Nghiên cứu tỷ lệ đột biến gen kháng thuốc của hbv ở đối tượng tiêm chích ma túy và gái mại dâm tại Hải Phòng

Nội dung text: Nghiên cứu tỷ lệ đột biến gen kháng thuốc của hbv ở đối tượng tiêm chích ma túy và gái mại dâm tại Hải Phòng

1. TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6 - 2013 NGHIÊN CỨU TỶ LