Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật hấp phụ miễn dịch vi hạt đánh dấu huỳnh quang trong phát hiện đồng thời nhiều cytokine

Nội dung text: Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật hấp phụ miễn dịch vi hạt đánh dấu huỳnh quang trong phát hiện đồng thời nhiều cytokine

1. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 3-2017 NGHIÊN C ỨU ỨNG D ỤNG K Ỹ THU ẬT H ẤP PH Ụ MI ỄN D ỊCH VI H ẠT ĐÁNH D ẤU HU ỲNH QUANG TRONG PHÁT HI ỆN ĐỒNG TH ỜI NHI ỀU CYTOKINE Đỗ Kh ắc Đạ i*; Nguy ễn Đặ ng D ũng* Nguy ễn Ng ọc Tu ấn*; Hoàng Trung Kiên* TÓM T ẮT Mục tiêu: phát hi ện đồ ng th ời nhi ều cytokine và đánh giá độ xác th ực c ủa ph ươ ng pháp xét nghi ệm h ấp ph ụ mi ễn d ịch vi h ạt đánh d ấu hu ỳnh quang (fluorescence covalent microbead immunosorbent assay - FCMIA). Đối t ượng và ph ươ ng pháp: 2 l ọ cytokine chu ẩn d ạng đông khô v ới n ồng độ đã bi ết được phân tích b ằng FCMIA trên h ệ th ống Luminex 200 t ại B ộ môn Mi ễn d ịch, H ọc vi ện Quân y. Kết qu ả: xây d ựng được đường chu ẩn phát hi ện đồng th ời 3 cytokine và 9 cytokine trong cùng m ột m ẫu xét nghi ệm, trong đó t ỷ l ệ % khôi ph ục dao độ ng t ừ 95,68 - 107,26% v ới t ổ h ợp 3 cytokine và t ừ 92,86 - 109,61% v ới t ổ h ợp 9 cytokine. Kết lu ận: đã nghiên c ứu thành công ứng d ụng k ỹ thu ật FCMIA trong xét nghi ệm đồ ng th ời nhi ều cytokine, đó là 3 cytokine: IL-6, IL-17, TNF-α và 9 cytokine: IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12, IL-13, GM-CSF, IFN-γ, TNF-α v ới k ết qu ả đị nh l ượng có độ xác th ực cao. * T ừ khoá: Xét nghi ệm cytokine; K ỹ thu ật h ấp ph ụ mi ễn d ịch vi h ạt đánh d ấu hu ỳnh quang. Application of Fluorescence Covalent Microbead Immunosorbent Assay in Simultaneous Detection of Cytokines Summary Objectives: To detect simultanly cytokines and evaluate the accuracy of fluorescence covalent microbead immunosorbent assay (FCMIA) method. Subjects and methods: Lyophilization of 2 cytokine standards with known concentration was analysed by FCMIA with Luminex-200 system at Department of Immunology, Vietnam Military Medical University. Results: Created the standard curve for simultaneous detection of three cytokines and nine cytokines in one assay sample and the percentage of recovery in 3 cytokines ranged from 95.68% to 107.26% and 92.86% to 109.61% in 9 cytokines. Conclusion: We have succeeded in application of FCMIA in simultaneous detection of cytokines as 3-plex (IL-6, IL-17, TNF-α) and 9-plex (IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12, IL-13, GM-CSF, IFN-γ, TNF-α) with high accuracy of quantitative result. * Key words: Cytokine detection; Fluorescence covalent microbead immunosorbent assay. ĐẶT V ẤN ĐỀ th ể đặ c hi ệu trên t ế bào đích, qua đó kích Cytokine