Nghiên cứu ứng dụng tấm màng ối đông khô làm giá thể trong nuôi cấy tế bào gốc

Nội dung text: Nghiên cứu ứng dụng tấm màng ối đông khô làm giá thể trong nuôi cấy tế bào gốc

1. TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013 NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG TẤM MÀNG ỐI ĐÔNG KHÔ LÀM GIÁ THỂ TRONG NUÔI CẤY TẾ BÀO GỐC Nguyễn Viết Trung*; Phạm Văn Trân* TãM T¾T Sử dụng tấm màng ối đông khô để nuôi cấy tế bào gốc (TBG) màng ối với mục tiêu ứng dụng màng ối đông khô làm giá thể sinh học nuôi cấy tế bào (TB), đồng thời bước đầu nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể màng ối lên khả năng tăng sinh và biệt hóa TB. Tấm màng ối đông khô được “làm ướt” trở lại bằng dung dịch PBS, sau đó dàn lên đáy đĩa nuôi cấy. Nhỏ và trải đều TBG màng ối lên bề mặt tấm màng ối. Nuôi cấy TBG màng ối trong môi trường DMEM và 10% huyết thanh bào thai bê. Thu hoạch TB nuôi cấy trên tấm bằng dung dịch trypsin 0,25%. Đo sự tăng sinh TB theo phương pháp MTS và xác định tính gốc của TB bằng dấu ấn OCT-4. Kết quả: TBG màng ối phát triển tốt trên màng ối đông khô được “làm ướt”, đồng thời vẫn giữ nguyên được biểu hiện OCT-4. Như vậy, sử dụng màng ối đông khô làm giá thể để nuôi cấy TBG màng ối giúp TB tăng sinh và duy trì được tính gốc ban đầu. * Từ khóa: Tế bào gốc; Màng ối đông khô. APPLYING HYPER-DRY AMNION FOR CULTURE OF AMNIOTIC MEMBRANE STEM CELLS SUMMARY Using of “hyper-dry amnion” as biological scaffold for culturing the amniotic stem cells to study theirs effects on proliferation and differentiation of these cells. “Hyper-dry amnion” returned fresh amniotic membrane with PBS solution and then set to the bottom of the culture plate. Drip and spread of cells on amniotic membrane surface and cultured in DMEM medium supplemented with 10% fetal calf serum. Cells were harvested from cell culture dish using trypsin 0.25%. Measurement of cell proliferation by the MTS method. Characterisation of cells by OCT-4 marker. So that, Amniotic membrane stem cells proliferate well on hyper-dried amniotic membrane returned to those of fresh amniotic membrane and stem cell always express OCT-4 marker. So that “hyper-dry amnion” is used as a scaffold upon which amniotic stem cells can regenerate and maintain theirs characterisations. * Key words: Stem cells; Hyper-dry amnion. ĐẶT VẤN ĐỀ thích sinh miễn dịch trong cơ thể sống. Giá đỡ không bị phá hủy bởi quá trình viêm nên Điều kiện tiên quyết cho việc lựa chọn có thể sử dụng để cấy ghép. Ngoài ra, giá giá đỡ là tính phù hợp về mặt sinh học của đỡ cần có tính chất cơ học phù hợp với mô, nó, tức thích hợp với tổ chức sống, không bao gồm tính thấm, tính ổn định, độ đàn hồi, độc, không gây ung thư hoặc không kích tính linh hoạt và dễ dàng lấy bỏ khi cần [1]. * Bệnh viện 103 Chịu trách nhiệm nội dung khoa học: PGS. TS. Lê Văn Đông TS. Nguyễn Đặng Dũng 1
2. TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013 Giá đỡ cũng cần cho phép TB bám dính ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP và khả năng thấm qua dễ dàng các chất NGHIÊN CỨU như yếu tố sinh trưởng và vật liệu di 1. Đối tƣợng nghiên cứu. truyền [2]. Màng ối và TBG phân lập từ màng ối Màng ối là một giá đỡ với mô hình cấu của những sản phụ mổ đẻ, được sàng lọc trúc tương tự như chất gian bào trong tổ âm tính với HIV, HBV, HCV, giang mai. chức, cơ quan. TB biểu mô màng ối tiết ra các thành phần ngoại bào collagen týp III, 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. IV và glycoprotein khác như laminin, * Chuẩn bị các tấm màng ối đông khô: nidogen, fibronectin tạo nên màng nền của Rửa sạch các tấm màng ối thu được màng ối. Lớp xốp trên màng ối là những bằng dung dịch PBS cho đến khi tạo thành proteoglycan ưa nước và glycoprotein chứa một màng mỏng trong suốt, dàn tấm màng các mạng lưới gồm chủ yếu collagen týp III. ối vừa cắt trên giấy nhôm allumium. Xử lý Perlecan - một heparan sulphate proteoglycan, tấm màng ối bằng hệ thống đông khô, sau là thành phần chủ yếu của màng nền, gắn đó chiếu xạ từ chất phóng xạ Coban 60, các yếu tố sinh trưởng với protein ngoại liều chiếu 25 kGy. Sau khi kết thúc quá trình bào và phân tử bám dính. xử lý phóng xạ, các tấm màng ối đông khô Màng ối toàn phần chứa nồng độ cao trở nên tuyệt đối vô khuẩn và không còn các chất EGF, KGF, HGF và bFGF so với TB sống. màng ối nạo bỏ hết lớp biểu mô [3]. Điều đó * Chuẩn bị TBG màng ối: chứng tỏ, TB biểu mô màng ối chế tiết các o yếu tố sinh trưởng. Thêm vào đó, TNF-α, TBG màng ối bảo quản ở nhiệt độ -80 C NGF, BDNF, noggin và activin cũng được hoặc được thu hoạch trực tiếp từ đĩa nuôi phát hiện trong TBG biểu mô [4]. Vì vậy, TB cấy, ly tâm với dung dịch NaCl 0,9% 3 lần biểu mô màng ối sản xuất cytokine có vai để loại bỏ hết môi trường bảo quản và môi trò quan trọng trong việc tạo ra môi trường trường nuôi cấy. Trộn đều TB trong dung 7 cho TBG tồn tại. Trên thực tế, Grueterich đã dịch NaCl 0,9%, tỷ lệ 10 TB/ml. chứng minh, khi nuôi cấy TBG vùng rìa giác * Nuôi cấy TBG màng ối trên tấm màng mạc trên màng ối toàn phần, TB không thay ối đông khô: đổi về mặt hình thái, trong khi nếu nuôi cấy “Làm ướt” tấm màng ối đông khô bằng trên màng ối loại bỏ hết biểu mô, những TB môi trường DMEM, sau đó dán lên đáy đĩa này có kiểu hình giống giác mạc vùng trung nuôi cấy. Nhỏ TBG đã được chuẩn bị trong tâm [5]. Chúng tôi thực hiện đề tài này môi trường cơ bản lên đĩa nuôi cấy với mật nhằm: Xác định khả năng tồn tại, phát triển độ khoảng 2.000 TB/cm2. Thay môi trường tăng sinh và khả năng duy trì tính gốc của 2 ngày/lần, chú ý cho môi trường vừa đủ để TBG màng ối sau khi nuôi cấy trên màng ối màng ối luôn bám sát đáy đĩa nuôi cấy. Thu đông khô. Nghiên cứu này thành công sẽ hoạch tấm màng ối có cấy TBG bằng dung tạo ra nhiều triển vọng trong việc sử màng ối trong công nghệ mô. dịch trypsin 0,25%. Làm tiêu bản nghiên cứu hoặc có thể tách chiết ARNtt hoặc 2
3. TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013 protein như quy trình thực hiện với màng ối TBG màng ối được cấy ở mật độ thấp thông thường. (25.000 TB/cm2 trong 200 µl môi trường) trên đĩa nuôi cấy microtest (96 giếng). Nuôi * Kỹ thuật RT-PCR: cấy TB ở 37°C trong thời gian 1, 3, 7, 10 Tách ARN toàn phần từ TB b»ng bộ kít hoặc 14 ngày. Tính toán số lượng TB bằng Qiagen theo quy trình kỹ thuật của nhà phương pháp MTS (Promega). Nguyên lý cung cấp. Xác định nồng độ và chất lượng của phương pháp này là giảm của muối ARN trên hệ thống Nanodrop và Agilent. tetrazolium (sản phẩm hấp thụ ánh sáng ở Tổng hợp sợi ADN bổ sung bằng phản ứng bước sóng 490 nm) bởi các TB sống sẽ tỷ sao chép ngược từ 5 μg ARN toàn phần sử lệ với số lượng của chúng. dụng kít Fermentas. Thực hiện phản ứng PCR trên máy luân nhiệt Biorad sử dụng kít KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Qiagen. Cặp mồi đặc hiệu cho gen OCT-4 1. Khả năng tăng sinh của TB trên (Octamer-binding protein 4) là mồi xuôi: màng ối. 5'-GAGGAGTCCCAGGACATGAA-3'; mồi ngược: 1.4 Reverse: 5'-GTGGTCTGGCTGAACACCTT-3'. PL 1.2 Sau khi làm biến tính 15 phút ở 95°C, thực 1.2 MO hiện 40 - 50 chu kỳ PCR (15 giây: 95°C, 1 1 25 giây: 58°C và 20 giây: 72°C). Điện di sản 0.8 phẩm PCR (154 pb) trên gel hoặc giải trình 0.60.8 tự để kiểm tra độ đặc hiệu của phản ứng Do 490nm DO490nm 0.4 PCR. 0.6 * Kỹ thuật hóa miễn dịch DAB: 0.2 0.4 Nuôi cấy mẫu TBG màng ối trên tấm 0 N1 N3 N7 N10 N14 màng ối, đúc parafin, khử parafin trong 0.2 xylen và cồn, sau đó ức chế peroxydase nội Hình 1: Tốc độ tăng sinh của TBG màng ối bào bằng H2O2 0,03%. Ủ với kháng thể đơn trên đĩa0 plastic (PL) và trên màng ối đông dòng kháng Oct 3/4, sau đó ủ với kháng thể khô (MO) được “làm ướt” phục hồi. TB nuôi cấy trên màng ối có tốc độ tăng sinh chậm thứ hai có gắn biotin và ủ với phức hợp hơn so với TB nuôi cấy trên đĩa plastic. streptavidine peroxydase. Hiển thị màu với cơ chất DAB (3,3-diaminobenzidine) và nhuộm 2. Đặc điểm về hình thái và dấu ấn sinh với HE tạo nền tương phản. Sau khi nhuộm học của TBG nuôi cấy trên màng ối. hóa mô miễn dịch, kết quả âm tính chỉ có Sau 24 giờ nuôi cấy, các TB bám dính lên màu xanh tím của HE nhuộm nhân. Dương bề mặt màng ối. Thay môi trường 3 ngày/lần. tính nếu có hiện diện của kháng nguyên Tốc độ tăng sinh của TB nuôi cấy trên màng trên TB, phức hợp kháng nguyên - kháng ối chậm hơn nhiều so với TB được nuôi cấy thể - streptavidine màu sẽ cho màu vàng trực tiếp trên đĩa. TB cũng có nhiều hình thái nâu (màu của DAB). khác nhau và kém thuần nhất. * Đo sự tăng sinh của TB: 3
4. TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013 Hình 2: Hình ảnh TBG nuôi cấy trên tấm màng ối đông khô được “làm ướt” và biểu hiện dấu ấn OCT-4. A: Hình ảnh TB nuôi cấy trên màng ối, phần lớn TB có hình đa diện không thuần nhất, có vài lớp TB mọc chồng lên nhau. B: TB nuôi cấy trực tiếp trên đĩa nuôi cấy, phần lớn TB có hình thoi tương tự nguyên bào sợi (độ phóng đại 400X). C: Nhuộm HE trực tiếp trên đĩa nuôi cấy trên tấm màng ối (độ phóng đại 40X). D: Nhuộm HE cắt dọc tấm màng ối nuôi cấy TB. E: Tiêu bản tấm màng ối được nuôi cấy TBG ngày thứ 14, nhuộm hóa mô miễn dịch TB DAB với OCT-4. TB dương tính với OCT-4. F: Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR của OCT-4. Vị trí 2, 3 là các mẫu TBG màng ối sau phân lập; 3,4 là các mẫu TB được nuôi cấy trên màng ối. Không có sự khác biệt về biểu hiện OCT-4 trên hình ảnh điện di sản phẩm PCR. 4
5. TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013 ối người đã được sử dụng rộng rãi để BÀN LUẬN VÀ KẾT LUẬN điều trị một số bệnh trong lĩnh vực nhãn khoa như bỏng giác mạc, suy TB vùng rìa, Hiện nay, các nước có nền y học phát sẹo giác mạc, bệnh pemphigoid và hội chứng triển như Mỹ, Nhật, Pháp, Đức... đang Stevens-Johnson [7]. Chất gian bào trong nghiên cứu tạo ra tấm TBG người sử dụng màng ối người đã được chứng minh có khả giá đỡ khác nhau để che phủ tổn thương năng làm tăng sinh TB thần kinh ngoại vi, hoặc lấp đầy tổ chức khuyết hổng. Màng ối đồng thời cũng là giá đỡ sinh học có thể là một mô có nguồn gốc bào thai, cấu tạo tiêu hủy trong cơ thể khi ghép mà không để bởi 3 màng chính: màng biểu mô đơn, lại di chứng. Nghiên cứu này sẽ mở ra một màng nền dày và màng vô mạch. Không có hướng mới trong việc sử dụng màng ối và thần kinh, mạch máu hay bạch huyết trong TBG màng ối trong công nghệ mô. màng ối. Laminin là thành phần chính của màng nền tham gia vào quá trình biệt hóa TÀI LIỆU THAM KHẢO TB, duy trì hình dạng và hoạt động TB, duy trì kiểu cấu trúc mô, đồng thời thúc đẩy sự 1. Young CS, et al. Tissue-engineered hybrid tồn tại của các mô thông qua thụ cảm thể tooth and bone. Tissue Eng. 2005, 11 (9-10), của TB như integrin và dystroglycan. Vì pp.1599-1610. vậy, màng ối là giá đỡ sinh học lý tưởng ở 2. Walgenbach KJ, et al. Tissue engineering in vitro cũng như in vivo cho tăng sinh và in plastic reconstructive surgery. Anat Rec. biệt hóa TB [6]. Chúng tôi tạo ra tấm màng 2001, 263 (4), pp.372-378. ối đông khô sử dụng màng ối như giá đỡ và 3. Branski LK, et al. Amnion in the treatment of pediatric partial-thickness facial burns. Burns. TBG màng ối được bổ sung trên giá đỡ 2008, 34 (3), pp.393-399. này. Điều quan trọng là TBG không những 4. Uchida S, et al. Neurotrophic function of có thể tồn tại mà còn tăng sinh (hình 1). So conditioned medium from human amniotic epithelial với đĩa plastic, nuôi cấy trên tấm màng ối cells. J Neurosci Res. 2000, 62 (4), pp.585-590. đông khô làm TB phát triển chậm lại, đồng 5. Diaz-Prado S, et al. Multilineage differentiation thời duy trì được tính gốc của TB. Dấu ấn potential of cells isolated from the human amniotic OCT-4 biểu hiện ở TB nuôi cấy ngày thứ 14 membrane. J Cell Biochem. 111 (4), pp.846-857. ở mức độ ARNtt (xác định bằng RT-PCR) 6. Grueterich M, Espana EM, Tseng SC. Ex và cả ở mức độ protein (hóa mô miễn dịch vivo expansion of limbal epithelial stem cells: TB) (hình 2). Những tấm màng ối đông khô amniotic membrane serving as a stem cell niche. này được bổ sung TBG rất dễ xử lý khi gặp Surv Ophthalmol. 2003, 48, pp.631-646. các dạng tổn thương khác nhau về kích 7. Dua HS, A Azuara-Blanco. Amniotic membrane thước. Những vật liệu này sẽ mở ra một transplantation. Br J Ophthalmol. 1999, 83 (6), hướng mới trong điều trị một số mặt bệnh pp.748-752. ngoại khoa. Như vậy, màng ối có thể là một nguồn nguyên liệu hấp dẫn trong lĩnh vực y Ngµy nhËn bµi: 19/10/2012 học tái tạo. Trong những nghiên cứu trước, Ngµy giao ph¶n biÖn: 30/11/2012 chúng tôi đã tạo được tấm màng ối đông Ngµy giao b¶n th¶o in: 28/12/2012 khô đạt chất lượng tốt, đồng thời cũng xây dựng một quy trình phù hợp với các điều kiện hiện có tại Việt Nam. Hiện nay, màng 5
6. TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013 6