Nghiên cứu xây dựng mô hình bệnh nấm hệ thống do candida để đánh giá hiệu quả thuốc chống nấm in vivo

Nội dung text: Nghiên cứu xây dựng mô hình bệnh nấm hệ thống do candida để đánh giá hiệu quả thuốc chống nấm in vivo

1. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015 NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG MÔ HÌNH BỆNH NẤM HỆ THỐNG DO CANDIDA ĐỂ ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ THUỐC CHỐNG NẤM IN VIVO Lê Trần Anh*; Nguyễn Tuấn Quang* TÓM TẮT Mục tiêu: nhu cầu nghiên cứu và đánh giá hiệu quả thuốc chống nấm là rất cấp thiết, cả in vitro và in vivo. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu này nhằm xây dựng mô hình bệnh nấm hệ thống do Candida albicans để áp dụng trong thực tiễn. Phương pháp: gây nhiễm chuột nhắt trắng không suy giảm miễn dịch qua đường tĩnh mạch. Kết quả: liều chết tối thiểu của C. albicans là 4 x 104 4 5 tế bào (TB)/chuột. Liều LD10 là 4 x 10 ; liều LD90 là 7,5 x 10 TB/chuột. Tại ngày thứ 3 (D3) và D8 sau gây nhiễm, mật độ nấm tại thận là 4,52 và 4,06 log10 CFU (đơn vị hình thành khuẩn lạc)/gam, cao hơn so với mật độ nấm tại gan (3,77 và 2,74 log10 CFU/gam) và lách (2,93 và 2,58 log10 CFU/gam). Kết luận: áp dụng mô hình trong đánh giá thấy amphotericin B có tác dụng kéo dài thời gian sống của chuột nhiễm liều LD90 và giảm mật độ nấm ở thận nhiễm liều LD10. * Từ khóa: Candida albicans; Chuột; Amphotericin B; In vivo. Develop a Murine Model of Disseminated Candidiasis to Evaluate the Efficacy of Antifungals in Vivo Summary Objectives: To evaluate the efficacy of anti-fungal drugs are urgently needed, both in vitro and in vivo. We conducted this study to develop a model of systemic mycosis caused by Candida albicans to apply in practice. Methods: Immunocompetent mice were intravenously 4 infected. Results: The minimal lethal dose of C. albicans was 10 cells/mouse. LD10 dose was 4 5 4 x 10 ; LD90 dose was 7.5 x 10 cells/mouse. At day 3 (D3) and D8 after infection, the fungal burden in kidney were 4.52 and 4.06 log10 CFU (colony forming units)/g respectively, higher than that in the liver (3.77 and 2.74 log10 CFU/g) and spleen (2.93 and 2.58 log10 CFU/g). Conclusion: Applying the model to evaluate the efficacy of amphotericin B showed that amphotericin B reduced mortality rate and the fungal burden in kidneys of mice receiving LD90 and LD10, respectively. * Key words: Candida albicans; Mouse; Amphotericin B; In vivo. ĐẶT VẤN ĐỀ Thuốc sản xuất ra trước khi đưa vào áp dụng điều trị cần được đánh giá hiệu quả Các bệnh do nấm đang có xu hướng một cách khách quan, khoa học. Trong ngày càng gia tăng, do đó đòi hỏi phải có đánh giá hiệu quả thuốc có kỹ thuật đánh thuốc điều trị bệnh an toàn, hiệu quả. giá in vitro và in vivo. Đánh giá in vitro có thể * Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Lê Trần Anh (anh lt@vmmu.edu.vn) Ngày nhận bài: 27/08/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 25/11/2015 Ngày bài báo được đăng: 30/11/2015 58
2. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015 cung cấp thông tin ban đầu về hiệu quả - Dụng cụ nuôi cấy, định lượng nấm: thuốc, tuy nhiên thuốc có tác dụng tốt bu ồng cấy vô trùng, hộp lồng petri, in vitro không đảm bảo có hiệu lực cao ố ng nghiệm, que cấy nấm, đèn cồn, kính in vivo. Nghiên cứu thực nghiệm động vật hiển vi, buồng đếm tế bào Neubauer, máy càng đặc biệt quan trọng trong giai đoạn ly tâm. tiền lâm sàng nghiên cứu hiệu quả phối - Dụng cụ xác định lượng nấm trong hợp thuốc, các thuốc mới, đánh giá hiệu tạng: cân điện tử Mettler Toledo (Thụy Sĩ), quả in vivo cũng như độc tính cấp, mạn chày, cối thủy tinh. của chúng [4, 6]. Candida sp. là một trong * Hóa chất: những tác nhân gây bệnh nấm hệ thống - Dung dịch NaCl 0,9%; glucose 5%; hay gặp nhất, trong đó C. albicans là căn gentamicin, formol. nguyên phổ biến, do đó được nhiều tác - Môi trường Sabouraud (Bio Rad, Pháp). giả quan tâm nghiên cứu. Việt Nam là nước có khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, thuận - Thuốc amphotericin B (amphotret, lợi cho nấm và các bệnh nấm phát triển. Bharat Serums and Vaccines Ltd, Ấn Độ). Hiện nay ở Việt Nam chưa có cơ sở nào 3. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên thực hiện gây bệnh nấm hệ thống trên cứu. động vật thực nghiệm để đánh giá hiệu - Nấm C. albicans nuôi cấy trong môi quả thuốc điều trị. Chúng tôi tiến hành đề trường Sabouraud, ở nhiệt độ phòng theo tài này với mục tiêu: Xây dựng quy trình kỹ thuật thường quy. Vào ngày gây nhiễm, gây bệnh nấm hệ thống do Candida thu hồi nấm bằng nước muối sinh lý, ly albicans trên động vật thực nghiệm và áp tâm hút bỏ dịch 3 lần để rửa. Đếm trong dụng đánh giá hiệu quả điều trị bệnh nấm buồng đếm tế bào tính toán mật độ nấm. hệ thống in vivo của amphotericin B để - Tiêm tĩnh mạch đuôi chuột: chuột được thử nghiệm mô hình. giữ trong dụng cụ, bộc lộ đuôi chuột, mỗi lần tiêm 0,2 ml dung dịch nấm/thuốc vào ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP tĩnh mạch đuôi chuột. NGHIÊN CỨU - Kỹ thuật xác định mật độ nấm trong 1. Đối tƣợng nghiên cứu. tạng: lấy tạng bằng phương pháp vô trùng, - Động vật: chuột nhắt trắng, không phân nghiền trong 2 ml dung dịch NaCl 0,9% biệt đực cái, trọng lượng 20 ± 2 gam. có kháng sinh (gentamycin 160 mg/l) - Nấm: C. albicans, chủng ATCC- 90028. bằng chày/cối vô trùng; hòa loãng 1/10; 2. Vật liệu nghiên cứu. 1/100 và 1/1.000 lần; cấy trải 0,2 ml trên * Dụng cụ: hộp lồng petri có môi trường Sabouraud, - Dụng cụ nuôi chuột, giữ chuột để tiêm nuôi cấy ở nhiệt độ phòng, đếm khuẩn lạc tĩnh mạch, bơm tiêm 1 ml, kim 27G. sau 48 giờ. 59
3. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015 - Kỹ thuật làm tiêu bản mô bệnh học: Ca4 100.000 Chết lấy ra tạng cố định ngay vào dung dịch Ca5 500.000 Chết formol, gửi Bộ môn Giải phẫu Bệnh, Học Ca6 500.000 Chết viện Quân y làm và đọc tiêu bản. Ca7 1.000.0000 Chết 4. Chỉ tiêu nghiên cứu và cách theo dõi. Ca8 1.000.0000 Chết Ca9 1.500.0000 Chết - Liều chết 10% (LD10), LD90 (tế bào/chuột): sau khi gây nhiễm chuột được theo dõi Ca10 1.500.0000 