là nh ững protein có tr ọng ho ạt con đường d ẫn truy ền tín hi ệu bên lượng phân t ử th ấp, đóng vai trò trung trong t ế bào, làm thay đổi hình th ức bi ểu gian trong trao đổi tín hi ệu gi ữa các t ế hi ện c ủa gen, d ẫn đế n vi ệc t ổng h ợp bào c ủa h ệ th ống mi ễn d ịch. Các cytokine protein m ới quy ết đị nh các tác d ụng sinh phát huy tác d ụng b ằng cách g ắn vào th ụ học [3]. * H ọc vi ện Quân y Ng ười ph ản h ồi (Corresponding): Đỗ Kh ắc Đạ i (dokhacdai@vmmu.edu.vn) Ngày nh ận bài: 29/12/2016; Ngày ph ản bi ện đánh giá bài báo: 14/02/2017 Ngày bài báo được đă ng: 20/02/2017 17
2. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 3-2017 Cho t ới nay, t ại Vi ệt Nam đã có m ột s ố Lọ 2: ch ứa 9 cytokine IL-2, IL-4, IL-5, cơ s ở nghiên c ứu xét nghi ệm được đồ ng IL-10, IL-12, IL-13, GM-CSF, IFN-γ, TNF-α th ời nhi ều cytokine d ựa trên h ệ th ống với n ồng độ đã bi ết, đơn v ị đo là pg/ml. “kín” Bio-plex c ủa Bio-Rad [1, 2]. Tuy * V ật li ệu nghiên c ứu: nhiên, vi ệc Bio-Rad ng ừng cung c ấp hóa ch ất xét nghi ệm t ại Vi ệt Nam d ẫn đế n các Hoá ch ất và sinh ph ẩm xét nghi ệm do xét nghi ệm phát hi ện đồ ng th ời nhi ều Hãng R & D (M ỹ) s ản xu ất theo yêu c ầu cytokine ph ải d ừng l ại. Nh ững k ỹ thu ật của nhóm nghiên c ứu bao g ồm: truy ền th ống nh ư RIA và ELISA có h ạn - H ỗn h ợp v ới s ố l ượng b ằng nhau các ch ế, đó là m ỗi xét nghi ệm ch ỉ phát hi ện lo ại h ạt t ừ khác nhau, m ỗi lo ại h ạt t ừ được đơn l ẻ m ột cytokine. Xét nghi ệm hu ỳnh quang được g ắn lên b ề m ặt m ột đồng th ời nhi ều cytokine b ằng các ph ươ ng pháp RIA và ELISA không nh ững lo ại kháng th ể đơn clon đặc hi ệu v ới cần s ố l ượng l ớn trang thi ết b ị và công 1 cytokine c ủa ng ười: interleukin (IL) 2, 4, lao động mà còn khó có th ể đạ t độ đồ ng 5, 6, 10, 12, 13, 17; y ếu t ố kích thích t ạo nh ất v ề k ết qu ả xét nghi ệm gi ữa các nhân dòng clon các tế bào đơ n nhân và t ế bào viên xét nghi ệm khác nhau. hạt (GM-CSF); interferon gamma (IFN-γ) Xu ất phát t ừ lý do trên, chúng tôi ti ến và y ếu t ố ho ại t ử u alpha (TNF-α). Chia hành nghiên c ứu, tri ển khai ph ươ ng pháp làm 2 t ổ h ợp t ươ ng ứng 3-plex (IL-6; IL-17 xét nghi ệm k ỹ thu ật h ấp ph ụ mi ễn d ịch vi và TNF-α) và 9-plex (IL-2, IL-4, IL-5, IL- hạt đánh d ấu hu ỳnh quang có kh ả n ăng 10, IL-12, IL-13, GM-CSF, IFN-γ, TNF-α). phát hi ện đồ ng th ời nhi ều cytokine trong cùng m ột m ẫu xét nghi ệm, nh ằm kh ắc - H ỗn h ợp kháng th ể phát hi ện ph ục h ạn ch ế c ủa các k ỹ thu ật tr ước đây. (detecting antibody) đã g ắn biotin t ươ ng Dựa trên h ệ th ống Luminex-200 được ứng 2 t ổ h ợp nói trên. trang b ị, chúng tôi ti ến hành đề tài nghiên - Ph ức h ợp ch ất hu ỳnh quang PE g ắn cứu này nh ằm: Phát hi ện đồ ng th ời nhi ều