Nghiên cứu xây dựng quy trình chẩn đoán dấu ấn phân tử pml-rara ở bệnh nhân bạch cầu cấp tiền tủy bào

Nội dung text: Nghiên cứu xây dựng quy trình chẩn đoán dấu ấn phân tử pml-rara ở bệnh nhân bạch cầu cấp tiền tủy bào

1. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ KC.10 NĂM 2012 NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN DẤU ẤN PHÂN TỬ PML-RARA Ở BỆNH NHÂN BẠCH CẦU CẤP TIỀN TỦY BÀO Ngô Tất Trung*; Nguyễn Việt Long* Đào Hồng Nga*; Đào Phương Giang*; Lê Hữu Song* TÓM TẮT Hiện nay, tại Việt nam chưa có xét nghiệm phân tử định lượng bệnh tồn dư tối thiểu dùng trong theo dõi đáp ứng điều trị bệnh bạch cầu cấp tiền tủy bào (BCCTTB). Trong khi đó, các công trình nghiên cứu đã khẳng định: biểu hiện của gen PML-RAR đặc trưng cho sự có mặt của tế bào BCCTTB. Chúng tôi thiết kế bộ mồi đặc hiệu và tiến hành định lượng mức độ biểu hiện của gen này ở những nồng độ pha loãng khác nhau. Kết quả cho thấy: xét nghiệm chúng tôi thực hiện có thể phát hiện dấu ấn PML-RARA với độ nhạy kỹ thuật 10-4, độ đặc hiệu 100%. Đường chuẩn để đánh giá có tính ổn định với hệ số tương quan (RR) là 0,98. * Từ khóa: Bạch cầu cấp tiền tủy bµo; PML-RARA. Establishment of diagnostic assay for PML-RARA marker in patients with acute promyelogous leukemia SUMMARY In Vietnam, there is currently no availability of diagnostic tool for monitoring the minimal residual disease (MRD) for acute promyelocytic leukemia (APL) patients. Therefore, setting-up a molecular diagnostic protocol for detecting and quantifying the expression level of PML-RARA is needed. To do that cell lines NB4, HT29, THP-1, K562 and HL-60 were cultured by standard conditions and combined at various ratios. 10 samples from patients with APL and 5 samples from chronic myeloid leukemia (CML) as negative control were measured PML-RARA by using Real Time PCR with Sybr Green. The result showed that the specificity and sensitivity of our assay were 100% and one malignant acute promyelogous leukemia cell out of 10,000 healthy white blood cells, respectively. The result was reproducible and the standard curve is acceptable enough with RR = 0.98. * Key words: Acute promyelogenous leukemia; PML-RARA. ĐẶT VẤN ĐỀ protein cấu trúc nhân tế bào). Tuy chỉ chiếm 6 - 10% tổng số ca bạch cầu tủy cấp (tương Trong các phân týp của bạch cầu tủy đương với 0,3 - 1,0 ca/100.000 dân/năm) cấp, phân týp M3 hay còn gọi là BCCTTB nhưng phân týp M3 lại là týp duy nhất mà (Acute promyeleocytic leukemia - APL) có hiện nay chúng ta có thể chữa khỏi được đặc trưng là dịch chuyển nhiễm sắc thể hoàn toàn bằng phác đồ sử dụng axít retinoic t(15;17) tương ứng với sự hình thành dạng (một dẫn xuất của vitamin A) liều cao kết lai ghép protein PML-RARA (hoặc RARa với hợp với idarubicin - AIDA protocol [1]. * Bệnh viện TWQĐ 108 Chịu trách nhiệm nội dung khoa học: TS. Nguyễn Đặng Dũng 35
2. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ KC.10 NĂM 2012 Việc chẩn đoán chính xác (ở mức độ phân gen PML-RARA như HT-29, K562, HL-60, tử) sự có mặt của những dạng lai ghép giữa THP-1, Master-Mix Sybr Green-AB Applied gen mã hóa axít retinoid receptor alpha và Biosystems (Mỹ); máy phân tích Real Time PML hay protein cấu trúc nhân tế bào khác PCR - Cycler 7500 Fast Real Time PCR System, là vô cùng cần thiết. Vì vậy, theo hướng Applied Biosystems; buồng đếm hồng cầu, dẫn chẩn đoán và điều trị mới nhất của các môi trường nuôi cấy tế bào RPMI (Invitrogen) tổ chức chuyên ngành quốc tế, người ta có chứa 10% huyết thanh bê, 100 mg/ml đưa dấu ấn PML-RARA vào trong phác đồ streptomycine, 100 mg/ml ampiciline, dịch chẩn đoán và theo dõi điều trị bệnh này [2, tách ARN tổng số - Trizol (Invitrogen), enzym 3], cho thấy mức độ biểu hiện của gen ghép phiên mã ngược reverse transcriptase PML-RARA hay những biến thể của nó có (Fermentas, CHLB Đức); kính hiển vi pha độ đặc hiệu 100% trong khẳng định sự tồn tại của tế bào BCCTTB. Hơn nữa, mức độ đảo Nikon Eclipse TE2000 U. biểu hiện của PML-RARA (xác định thông 2. Đối tƣợng nghiên cứu. qua tỷ số PML-RARA/ABL) được dùng làm 10 mẫu máu toàn phần lấy từ 10 BN tiêu chí đánh giá mức độ đáp ứng điều trị cũng như mật độ tế bào BCCTTB và nguy BCCTTB điều trị tại Bệnh viện Bạch Mai. cơ tái phát bệnh sau điều trị. 3. Phƣơng pháp nghiên cứu. Mặt khác, dược phẩm axít all trans-retinoid Nuôi cấy các dòng tế bào theo phương rất đặc hiệu trong việc tiêu diệt các tế bào mang PML-RARA. Vì thế, việc chẩn đoán pháp chuẩn, sau 4 - 7 ngày kiểm tra đạt mật 5 chính xác sự có mặt của dấn ấn này giúp bác độ khoảng 5 - 8 x 10 tế bào/ml thì thu sỹ lâm sàng cân nhắc sử dụng all trans-retinoid hoạch. Thu gom toàn bộ tế bào (bao gồm một cách có hiệu quả trong điều trị đích. cả tế bào chuẩn dương cho biểu hiện PML- Tại Việt Nam, chưa có nhiều cơ sở y tế RARA và chuẩn âm) và trộn lẫn theo tỷ lệ: triển khai xét nghiệm tìm dấu ấn PML-RARA 100%; 10%; 1%; 0,1%; 0,01% và 0%. Tách trong chẩn đoán bệnh BCCTTB. Một số chiết ARN tổng số từ các mẫu trộn lẫn tế phòng thí nghiệm trong nước tuy đã thực hiện bào nói trên, tiến hành tổng hợp ADN bổ xét nghiệm này, nhưng chỉ dừng lại ở mức sung (cADN) bằng enzym phiên mã ngược định tính. Điều này không đáp ứng được yêu (reverse transcriptase). Các mẫu cADN được cầu trong theo dõi điều trị cho bệnh nhân dùng làm khuôn cho phản ứng định lượng (BN). Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu sử dụng hỗn hợp phản ứng thương mại Xây dựng quy trình phát hiện dấu này nhằm: Master-mix Sybr Green (Applied Biosystems, ấn PML-RARA không chỉ ở mức độ định tính Mỹ) với cặp mồi đặc hiệu cho exon 1 - 2 mà còn ở mức độ định lượng, làm cơ sở chẩn của gen PML-RARA (trình tự mồi này sẽ đoán và theo dõi điều trị cho BN. được cung cấp nếu độc giả quan tâm và liên hệ với nhóm tác giả). Phân tích kết quả ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP định tính dựa trên tín hiệu huỳnh quang qua NGHIÊN CỨU chỉ số phổ tan chảy. Định lượng mức độ 1. Vật liệu nghiên cứu. biểu hiện gen PML-RARA trên hệ thống RT- Dòng tế bào mang gen PML-RARA (chuẩn PCR (ABI 7500 Applied Biosystems, Mỹ). dương) NB4 và các dòng tế bào không mang Đơn vị tính bằng tỷ lệ mARN PML-RARA/ABL. 37
3. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ KC.10 NĂM 2012 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1. Độ đặc hiệu của phƣơng pháp xác định dấu ấn phân tử PML-RARA. Hình 1: Kết quả RT-PCR phát hiện dấn ấn phân tử PML-RARA trên tế bào BCCTTB. Tín hiệu huỳnh quang của mẫu từ tế bào NB-4 xuất hiện sớm nhất và rất xa so với các tín hiệu từ những mẫu chứng âm (biểu đồ trái). Phân tích phổ tan chảy cho thấy, chỉ có mẫu chứng dương (NB-4) có điểm tan chảy phù hợp, trong đó, các phổ tan chảy của chứng âm (K562, HL60, HT-29 và THP-1) cho hình ảnh không điển hình, điểm tan chảy không phù hợp với lý thuyết (biểu đồ phải). 2. Độ nhạy kỹ thuật của xét nghiệm phát hiện dấu ấn PML-RARA. Positive signal 0.0% 0.1% 1% 10% A B C Hình 2: Đường chuẩn pha loãng xác định khả năng phát hiện dấu ấn phân tử PML-RARA (hình A tín hiệu huỳnh quang của các mẫu xét nghiệm; hình B là hình ảnh phân tích phổ tan chảy cho thấy hình ảnh đặc hiệu của các mẫu. Hình C là đường chuẩn). Hình ảnh trên cho thấy bằng phương pháp RT-PCR, có thể phát hiện dấu ấn PML- RARA ở nồng độ rất thấp, chỉ 1 tế bào ung thư trong 10.000 tế bào bình thường (0,01%) với tương quan chặt chẽ (RR = 0,98). 39
4. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ KC.10 NĂM 2012 3. Độ đặc hiệu của dấu ấn mARN PML-RARA trên mẫu BN. Để khẳng định tính đặc hiệu của dấu ấn PML-RARA, chúng tôi tiến hành thử nghiệm trên 5 mẫu máu của 5 BN bạch cầu tủy mạn (dương tính với dấu ấn BCR-ABL) và 1 mẫu bệnh phẩm BCCTTB (BN 4) và 1 mẫu chuẩn. Hình ảnh tín hiệu tan chảy Hình ảnh tín hiệu huỳnh quang Bệnh nhân 4 Bệnh nhân 4 Mẫu bệnh phẩm CML Mẫu bệnh Mẫu dương phẩm CML Mẫu dương Hình 3: Tính đặc hiệu của dấu ấn mARN PML-RARA trên mẫu BN. Chỉ có mẫu chứng dương và mẫu BN BCCTTB có tín hiệu trên phổ tan chảy phù hợp, trong đó, 5 BN bạch cầu tủy mạn (CML) cho tín hiệu không phù hợp (hình trái). Tín hiệu của các mẫu chứng dương và mẫu BN BCCTTB xuất hiện sớm, mẫu CML xuất hiện muộn (hình phải). 4. Định lƣợng dấu ấn mARN PML-RARA trên BN. Bảng 1: Nồng độ mARN PML-RARA trong máu ngoại vi của 10 BN. Tên mẫu PML-RARA Tủy đồ Tỷ số mARN PML-RARA/ABL BN 1 Âm tính M3 - BN 2 Dương tính M3 0,25 BN 3 Dương tính M3 0,01 BN 4 Dương tính M3 4 BN 5 Dương tính M3 4 BN 6 Dương tính M3 0,01 BN 7 Dương tính M3 0,5 BN 8 Âm tính M3 - BN 9 Dương tính M3 0,01 BN 10 Dương tính M3 0,125 40
5. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ KC.10 NĂM 2012 8/10 bệnh phẩm BCCTTB được phát hiện dương tính với dấu ấn PML-RARA. Mức độ biểu hiện gen mARN PML-RARA dao động từ 0,01 - 4, 2 mẫu âm tính với dấu ấn này. BÀN LUẬN dương NB4 phát ra. Ngoài ra, kết quả phân tích điểm tan chảy (hình 1, panel phải) cho Bạch cầu cấp tiền tủy bào là một phân thấy chỉ tín hiệu huỳnh quang từ mẫu NB4 týp hiếm gặp của bạch cầu tủy cấp (AML). đặc hiệu cho chuyển đoạn PML-RARA, Bệnh có nguy cơ tử vong cao do biến trong khi đó, các tín hiệu huỳnh quang từ chứng đông máu. Tuy nhiên, bệnh này lại mẫu cADN khác là giả. Điều này cho thấy, đáp ứng tốt với phác đồ điều trị đích sử bộ mồi do chúng tôi thiết kế hoàn toàn đặc dụng axít all-trans retinoid. Các kết quả hiệu cho dấu ấn PML-RARA. nghiên cứu mới nhất cho thấy, dấu ấn Một trong những yêu cầu kỹ thuật của mARN PML-RARA là một chỉ số giúp tiên xét nghiệm là phải xác định được tế bào ác lượng đáp ứng tốt với phác đồ điều trị đích tính có trong máu ngoại vi ở mật độ càng sử dụng axít all-trans retinoid. Hơn nữa, 75 thấp càng tốt. Để có kết luận chính xác về - 99% BN BCCTTB mang gen PML-RARA độ nhạy kỹ thuật trong xét nghiệm chẩn [4, 5]. Vì vậy, sự có mặt của gen này không đoán chuyển đoạn gen PML-RARA, chúng những có giá trị tiên lượng điều trị, mà còn tôi pha loãng tế bào NB4 vào dòng tế bào có giá trị chẩn đoán bệnh. Hướng dẫn thực đối chứng âm HL-60, các mẫu cADN tổng hành lâm sàng mới nhất do Tổ chức Bạch hợp từ ARN tổng số mẫu pha loãng này cầu châu Âu (ELN) ban hành cũng yêu cầu được dùng làm khuôn cho phản ứng định chỉ định xét nghiệm chẩn đoán PML-RARA lượng RT-PCR. Kết quả cho thấy, ở mật độ ngay khi BN bị nghi ngờ mắc BCCTTB [2]. 0,01%, kỹ thuật này có thể phát hiện được Vì vậy, việc triển khai xây dựng xét nghiệm quần thể mang gen PML-RARA. Đường đánh giá mức độ biểu hiện dấu ấn phân tử chuẩn pha loãng cũng phản ánh tính ổn mARN PML-RARA là nhu cầu cần thiết hiện định của kỹ thuật với hệ số tương quan cao nay. Kết quả cho thấy, công nghệ do chúng (RR ≈ 0,98). tôi xây dựng không chỉ xác định được sự có mặt của PML-RARA, mà còn định lượng Mặc dù có sự khác biệt giữa kết quả tủy dấu ấn này trong máu ngoại vi BN với độ đồ và biểu hiện PML-RARA. Tuy nhiên, do nhạy kỹ thuật 10-4, tương đương với hướng quy mô mẫu nhỏ, chưa thể kết luận độ nhạy dẫn kỹ thuật do Tổ chức Bạch cầu châu Âu của phương pháp trên mẫu bệnh phẩm. ban hành [6]. Hơn nữa, tùy từng cộng đồng dân cư mà Để xác định độ đặc hiệu kỹ thuật của chuyển đoạn PML-RARA xuất hiện trên BN phương pháp, chúng tôi sử dụng cADN BCCTTB khác nhau. Những thông kê trước tổng hợp từ ARN tổng số của dòng tế bào đây cho thấy: 75 - 99% BN BCCTTB mang chuẩn dương NB4 và dòng tế bào đối dấu ấn phân tử này [7]. Trong nghiên cứu chứng âm (K562, HL-60, HT29, THP1) làm này, 8/10 mẫu (80%) có biểu hiện dấu ấn khuôn cho phản ứng RT-PCR xác định sự PML-RARA, phù hợp với các nghiên cứu có mặt của PML-RARA. Kết quả hình 1 trên thế giới. Để khẳng định tỷ lệ mang dấu (panel trái) cho thấy, mặc dù tất cả mẫu ấn này trên quần thể BN Việt Nam là bao cADN đều cho tín hiệu huỳnh quang, nhưng nhiêu, chúng ta cần phải tiến hành trên một yếu hơn rất nhiều tín hiệu do mẫu chuẩn nghiên cứu lớn hơn. 41
6. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ KC.10 NĂM 2012 Như vậy, bên cạnh độ nhạy, độ đặc hiệu 3. Milligan, D.W, et al. Guidelines on the kỹ thuật mà chúng tôi đã chứng minh, với management of acute myeloid leukaemia in xét nghiệm này chúng ta có thể theo dõi adults. Br J Haematol. 2006, 135 (4), pp.450-474. hiệu quả điều trị nhắm đích một cách chính 4. Iqbal, S, et al. Identification of PML/RARalpha xác. Đó là một ưu điểm vượt trội mà cho rearrangements in suspected acute promyelocytic đến này chưa có phòng thí nghiệm nào leukemia using fluorescence in situ hybridization of bone marrow smears: a comparison with trong nước có được. Từ đó, BN BCCTTB cytogenetics and RT-PCR in MRC ATRA trial sẽ được chẩn đoán và theo dõi theo đúng patients. MRC Adult Leukaemia Working Party. hướng dẫn của Hội Chuyên ngành Quốc tế Leukemia. 2000, 14 (5), pp.950-953. ngay tại Việt Nam mà không phải gửi mẫu 5. Grimwade, D, et al. Establishing the presence ra nước ngoài. of the t(15;17) in suspected acute promyelocytic leukaemia: cytogenetic, molecular and PML KẾT LUẬN immunofluorescence assessment of patients entered into the M.R.C. ATRA trial. M.R.C. Adult Leukaemia Working Party. Br J Haematol. 1996, Quy trình định lượng dấu ấn phân tử 94 (3), pp.557-573. PML-RARA đã xây dựng thành công với độ đặc hiệu 100% và độ nhạy kỹ thuật ổn định 6. Gabert, J, et al. Standardization and quality control studies of 'real-time' quantitative reverse ở mức 1 tế bào ung thư/10.000 tế bào bình transcriptase polymerase chain reaction of fusion thường. gene transcripts for residual disease detection in leukemia - a Europe Against Cancer program. TÀI LIỆU THAM KHẢO Leukemia. 2003, 17 (12), pp.2318-2357. 7. Grimwade, D, et al. Characterization of acute 1. Avvisati, G, et al. AIDA 0493 protocol for promyelocytic leukemia cases lacking the classic newly diagnosed acute promyelocytic leukemia: t(15;17): results of the European Working Party. very long-term results and role of maintenance. Groupe Francais de Cytogenetique Hematologique, Blood. 2011, 117 (18), pp.4716-4725. Groupe de Francais d'Hematologie Cellulaire, 2. Sanz, M.A, et al. Management of acute UK Cancer Cytogenetics Group and BIOMED 1 promyelocytic leukemia: recommendations from European Community-Concerted Action "Molecular an expert panel on behalf of the European Cytogenetic Diagnosis in Haematological Malignancies. LeukemiaNet. Blood. 2009, 113 (9), pp.1875-1891. Blood. 2000, 96 (4), pp.1297-1308. Ngày nhận bài: 30/10/2012 Ngày giao phản biện: 15/11/2012 Ngày giao bản thảo in: 6/12/2012 41
7. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ KC.10 NĂM 2012 42