Chết sau 14 ngày để đánh giá, tính toán liều Liều tối thiểu gây chết chuột là 104 TB dựa trên phần mềm. C. albicans/chuột. - Mật độ nấm ở các tạng: log10 CFU/ Gây nhiễm bệnh nấm hệ thống trên gam tạng. động vật thực nghiệm có thể có nhiều - Hiệu quả điều trị: tỷ lệ sống của chuột mục đích khác nhau và có thể áp dụng nhiễm liều LD90, mật độ nấm ở thận nhiễm mô hình khác nhau. Chúng tôi lựa chọn liều LD10. Chuột được gây nhiễm (ngày D0), mô hình gây nhiễm C. albicans qua đường tiêm tĩnh mạch amphotericin B liều 1 mg/kg tĩnh mạch để tạo bệnh nấm hệ thống thể trọng từ D1 đến D7, theo dõi chuột trên chuột không suy giảm miễn dịch, đến D14. vì C. albicans là nguyên nhân phổ biến * Xử lý số liệu: số liệu được xử lý bằng nhất của bệnh nấm Candida hệ thống và phần mềm SPSS 16.0. được nghiên cứu nhiều nhất trên động vật; * Thời gian, địa điểm nghiên cứu: chuột nhắt trắng có nhiều ưu điểm như - Thời gian nghiên cứu: 10 - 2014 đến chi phí thấp, dễ nuôi, điều kiện kỹ thuật 7 - 2015. tương đối dễ dàng, dễ mua từ các nhà cung cấp. - Địa điểm nghiên cứu: Labo Nấm, Bộ môn Ký sinh trùng, Học viện Quân y. Kết quả tìm được liều chết tối thiểu 4 của chủng C. albicans là 10 TB/chuột. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ Bảng 2: Liều gây chết của C. albicans BÀN LUẬN (TB/chuột). 1. Xây dựng quy trình bệnh nấm hệ thống do C. albicans. Liều LD10 LD50 LD90 Bảng 1: C. albicans 40.000 225.000 750.000 Xác định liều nấm thấp nhất gây chết chuột. 4 5 Liều LD10 là 4 x 10 ; liều LD90 là 7,5 x 10 Liều Tình trạng TB/chuột. Chuột (TB/chuột) sống/chết Sau khi lựa chọn được điều kiện thí Ca1 10.000 Chết nghiệm, cần xác định liều gây nhiễm. Kết quả tìm LD và LD của chúng tôi phù Ca2 10.000 Sống 10 90 hợp với một số tác giả khác. C. albicans Ca3 100.000 Chết ATCC 90028 có độc lực khá cao, khi gây 60
4. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015 nhiễm liều 5 - 6,8 x 105 cfu/chuột trung vị, cứu đều đánh giá hiệu quả thuốc điều trị thời gian sống của chuột 7 ngày [10]. đến mật độ nấm ở thận. Graybill và CS (1996) thấy liều LD10 là 2,7 x 104 CFU/chuột [5]. Liều 1 x 106 CFU/chuột là liều chuẩn (LD90) trong các nghiên cứu so sánh hiệu lực kéo dài thời gian sống [4, 10]. Bảng 3: Mật độ C. albicans tại các tạng sau gây nhiễm liều LD10 (mean ± SE, log10 CFU/g, n = 5). Thời Thận Gan Lách p 1 -2;3 gian (1) (2) (3) x 100 lần D3 4,52 ± 0,16 3,77 ± 0,10 2,93 ± 0,25 < 0,05 D8 4,06 ± 0,26 2,74 ± 0,19 2,58 ± 0,32 < 0,05 Tại các thời điểm mật độ nấm ở thận đều cao hơn ở gan, lách. Kết quả nghiên cứu mật độ nấm tại một số tạng chuột của chúng tôi phù hợp với đa số các tác giả: thận là nơi có mật độ nấm cao nhất. Nghiên cứu của Chin và CS (2014) cho thấy mật độ nấm ở phổi, gan giảm rất nhanh (2 logs và 1 log x 400 lần sau 24 - 168 giờ gây nhiễm), mật độ nấm ở thận tăng 2 logs từ 24 - 72 giờ và giảm Hình 1: Nấm C. albicans tại thận (D5) (PAS). nhẹ sau 168 giờ [3]. Theo Leunk và CS (1979), sau khi gây nhiễm nấm C. albicans vào tĩnh mạch đuôi của chuột, sau 30 phút thấy nấm tập trung chủ yếu ở