streptavidin. cytokine trong các m ẫu ch ất chu ẩn khác nhau và đánh giá độ xác th ực c ủa ph ương - Các dung d ịch pha m ẫu, dung d ịch pháp xét nghi ệm FCMIA. pha sinh ph ẩm, dung d ịch r ửa (Hãng R & D, Mỹ sản xu ất và cung c ấp). ĐỐI T ƯỢNG VÀ PH ƯƠ NG PHÁP - H ệ th ống Luminex - 200 và ph ần m ềm NGHIÊN C ỨU điều khi ển đi kèm (Hãng Luminex, M ỹ ch ế 1. Đối t ượng và v ật li ệu nghiên c ứu. tạo và cài đặt). * Đối t ượng nghiên c ứu: Các v ật li ệu và thi ết b ị labo ph ụ tr ợ 2 l ọ cytokine chu ẩn d ạng đông khô do khác nh ư: máy l ắc, máy hút chân không, Hãng R & D (Mỹ) cung c ấp bao g ồm: các lo ại pipét, đầ u pipét, gi ấy b ạc, gi ấy Lọ 1: ch ứa 3 cytokine IL-6; IL-17 và th ấm, n ước c ất, ống nghi ệm đề u đạt tiêu TNF-α v ới n ồng độ đã bi ết, đơn v ị đo là chu ẩn qu ốc t ế được cung c ấp t ừ chính pg/ml. hãng s ản xu ất. 18
3. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 3-2017 2. Ph ươ ng pháp nghiên c ứu. cytokine đã g ắn biotin, t ạo thành ph ức * Nguyên lý ph ản ứng phát hi ện hợp mi ễn d ịch g ồm phân t ử cytokine k ẹp cytokine: gi ữa hai kháng th ể đơn clon. Cu ối cùng, Cytokine được phát hi ện b ằng ph ản ph ức h ợp streptavidin-PE được thêm vào ứng mi ễn d ịch hu ỳnh quang ki ểu sẽ g ắn vào kháng th ể đơn clon th ứ hai sandwich trên b ề m ặt các vi h ạt t ừ qua t ươ ng tác streptavidin-biotin. D ước (hình 1) . B ề m ặt c ủa vi h ạt được g ắn s ẵn tác động c ủa tia laser b ước sóng t ử ngo ại các phân t ử kháng th ể đơn clon đặc hi ệu PE s ẽ phát ra ánh sáng hu ỳnh quang, với m ột quy ết đị nh kháng nguyên trên ch ứng t ỏ cytokine có m ặt trong m ẫu xét phân t ử cytokine. Khi ủ m ẫu xét nghi ệm nghi ệm. L ượng PE g ắn vào t ỷ l ệ thu ận với h ạt ph ủ kháng th ể, các phân t ử với l ượng kháng th ể th ứ hai, hay l ượng cytokine s ẽ b ị kháng th ể đặ c hi ệu b ắt gi ữ cytokine có trên b ề m ặt h ạt t ừ. D ựa vào và bám vào b ề m ặt h ạt. Sau đó, thêm mật độ hu ỳnh quang phát ra t ừ các h ạt kháng th ể đơn clon th ứ hai đặ c hi ệu v ới được ủ v ới n ồng độ cytokine cho phép một quy ết đị nh kháng nguyên khác c ủa định l ượng được cytokine. Hình 1: Nguyên lý ph ản ứng phát hi ện cytokine. * K ỹ thu ật: nhau, cho phép g ắn m ỗi lo ại h ạt v ới m ột kháng th ể đặ c hi ệu khác nhau, r ồi tr ộn l ại Kỹ thu ật FCMIA s ử d ụng các h ạt t ừ để phát hi ện đồ ng th ời nhi ều kháng hu ỳnh quang có kích th ước b ằng nhau nguyên khác nhau trong cùng m ột m ẫu (t ươ ng t ự nh ư t ế bào), nh ưng phát ra tín xét nghi ệm. hi ệu hu ỳnh quang khác nhau làm giá đỡ để g ắn các phân t ử sinh h ọc nh ư kháng * Quy trình xét nghi ệm: th ể đặ c hi ệu lên b ề m ặt. Các h ạt này Bước 1: chia đề u 50 µl h ỗn h ợp h ạt t ừ được phân tích b ằng ph ươ ng pháp đếm đã g ắn kháng th ể vào các gi ếng c ủa m ột tế bào/h ạt theo dòng ch ảy (flowcytometry) microplate 96 gi ếng. với hai ngu ồn laser và detector khác nhau Bước 2: cho 50 µl m ẫu cytokine chu ẩn để kích thích và nh ận hai lo ại tín hi ệu đã pha loãng b ậc ba v ới 2 l ọ ch ất chu ẩn hu ỳnh quang độ c l ập do h ạt t ừ hu ỳnh nồng độ khác nhau vào các gi ếng và ủ quang phát ra (tín hi ệu đị nh tính) và t ừ trong điều ki ện l ắc nh ẹ b ằng máy l ắc v ới ph ản ứng đặ c hi ệu trên b ề m ặt h ạt t ừ th ời gian 120 phút t ại nhi ệt độ phòng. R ửa phát ra (tín hi ệu đị nh l ượng). Nh ờ ph ần 3 l ần để lo ại b ỏ các thành ph ần không bám mềm máy tính có kh ả n ăng phân bi ệt vào h ạt b ằng ph ươ ng pháp lọc qua màng được nhi ều lo ại h ạt t ừ hu ỳnh quang khác lọc v ới máy hút chân không. 19
4. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 3-2017 Bước 3: cho 50 µl h ỗn h ợp kháng th ể tươ ng tác biotin-treptavidin. R ửa 3 l ần đơ n clon đặc hi ệu cytokine đã g ắn biotin theo nh ư mô t ả ở b ước 2 để lo ại b ỏ các vào và ủ ti ếp trong điều ki ện nh ư trên ph ức h ợp streptavidin-PE t ự do. trong 60 phút để hình thành ph ức h ợp Bước 5: cho 100 µl dung d ịch r ửa vào mi ễn d ịch ki ểu sanhdwich. R ửa 3 l ần theo nh ư mô t ả ở b ước 2. mỗi gi ếng, sau đó đọ c và phân tích k ết Bước 4: cho 50 µl dung d ịch qu ả b ằng h ệ th ống Luminex - 200 ở ch ế streptavidin-PE vào, ủ trong 30 phút cho độ ch ọn t ốc độ dòng ch ảy (60 µl/phút) và gắn vào ph ức hợp mi ễn d ịch thông qua th ể tích m ẫu đọ c là 50 µl. KẾT QU Ả NGHIÊN C ỨU VÀ BÀN LU ẬN (a) (b) Hình 2: Bi ểu đồ phân b ố các h ạt t ừ theo tín hi ệu hu ỳnh quang đị nh tính của 3 cytokine (a) và 9 cytokine (b). Hình 2a và 2b bi ểu th ị s ự phân b ố c ủa 3 lo ại h ạt t ừ và 9 lo ại h ạt t ừ khác nhau t ươ ng ứng v ới các lo ại cytokine c ần phát hi ện, nh ận bi ết thông qua tín hi ệu hu ỳnh quang quang định tính do h ạt t ừ phát ra. K ết qu ả cho th ấy 3 nhóm h ạt t ừ và 9 nhóm h ạt t ừ khác nhau được phân b ố độ c l ập không có s ự giao thoa, ch ứng t ỏ không có ảnh hưởng chéo gi ữa các lo ại cytokine c ần phát hi ện. Hình 3: Đường cong bi ểu th ị n ồng độ chu ẩn c ủa 3 cytokine theo tín hi ệu hu ỳnh quang định l ượng (a) và đường chu ẩn phát hi ện đồ ng th ời 3 cytokine trên h ệ th ống Luminex - 200 (b). Hình 3a bi ểu th ị n ồng độ chu ẩn c ủa 3 lo ại cytokine theo tín hi ệu hu ỳnh quang đị nh lượng, khi n ồng độ cytokine gi ảm theo b ậc 3, m ật độ hu ỳnh quang đo được gi ảm tươ ng ứng. Hình 3b bi ểu th ị đường chu ẩn phát hi ện đồ ng th ời 3 cytokine trên h ệ th ống 20
5. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 3-2017 Luminex - 200. K ết qu ả cho th ấy có t ươ ng quan thu ận gi ữa n ồng độ cytokine và m ật độ hu ỳnh quang trung bình đo được do ph ức h ợp hu ỳnh quang trên h ạt t ừ phát ra, cho phép s ử d ụng các đường chu ẩn này vào xét nghi ệm đị nh l ượng đồ ng th ời 3 cytokine là IL-6; IL-17 và TNF-α. Hình 4: Đường cong bi ểu th ị n ồng độ chu ẩn c ủa 9 cytokine theo tín hi ệu hu ỳnh quang định l ượng (a) và đường chu ẩn phát hi ện đồ ng th ời 9 cytokine trên h ệ th ống Luminex - 200 (b). Hình 4a bi ểu th ị n ồng độ chu ẩn c ủa 9 lo ại cytokine theo tín hi ệu hu ỳnh quang đị nh lượng, khi n ồng độ cytokine gi ảm theo b ậc 3, m ật độ hu ỳnh quang đo được c ũng gi ảm tươ ng ứng. Hình 4b bi ểu th ị đường chu ẩn phát hi ện đồ ng th ời 9 cytokine trên h ệ th ống Luminex - 200. K ết qu ả cho th ấy có t ươ ng quan thu ận gi ữa n ồng độ cytokine và m ật độ hu ỳnh quang trung bình đo được do ph ức h ợp hu ỳnh quang trên h ạt t ừ phát ra, cho phép s ử d ụng các đường chu ẩn này trong xét nghi ệm đị nh l ượng đồ ng th ời 9 cytokine là IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12, IL-13, GM-CSF, IFN-γ và TNF-α. Bảng 1: Đánh giá độ xác th ực c ủa xét nghi ệm phát hi ện đồ ng th ời 3 cytokine (IL-6; IL-17 và TNF-α) b ằng ch ỉ s ố % khôi ph ục. Lo ại IL-6 IL-17 TNF-a cytokine Nồng độ Nồng độ % khôi Nồng độ Nồng độ % khôi Nồng độ Nồng độ % khôi chu ẩn đo được ph ục chu ẩn đo được ph ục chu ẩn đo được ph ục Ch ất chu ẩn (pg/ml) (pg/ml) (pg/ml) (pg/ml) (pg/ml) (pg/ml) Std1 3.420 3.430,14 100,30 4.840 4.851,03 100,23 3.620 3.632,68 100,35 Std2 1.140 1.123,57 98,56 1.613 1.587,35 98,41 1.207 1.183,64 98,06 Std3 380 396,78 104,42 538 567,28 105,44 402 431,20 107,26 Std4 127 123,89 97,55 179 167,47 93,56 134 128,22 95,68 Std5 42 40,75 97,03 60 63,99 106,65 45 43,27 96,15 Std6 14 14,50 103,57 20 19,51 97,56 15 15,88 105,83 Std7 5 4,98 99,49 7 7,04 100,54 5 4,95 99,08 Vi ệc phát hi ện đồ ng th ời 3 cytokine (IL-6; IL-17 và TNF-α) có độ xác th ực cao. T ỷ l ệ % khôi ph ục gi ữa n ồng độ đo được và n ồng độ chu ẩn đã bi ết dao độ ng t ừ 95,6 - 107,26%. 21
6. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 3-2017 Bảng 2: Đánh giá độ xác th ực c ủa xét nghi ệm phát hi ện đồ ng th ời 9 cytokine (IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12, IL-13, GM-CSF, IFN-γ và TNF-α) b ằng ch ỉ s ố % khôi ph ục. Lo ại cytokine % khôi ph ục IL-2 IL-4 IL-5 IL-10 IL-12 IL-13 GM-CSF IFN-γ TNF-α Ch ất chu ẩn Std1 100,42 100,91 101,05 100,88 100,14 99,15 100,12 99,99 99,99 Std2 100,06 102,56 97,63 96,02 99,17 101,69 99,28 100,60 101,53 Std3 97,81 95,81 104,42 108,34 102,08 99,84 102,49 101,85 100,49 Std4 104,49 98,38 97,43 99,01 102,67 97,04 99,45 94,16 95,93 Std5 96,41 106,92 99,31 92,47 91,49 104,89 95,89 106,32 100,60 Std6 106,33 96,01 101,42 109,61 109,49 97,86 104,50 98,59 103,59 Std7 92,86 104,81 99,73 97,59 97,71 100,39 99,18 100,07 98,44 Việc phát hi ện đồ ng th ời 9 cytokine (IL-2, cứu c ủa