Mẫu chuẩn dương: Dòng tế bào ung thư khi các mẫu không có tín hiệu huỳnh quang đại trực tràng HT-29 mang đột biến gen là những mẫu kiểu dại không chứa đột biến Brat T1799A thể dị hợp (ATCC, Mỹ) [6]. gene braf T1799A. 22
3. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ KC.10 NĂM 2012 * Phương pháp xác định trình tự axít nucleic: Để kiểm định độc lập sự có mặt đột biến gen braf T1799A trong mẫu chuẩn dương HT-29 và các mẫu bệnh phẩm FNAC, phản ứng PCR sử dụng cặp mồi (mồi No.1: 5'-CTGTTTTCCTTTACTTACTACACCTCAGAT-3’, mồi No.3:.5’-CAACTGTTCAAACTGATGGG-3’) để khuếch đại đoạn gen kích thước 126 bp và giải trình tự trực tiếp trên hệ thống máy CEQ 8800 sequencer (Beckman Coulter, Mỹ). Kết quả giải trình tự được phân tích bằng phần mềm BioEdit và công cụ so sánh trình tự trực tuyến Blast search ( KẾT QUẢ nghiªn cøu 1. Xác định đột biến gen BRAF (T1799A) bằng kỹ thuật giải trình tự. Hình 1: Phương pháp phát hiện đột biến bằng kỹ thuật ASB RealTime PCR. (A) Mô phỏng kỹ thuật ASB phát hiện đột biến điểm và (B) Cấu trúc phân tử của blocker, trình tự nucleotide kiểu dại với đầu 3’ gắn với gốc phosphate. Độ nhạy của kỹ thuật phát hiện đột biến gen braf T1799A được xác định bằng cách Hình 2: Hình ảnh trình tự của đột biến gen sử dụng ADN tổng số tách chiết từ dòng tế braf tại vị trí 1799. bào chuẩn dương HT-29 với nồng độ 25 - 2,5 - 0,25 và 0,025 ng/μl trộn với 250 ng Mẫu tế bào ung thư đại trực tràng HT-29 mẫu ADN kiểu dại tương ứng với mỗi nồng cho thấy: có đột biến điểm dạng dị hợp tử độ để tạo thành tỷ lệ pha loãng ADN đột tại vị trí 1799 (T1799A/T) (A). Trong khi đó biến/ADN kiểu dại là 10 - 1 - 0,1 và 0,01%, trên mẫu tế bào u tuyến giáp lành tính sau đó, tiến hành phản ứng ASB RealTime không có đột biến này (B). Mũi tên đánh PCR SYBR Green. dấu vị trí thay đổi nucleotide T>A. 22
4. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ KC.10 NĂM 2012 2. Xác định đột biến gen braf T1799A bằng kỹ thuật khuếch đại gen đặc hiệu alen kết hợp blocker sử dụng SYBR green. Hình 3: Kết quả xác định đột biến gen braf T1799A bằng kỹ thuật khuếch đại gen đặc hiệu alen kết hợp blocker sử dụng SYBR green. Mẫu dương tính với đột biến gen braf T1799A phát hiện qua việc ghi nhận tín hiệu khuếch đại của thiết bị tại chu kỳ 38, trong khi khả năng khuếch đại alen kiểu dại bị ức chế hoàn toàn trên mẫu âm tính với đột biến T1799A. 3. Độ nhạy của kỹ thuật khuếch đại gen đặc hiệu alen kết hợp blocker sử dụng SYBR green trong phát hiện đột biến gen braf T1799A. Hình 4: Tín hiệu huỳnh quang của phản ứng ASB RealTime PCR phát hiện đột biến gen braf T1799A sử dụng thang pha loãng ADN đột biến/ADN kiểu dại. 23
5. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ KC.10 NĂM 2012 Kết quả cho thấy độ nhạy phát hiện đột Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng biến T1799A của kỹ thuật ASB RealTime kỹ thuật khuếch đại gen đặc hiệu alen kết PCR là 0,25 ng, tương ứng với 1% tỉ lệ pha hợp blocker từ những công trình đã công loãng ADN đột biến/ADN kiểu dại. bố trên thế giới về phát hiện đột biến gen KRAS để vận dụng thiết kế xây dựng quy BµN LUËN trình phát hiện đột biến gen braf T1799A [5, 7]. Với việc tối ưu các điều kiện cho Hiện nay, đột biến gen braf là một trong phản ứng khuếch đại đặc hiệu alen và nồng những dấu ấn phân tử giúp chẩn đoán phát độ Oligo blocker sử dụng trong kỹ thuật, kết hiện UTTGTN với độ nhạy và độ đặc hiệu quả cho thấy đã thành công trong việc tương ứng 80% và 99.7% khi kết hợp với khuếch đại alen đột biến T1799A và ức chế kỹ thuật chẩn đoán tế bào [4]. Xác định hoàn toàn tín hiệu khuếch đại alen kiểu dại. được đột biến gen braf T1799A sẽ giúp hạn Việc sử dụng các mẫu chuẩn dương chế chẩn đoán UTTGTN bị bỏ sót của kỹ trong phản ứng RealTime PCR khuếch đại thuật FNAC, nâng cao chất lượng chẩn đặc hiệu alen rất cần thiết để kiểm soát thí đoán, theo dõi và quản lý bệnh nhân. Tuy nghiệm và đánh giá kết quả. Dòng tế bào nhiên, do tính không đồng nhất của tế bào HT-29 là dòng tế bào chứa đột biến dị hợp tại các u tuyến giáp nên đột biến gen braf tử T1799A đã được công bố, chúng tôi xác T1799A thường hiện diện với tỷ lệ thấp nhận bằng kỹ thuật giải trình tự trước khi trong quần thể gen kiểu dại, việc phát hiện tiến hành các bước thí nghiệm tiếp theo. đột biến này vẫn đang là thách thức trong Kết quả cho thấy tính đặc hiệu của phản chẩn đoán khi sử dụng kỹ thuật sinh học ứng khuếch đại đặc hiệu alen trong trường phân tử. Bên cạnh đó, đột biến T1799A được hợp có và không có blocker đều khuếch đại xếp vào nhóm SNP lớp IV hay còn gọi là alen tín hiệu đột biến T1799A đối với dòng tế hiếm (rare allele), do nhiệt độ nóng chảy của bào HT-29. Sử dụng dòng tế bào này đã xác thymine và adenine tương đối gần nhau, định độ nhạy của kỹ thuật ASB RealTime việc phát hiện thể đột biến này trở nên vô PCR. Kỹ thuật ASB RealTime PCR có thể cùng khó khăn [8]. phát hiện đột biến T1799A ở nồng độ 0,25 Một số phương pháp được nghiên cứu ng tương ứng với 1% tỷ lệ pha loãng ADN ứng dụng để phát hiện đột biến bằng kỹ đột biến/ADN kiểu dại. Kết quả của chúng thuật RealTime PCR, bao gồm: khuếch đại tôi phù hợp với kết quả Anne Jarry và CS đặc hiệu alen cạnh tranh blocker, blocker- đã công bố [9]. PCR, ARMS-PCR, TaqMAMA và FLAG PCR. Tuy nhiên, đây là những phương pháp đắt KÕT LUËN tiền, do phải biến đổi hóa học các nucleotid trên trình tự của mồi, enzym, thuốc thử đi Kỹ thuật khuếch đại gen đặc hiệu alen kèm và quy trình thí nghiệm do các hãng kết hợp blocker được xây dựng thành công sinh phẩm cung cấp độc quyền, nên rất khó để phát hiện đột biến gen braf T1799A triển khai tại Việt Nam. trong UTTGTN. 24
6. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ KC.10 NĂM 2012 Tµi liÖu tham kh¶o 1. Gharib H, Goellner JR. Fine-needle aspiration 5. Morlan J, Baker J, Sinicropi D. Mutation biopsy of the thyroid: an appraisal. Annals of Detection by Real Time PCR: A Simple, Robust Internal Medicine. 1993, pp.282-289. and Highly Selective Method. PLoS ONE. 2009, 4 (2), e4584. doi:10.1371/journal.pone.0004584. 2. Sclabas GM, Staerkel GA, Shapiro SE, Fornage BD, Sherman SI, Vassillopoulou-Sellin 6. Davies H, et al. Mutations of the BRAF gen R, Lee JE, Evans DB. Fine-needle aspiration of in human cancer. Nature. 2002, 417, pp. 949-954. the thyroid and correlation with histopathology in 7. Alois H. Lang et. al. Optimized Allele- a contemporary series of 240 patients. Am J Surg. Specific RealTime PCR assays for the detection 2003, 186, pp.702-709. of common mutations in KRAS and BRAF. The 3. Fukushima T, Suzuki S, Mashiko M, Journal of Molecular Diagnostics. 2011, 13 (1), Ohtake T, Endo Y, Takebayashi Y, Sekikawa K, pp.23-28. Hagiwara K & Takenoshita S. BRAF mutations 8. Venter JC, et al. The Sequence of the Human in papillary carcinomas of the thyroid. Oncogen. Genome. Science. 2001, 291, pp.1304-1351. 2003, 22, pp.6455-6457. 9. Anne Jarry. RealTime allele-specific amplification 4. Nikiforov YE, Steward DL, Robinson-Smith for sensitive detection of the BRAF mutation T, Haugen BR, Klopper J, Zhu Z, Fagin JA, V600E. Molecular and Cellular Probes. 2004, 18, Falciglia M, Weber K, Nikiforova MN. Molecular pp.349-352. testing for mutations in improving the fine needle aspiration diagnosis of thyroid nodules. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 2009, 94, pp.2092-2098. Ngày nhận bài: 30/10/2012 Ngày giao phản biện: 15/11/2012 Ngày giao bản thảo in: 6/12/2012 25
7. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ KC.10 NĂM 2012 26