phổi (23%), gan (7,5%), nhưng khi chuột chết, lượng nấm phân lập được tại thận chiếm tới 98,2% [7]. Nghiên cứu của Odds và CS (2000) thấy thận là cơ quan có mật độ nấm C. albicans cao nhất, khoảng 105cfu/g trong 4 ngày đầu, 106 - 107 (cfu/g) ngày 14. Tại phổi, gan, lách: 103 ± 105cfu/g ngày 1; giảm xuống dưới < 100 cfu/g ngày thứ 7 Hình 2: Nấm C. albicans tại gan (D5) sau gây nhiễm; mật độ C. albicans ở não (PAS, x 630 lần). chuột thấp [9]. Chính vì lý do mật độ nấm Các tế bào nấm men nảy chồi, màu ở thận cao nhất nên đa số các nghiên tím đỏ. 61
5. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015 Làm tiêu bản mô bệnh học để đánh giá thấy viêm thận cấp (acute pyelonephritis), tổn thương các tạng cho thấy tại thận, các tế bào nấm men, sợi nhìn rõ ở thận gan xuất hiện ổ viêm với những tế bào chuột có biểu hiện viêm nặng, ở chuột nấm men, chứng tỏ nấm lan tràn đến viêm nhẹ không thấy thâm nhiễm tế bào thận, gan. Theo Ashman (1996), tại thận bạch cầu đa nhân [2]. 2. Đánh giá hiệu quả của amphotericin B trong điều trị bệnh nấm hệ thống do C. albicans. Bảng 4: Thời gian sống của chuột gây nhiễm Candida albicans liều LD90 và điều trị (ngày). Trung bình Trung vị Thuốc Ước đoán Ðộ sai chuẩn (SE) Ước đoán Ðộ sai chuẩn (SE) Amphotericin B 11,74 0,29 13,0 0,57 Chứng 10,31 0,29 11,0 0,45 (p < 0,001) Biểu đồ 1: Tỷ lệ sống theo thời gian của chuột gây nhiễm C. albicans liều LD90 và điều trị. Kết quả nghiên cứu cho thấy amphotericin B có hiệu quả điều trị, thể hiện bằng kéo dài thời gian sống ở chuột gây nhiễm C. albicans liều LD90 (p < 0,001). Trong đánh giá hiệu quả của thuốc, 2 chỉ tiêu chính hay sử dụng là tác dụng kéo dài thời gian sống của động vật khi gây nhiễm liều LD90 và giảm mật độ nấm ở tạng khi gây nhiễm liều LD10 [4, 6]. Nghiên cứu của chúng tôi tiến hành theo khuyến cáo của một 62
6. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015 số nhà nghiên cứu để đánh giá thời gian sống chuột được gây nhiễm liều LD90%, điều trị thuốc sau 24 giờ và kéo dài 7 ngày, theo dõi chuột chết trong vòng 2 tuần [6]. Khi sử dụng đường cong Kaplan-Meier cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,001). Bảng 5: Mật độ nấm ở thận sau gây nhiễm C. albicans liều LD10 và điều trị (log10 CFU/g, n = 5). Thời gian Thuốc Mean ± SE Trung bình Nhỏ nhất Cao nhất p1-2 D3 Amphotericin B (1) 3,27 ± 0,21 3,30 2,70 3,85 < 0,01 Chứng (2) 4,52 ± 0,16 4,57 3,93 4,86 D8 Amphotericin B (1) 1,57 ± 0,65 2,27 0 2,92 < 0,01 Chứng (2) 4,06 ± 0,26 4,28 3,08 4,49 (Non parametric test, Mann-Whitney U test) Mật độ nấm ở thận chuột sau gây nhiễm C. albicans liều LD10 ở D3 và D8 tiêm amphotericin B giảm rõ ràng so với nhóm chứng. Trong nghiên cứu này chúng tôi đánh khỏi thuốc hay thuốc khó tiếp cận nấm gây giá mật độ nấm ở hai thời điểm giữa đợt bệnh [1]. điều trị (D3) và sau khi kết thúc điều trị 24 giờ theo hướng dẫn của Viện Nghiên cứu KẾT LUẬN Bệnh Dị ứng và Truyền nhiễm Quốc gia - Chúng tôi đã xây dựng được mô hình Mỹ (NIAID) [8] và được áp dụng trong chuột thực nghiệm mắc bệnh hệ thống