mình. K ết qu ả phân lo ại các lo ại IL-4, IL-5, IL-10, IL-12, IL-13, GM-CSF, hạt d ựa vào tín hi ệu hu ỳnh quang đị nh IFN-γ và TNF-α) có độ xác th ực cao. T ỷ l ệ tính do h ạt t ừ phát ra (hình 2a và 2b) , cho % khôi ph ục gi ữa n ồng độ đo được và th ấy không có s ự ch ồng chéo gi ữa các nồng độ chu ẩn đã bi ết dao độ ng t ừ 92,86 nhóm h ạt, ch ứng t ỏ h ệ th ống Luminex - - 109,61%. V ới các ch ất c ần phát hi ện là 200 có kh ả n ăng nh ận di ện riêng r ẽ các cytokine, có s ự bi ến độ ng n ồng độ cao thì lo ại h ạt hu ỳnh quang khác nhau. Nh ư kho ảng cách t ươ ng đối gi ữa giá tr ị đo vậy, cho phép phát hi ện đồ ng th ời nhi ều được và giá tr ị th ực < 10% được xem có cytokine mà không có ph ản ứng chéo [4]. độ xác th ực cao. Vi ệc xét nghi ệm đồ ng th ời nhi ều Kỹ thu ật FCMIA là k ỹ thu ật m ới, cho cytokine theo yêu c ầu nghiên c ứu khác phép phát hi ện đồ ng th ời nhi ều protein nhau trong cùng m ột m ẫu th ử d ựa trên h ệ khác nhau trong cùng m ột m ẫu th ử d ựa th ống “kín” là bio-plex đã ph ải d ừng l ại trên n ền t ảng công ngh ệ c ủa Luminex, sau khi Bio-Rad ng ừng cung c ấp hóa ch ất với vi ệc s ử d ụng ph ần m ềm phân tích xét nghi ệm t ại Vi ệt Nam, trong đó có hóa “m ở” cho phép ứng d ụng các lo ại kít xét ch ất xét nghi ệm cytokine [2]. Nghiên c ứu nghi ệm khác nhau do nhi ều đơn v ị cung này đã ứng d ụng thành công k ỹ thu ật cấp. Đây là công ngh ệ “m ở” cho phép FCMIA, đây là k ỹ thu ật m ới, phù h ợp nh ất ng ười s ử d ụng t ự thi ết k ế panel xét hi ện nay trong xét nghi ệm phát hi ện đồ ng nghi ệm để phát hi ện nhi ều ch ất th ử sinh th ời nhi ều cytokine trong cùng m ột m ẫu học khác nhau tuỳ theo m ục đích nghiên th ử d ựa trên h ệ th ống Luminex - 200. 22
7. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 3-2017 KẾT LU ẬN TÀI LI ỆU THAM KH ẢO - Nghiên c ứu đã ứng d ụng thành công 1. Đỗ Khắc Đạ i, Lê V ăn Đông, Ph ạm Th ế kỹ thu ật h ấp ph ụ mi ễn d ịch vi h ạt đánh Anh và CS . Kết qu ả xét nghi ệm đồ ng th ời 9 cytokine trong d ịch màng ph ổi b ệnh nhân dấu hu ỳnh quang (FCMIA) trong xét ung th ư và lao ph ổi b ằng công ngh ệ nghi ệm đồ ng th ời nhi ều cytokine v ới hai flowcytometry-assited immunoassay. T ạp chí tổ h ợp khác nhau 3 cytokine: IL-6, IL-17, Y - D ược h ọc Quân s ự. 2007 , 5, tr.17-23. TNF-α và 9 cytokine: IL-2, IL-4, IL-5, IL- 2. Bio-Rad . Bio-Plex Cytokine Assay Instruction 10, IL-12, IL-13, GM-CSF, IFN-γ, TNF-α. Manual. 2006. 3. Goldsby R.A, Kindt T.J, Osborne B.A, - K ết qu ả có độ xác th ực cao và có th ể Kuby J . Cytokines in: Kuby Immunology 5 th ứng d ụng trong vi ệc đị nh l ượng đồ ng th ời Ed. Freeman and Company. 2003, pp.276-298. nhi ều cytokine trong cùng m ột m ẫu xét 4. R & D Systems . Magnetic Luminex nghi ệm. Screening Assay. 2016. 23