Nghiên cứu xây dựng quy trình chẩn đoán vi sinh vật gây nhiễm khuẩn huyết bằng pcr đa mồi

Nội dung text: Nghiên cứu xây dựng quy trình chẩn đoán vi sinh vật gây nhiễm khuẩn huyết bằng pcr đa mồi

1. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ KC.10 NĂM 2012 NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN VI SINH VẬT GÂY NHIỄM KHUẨN HUYẾT BẰNG PCR ĐA MỒI Lê Hữu Song*; Nguyễn Trọng Chính* Ngô Tất Trung*; Phan Quốc Hoàn* TÓM TẮT Bảy chủng vi sinh vật (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae và Candida albicans) ®•îc định danh đưa vào làm chứng dương để tối ưu hóa quy trình PCR đa mồi. Kết quả cho thấy, 2 bộ PCR (5 lex + 2 lex) có thể phát hiện 7 mầm bệnh này với độ đặc hiệu 100% và độ nhạy của phương pháp là 100 CFU/ml. * Từ khóa: Nhiễm khuẩn huyết; PCR đa mồi. Establishing protocol of multiplex PCR for identifying pathogens caused sepsis summary Colonies of Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, and Candida albicans were used as positive control to monitor the success of multiplex-PCR assay. The result showed that two set of multiplex - PCR (5lex + 2 lex) can detect these 7 pathogens with 100% of specificity and a sensitivety of 100 CFU/ml. * Key words: Sepsis; Multiplex PCR. ĐẶT VẤN ĐỀ tế trong toàn quốc. Tuy nhiên, một số nghiên cứu cho thấy tỷ lệ NKH tại Khoa Hồi sức - Nhiễm khuẩn huyết (NKH) đã và vẫn là Bệnh viện Nhi TƯ là 9,4/1000 BN/ngày, một trong những nguyên nhân gây tử vong tỷ lệ tử vong lên tới 20% trong số những cao. Theo thống kê của Cơ quan Kiểm soát trường hợp NKH [2]. Bệnh Hoa Kỳ (CDC), bệnh này gây tử vong Cấy máu hiện đang được cho là tiêu đứng hàng thứ 11. Chỉ tính riêng ở Mỹ, hàng chuẩn vàng để chẩn đoán mầm bệnh trong năm có hơn 20.000 trường hợp > 65 tuổi bị NKH [3, 4]. Tuy nhiên, việc lấy một lượng mất trí do NKH [1]. máu lớn ở bệnh nhi sơ sinh là một việc Ở nước ta, cho đến nay vẫn chưa có số rất khó khăn, quy trình thực hiện thường liệu thống kê tình hình NKH tại các cơ sở y kéo dài từ 48 - 72 giờ mới có kết quả sơ bộ. * Bệnh viện TWQĐ 108 Chịu trỏch nhiệm nội dung khoa học: PGS. TS. Nguyễn Thỏi Sơn 173
2. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ KC.10 NĂM 2012 Kết quả nghiên cứu cho thấy, 25% bệnh chỉ sử dụng đơn mồi. Mỗi lần xét nghiệm nhân (BN) được xác định nguyên nhân gây chỉ phát hiện được 1 vi sinh vật. Như vậy, NKH bằng cấy máu [5]. Vì vậy, việc chẩn để chẩn đoán nhiều mầm bệnh sẽ rất mất đoán NKH hiện nay chủ yếu dựa vào các thời gian và kinh phí cao. Yêu cầu thực tế triệu chứng lâm sàng, nên không phát hiện hiện nay là phải phát triển một phương pháp sớm được bệnh, do đó rất nguy hiểm cho đơn giản, giá thành thấp để có thể phát hiện tính mạng BN, đặc biệt đối với trẻ nhỏ và được nhiều mầm bệnh trong một lần xét người cao tuổi. nghiệm. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên Việc phát hiện ADN của vi khuẩn trong cứu xây dựng PCR đa mồi (multiplex PCR) mẫu máu BN được cho là một phương pháp để phát hiện các mầm bệnh thường gây NKH: có độ nhạy cao, thực hiện nhanh, có giá trị Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, hỗ trợ cho cấy máu để chẩn đoán NKH. Tuy Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter nhiên, từ trước tới nay, hầu hết các phương baumannii, Staphylococcus aureus, Streptococcus pháp PCR chẩn đoán mầm bệnh thường pneumoniae và Candida albicans. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Vật liệu nghiên cứu. Các khuẩn lạc tương ứng của 7 chủng vi sinh vật: Candida albicans, Acinetobacter baumanni, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumonia, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumonia, Escherichia coli phân lập từ Khoa Vi sinh vật, Bệnh viện TƯQĐ 108, hóa chất chuẩn dùng trong chạy PCR và điện di trên thạch agarose. 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. * Tách ADN tổng số: Tách chiết ADN tổng số bằng kit thương mại (QIAamp DNA Blood Mini Kit). Quy trình tách chiết theo hướng dẫn của nhà sản xuất. * Thiết kế mồi: Thiết kế đặc hiệu cặp mồi cho mỗi loài không bắt chéo với nhau và không bắt cặp với genomics người. Trình tự mồi như sau: KÍCH THƯỚC BỆNH CĂN DO TÊN MỒI (tên gen) TRèNH TỰ MỒI XUÔI/NGƯỢC AMPLICON 5’-GTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTA-3’ 243 C. albicans Z48339 5’-CCGTGCCACATTCCTCCGC-3’ 5’-CCCGAATGTCGGCATCATTCTC-3’ 411 P. aeruginosa P.au. AF116285 5’-CGGTAGACCTCGCGCTTGAA-3’ 5’-CCTTGTCTTTAAACGCGCGC-3’ 324 K. pneumoniae Kp-aldA 5’-TTTTTCGCCGCAGCGG-3’ 5’-AAGGGCGAAATAGAAGTGCCGG-3’ 515 S. aureus STAAROA 5’-ATGGTCGGTTCCTTAGAAAACAAACTTG-3’ 176
3. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ KC.10 NĂM 2012 (1) (2) (3) (4) 5’-TTGGGGCCTTTGAGGCTTTAGTG-3’ 599 A. baumannii Ab (JX470958) 5’-TGGTGCAACAAACTCCCATGGT-3’ 5’-CAACCGTACAGAATGAAGCGGATTAT-3’ 701 S. pneumoniae Sp LytA 5’-GTCCTTGTACTTGACCCAGCCT-3’ 5-capsular gene 5’-CAACCGTACAGAATGAAGCGGATTA -3’ 701 S. pneumoniae cluster 5’-GATCGGTATTCTTCTCTATCAAACTGG -3’ 5’-GTCGCGAGTGAAGATCCCTTTC-3’ 773 E. coli S-uidA 5’-GCATTAATGGACTGGATTGGGGC-3’ 5’-CCAGCAGCCGCGGTAATACG-3’ 996/155 Universal primers Uni-pathogen 5’-ATCGG(C/T)TACCTTGTTACGACTTC-3’ 5’-AGAAGAGCCAAGGACAGGTACG-3’ 180 β globin β globin 5’-TGCTAGTGAACACAGTTGTGTCAGA-3’ * Đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu: Kiểm định độ đặc hiệu bằng giải trình tự gen và chạy thử trên các mẫu chứng âm. Chứng âm là nh÷ng mẫu máu của BN nhiễm virut viêm gan B (HBV) và máu của BN được chẩn đoán nghi ngờ mang bệnh tự miễn cần làm xét nghiệm HLA-B27. Đánh giá độ nhạy của phương pháp bằng cách pha loãng nồng độ vi sinh vật từ 106;105;104;103;102;101;100 CFU/ml. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1. Độ đặc hiệu của bộ mồi đơn cho từng chủng vi sinh vật. Hình 1: Kết quả phát hiện mầm bệnh bằng PCR đơn mồi. 176
4. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ KC.10 NĂM 2012 (Marker: thang chuẩn, 7 băng tiếp theo phẩm. Riêng S. pneumonia cần có ngưỡng phía trên là kết quả của 7 mầm bệnh tương cao hơn (100 CFU/ml). Tuy nhiên, trong thực ứng; 7 băng phía dưới là sản phẩm của cặp hành để có độ tin cậy cao, chúng tôi lấy mồi chung (Universal primer). ngưỡng là 100 CFU/ml cho tất cả mầm bệnh. Các sản phẩm PCR cho hình ảnh rõ 3. Tối ƣu hóa điều kiện PCR đa mồi. nét, có khoảng cách xa nhau, đủ để phân Mục đích cuối cùng là tạo được một biệt. Sau khi thực hiện phản ứng PCR đơn hoặc một số nhất định các bộ mồi có khả mồi, tiến hành giải trình tự và so sánh với năng xác định được sự có mặt của vi sinh trình tự chuẩn trên ngân hàng gen (www. vật quan tâm trong mẫu bệnh phẩm. Để đạt ncbi.nlm.nih.gov). Kết quả phân tích cho được mục đích đó, tiến hành kết hợp các thấy, bộ mồi đơn do chúng tôi thiết kế hoàn mồi đơn với nhau và thực hiện phản ứng toàn đặc hiệu với 07 chủng vi sinh vật được PCR trên mẫu genomics ADN tách từ vi quan tâm. Tuy nhiên, do tính phức tạp của khuẩn chuẩn dương. bộ số liệu giải trình tự, nên trong bài báo Sau khi thử nghiệm kết hợp các mồi đơn này không trình bày. khác nhau bằng nhiều thử nghiệm (số liệu 2. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của không trình bày ở đây), thu được 2 set mồi PCR đơn mồi. (5 lex + 2 lex - (C. albicans + P. aeruginosa Để đánh giá độ nhạy của PCR đơn mồi, + S. aureus, A. baumannii và E. coli) + tiến hành pha loãng nồng độ của 7 chủng vi (S. pneumonia + K. pneumonia) hoặc 6 lex sinh theo tỷ lệ giảm dần từ 106 CFU/ml đến (C. albicans + P. aeruginosa + S. aureus, A. baumannii + S. pneumonia và E. coli) + 100 CFU/ml vào trong máu người khỏe mạnh, 1 lex (K. pneumonia) có khả năng chẩn tiến hành tách chiết ADN tổng số và PCR đoán sự có mặt của các vi sinh vật chứng mồi đơn cho từng chuỗi pha loãng. dương tương ứng trong mẫu phân tích. Hình 2: Độ nhạy kỹ thuật xét nghiệm PCR Hình 3: Kết quả sử dụng mồi 5 plex và 2 lex đơn mồi cho từng chủng vi sinh vật. trong chẩn đoán các mầm bệnh đơn. Kỹ thuật PCR đơn mồi có thể phát hiện Kết quả PCR đa mồi phát hiện 7 mầm được vi sinh vật ở nồng độ 1 CFU/1 ml bệnh bệnh rất rõ nét, không có băng phụ. 177
5. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ KC.10 NĂM 2012 4. Đánh giá độ đặc hiệu phản ứng PCR đa mồi. Hình 4: Độ đặc hiệu mồi 5 lex (panel trên) và mồi 2 lex (panel dưới). (Markers: thang chuẩn; các băng chuẩn dương có ghi rõ tên mầm bệnh tương ứng; HLA-b27 (1-9) là các mẫu máu biết chắc chắn không nhiễm mầm bệnh kể trên; HBV (1-9) là các mẫu máu của bệnh nhân nhiễm virut viêm gan B). Các chứng dương cho kết quả rõ nét, không có trường hợp chứng âm nào có kết quả dương tính từ các bộ mồi đã sử dụng. BÀN LUẬN có mặt của 1 tế bào vi sinh vật trong mẫu bệnh phẩm [6]. Tuy nhiên, chi phí cho xét Chẩn đoán nhanh, chính xác các mầm nghiệm sinh học phân tử phải cân nhắc: bệnh là yêu cầu tiên quyết để điều trị hiệu tính trung bình giá thành của một xét quả NKH. Trong khi hầu hết các trung tâm y nghiệm PCR đơn mồi cho một mầm bệnh vi tế của nước ta vẫn áp dụng phương pháp sinh vật khoảng 300 - 350 nghìn, nếu xét cấy khuẩn với thời gian chờ đợi kết quả nghiệm chẩn đoán đồng thời 7 - 10 mầm thường 48 - 72 giờ. Hơn nữa, cấy khuẩn bệnh, bằng kỹ thuật PCR đơn mồi, mỗi BN đòi hỏi lượng máu lớn, nhưng vẫn bỏ sót phải chi trả khoảng 2 - 3,5 triệu đồng. nhiều trường hợp dương tính, đặc biệt với Vấn đề quan trọng nhất trong PCR đa BN nhiễm các chủng vi sinh vật không thể mồi là thiết kế mồi và tối ưu hóa các điều tiến hành nuôi cấy hoặc rất khó nuôi cấy kiện phản ứng. Trong nghiên cứu này, các như Streptococus pneumonia, Heamophilus cặp mồi đơn được thiết kế bắt cặp đặc hiệu influenza [5]. vào khu vực bảo tồn cao cho mỗi loài trên Phương pháp chẩn đoán vi sinh vật dựa gen ribosome 16S hoặc 23S hoặc gen mã trên trình tự đặc thù của axít nhân (PCR) đã hóa cho protein độc tố đặc trưng của loài. và đang được nhiều trung tâm y tế lớn của Các cặp mồi không bắt cặp chéo với nhau thế giới triển khai. Nó có ưu điểm: thời gian (khi thực hiện phản ứng đa mồi) và không chẩn đoán ngắn, độ nhạy kỹ thuật cao; về lý bắt cặp với genomics ADN người. Ngoài thuyết có thể xác định được chính xác sự 178
6. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ KC.10 NĂM 2012 các bộ mồi đơn đặc hiệu cho mỗi loài, Quy trình xét nghiệm này chỉ đòi hỏi một lần chúng tôi còn thiết kế một cặp mồi bắt vào tách ADN bệnh phẩm tổng số và 3 phản ứng khu vực bảo tồn chung tất cả các loài PCR, do đó, giá thành xét nghiệm chỉ ở mức vi sinh vật (universal primer) nhằm kiểm < 1 triệu/BN. Đặc biệt, cả quá trình chØ thực chứng lây nhiễm vi sinh vật tổng số hoặc vi hiện trong 1 ngày làm việc (8 giờ), đó là sinh vật không nằm trong danh sách được những lợi điểm chủ yếu trong phương quan tâm. Để kiểm tra chất lượng AND, trong quá trình tách chiết, sử dụng một pháp của chúng tôi. bộ mồi đặc hiệu cho genomics ADN người KẾT LUẬN (mồi beta globin). Sự khác biệt về kích thước giữa các đoạn sản phẩm tạo ra nằm trong Kỹ thuật PCR đa mồi được xây dựng thành khoảng 80 - 100 bp, đảm bảo các đoạn sản công cho phép chẩn đoán chính xác, nhanh phẩm có thể dễ dàng phân biệt khi điện di và hiệu quả 7 mầm bệnh thường gây NKH. trên gel agarose 1,5 - 2,5%. TÀI LIỆU THAM KHẢO Để kiểm tra tính đặc hiệu của bộ mồi do chúng tôi thiết kế và loại bỏ hiện tượng 1. Lê Kiến Ngãi, T.V.H. Colin Partridge, dương tính giả do bắt cặp giữa các thành Lê Lan Anh, Nguyễn Hoài Thu, Trần Minh Chi, Meklit Workneh. Tỷ lệ mắc mới và một số yếu tố phần của hỗn hợp mồi ở những vị trí khác liên quan của nhiễm khuẩn huyết bệnh viện tại nhau của bộ gen người, chúng tôi thực hiện các khoa hồi sức cấp, Bệnh viện Nhi TW phản ứng PCR đa mồi sử dụng set mồi ww.nhp.org.vn/images/data/94-TLM~1.pdf. (5 lex + 2 lex) trên các khuôn (template) là 2. Kenneth D. Kochanek, M.A.J.X. M.D, ADN bệnh phẩm mang HBV ADN hoặc Sherry L. Murphy, B.S. Arialdi M. Miniño M.P.H. and Hsiang-Ching Kung. Deaths: Preliminary ADN bệnh phẩm trong chẩn đoán thể đa data for 2009. National Vital Statistics Reports. hình gen HLA - B27. 2011. Vol 59, No 4. Quá trình thử nghiệm chưa ghi nhận 3. Gerdes. J.S. Clinicopathologic approach to hiện tượng bắt cặp chéo giữa mồi đơn đặc the diagnosis of neonatal sepsis. Clin Perinatol. hiệu của vi sinh vật với các vị trí trên gen 1991, 18 (2), pp.361-381. người (hình 4). Kết quả này chứng minh 4. Gerdes. J.S. Clinicopathologic approach to the diagnosis of neonatal sepsis. Isr J Med Sci. PCR đa mồi được xây dựng có độ đặc hiệu 1994, 30 (5 - 6), pp.430-441. cao. Chúng tôi thấy quy trình này có khả 5. Jordan. J.A, et al. Evaluating the near-term năng xác định chính xác 1 trong 7 vi sinh infant for early onset sepsis: progress and vật được quan tâm. Tuy nhiên, trong thực challenges to consider with 16S rDNA polymerase hành lâm sàng, chúng tôi lấy ngưỡng phát chain reaction testing. J Mol Diagn. 2006, 8 (3), hiện là 100 CFU/ml. pp.357-363. 6. Espy. M.J, et al. Real-time PCR in clinical microbiology: applications for routine laboratory testing. Clin Microbiol Rev. 2006, 19 (1), pp.165-256. Ngày nhận bài: 30/10/2012 Ngày giao phản biện: 10/11/2012 Ngày giao bản thảo in: 6/12/2012 179
7. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ KC.10 NĂM 2012 180