một số nghiên cứu [4, 6]. do C. albicans qua gây nhiễm tĩnh mạch đuôi chuột không suy giảm miễn dịch. Kết quả nghiên cứu cho thấy ở cả hai thời điểm, amphotericin B đều làm giảm - Liều tối thiểu C. albicans gây chết là 4 4 rõ rệt mật độ nấm tại thận, ở D8 một số 10 TB/chuột. Liều LD10 là 4 x 10 ; LD90 là 5 chuột không thấy nấm. Nghiên cứu cũng 7,5 x 10 TB/chuột. Tại ngày thứ 3 (D3) cho thấy mật độ nấm giảm rõ ràng, có và D8 sau gây nhiễm, mật độ nấm tại những chuột không thấy nấm mọc nữa, thận là 4,52 và 4,06 log10 CFU/gam, cao nhưng không phải tất cả chuột đều sạch hơn so với mật độ nấm tại gan (3,77 và nấm. Theo một số tác giả, mặc dù thuốc 2,74 log10 CFU/gam) và lách (2,93 và chống nấm có tác dụng rất nhanh trên in 2,58 log10 CFU/gam). vitro nhưng không một loại thuốc nào (kể - Áp dụng mô hình trong đánh giá thấy cả polyene như amphotericin B) làm sạch amphotericin B có tác dụng kéo dài thời nấm hoàn toàn in vivo; có thể do môi gian sống của chuột nhiễm liều LD90 và trường in vivo có tác dụng bảo vệ nấm giảm mật độ nấm ở thận nhiễm liều LD10. 63
7. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015 TÀI LIỆU THAM KHẢO Agents and Chemotherapy. 1996, 40 (3), pp.816-818. 1. Anaissie EJ, McGinnis MR, Pfaller MA, 6. Kavanagh K. Medical Mycology: Cellular Anstead GM, Arora A. Clinical Mycology and Molecular Techniques. West Sussex, England: (second edi.). Elsevier Inc. 2009. John Wiley & Sons. 2007. 2. Ashman RB, Fulurija A, Papadimitriou JM. 7. Leunk RD, Moon RJ. Physiological and Strain-dependent differences in host response metabolic alterations accompanying systemic to Candida albicans infection in mice are related candidiasis in mice. Infect Immun. 1979, 26 (3), to organ susceptibility infectious load. Infection pp.1035-1041. and Immunity. 1996, 64 (5), pp.1866-1869. 8. NIH/NIAID. (n.d.). Standard Operating 3. Chin VK, Foong KJ, Maha A, Rusliza B, Procedure (SOP) Candida albicans Murine Norhafizah M, Chong PP. Multi-step pathogenesis Invasive Candidiasis Model NIH/NIAID Task and induction of local immune response by Order A13. systemic Candida albicans infection in an 9. Odds FC, Nuffel L Van, Gow NA. R. intravenous challenge mouse model. International Survival in experimental Candida albicans Journal of Molecular Sciences. 2014, 15 (8), infections depends on inoculum growth conditions pp.14848-14867. doi:10.3390/ijms150814848. as well as animal host. Microbiology. 2000, 4. Graybill J. The role of murine models in 146 (8), pp.1881-1889. the development of antifungal therapy for systemic 10. Wiederhold NP, Najvar LK, Bocanegra Ra, mycoses. Drug Resistance Updates. 2000, 3, Kirkpatrick WR, Patterson TF. Caspofungin pp.364-383. doi:10.1054/drup.2000.0171. dose escalation for invasive candidiasis due 5. Graybill JR, Bocanegra R, Fothergill A, to resistant Candida albicans. Antimicrobial Rinaldi MG. Bleomycin therapy of experimental Agents and Chemotherapy. 2011, 55 (7), disseminated candidiasis in mice. Antimicrobial pp.3254-3260. doi:10.1128/AAC.01750-10. 64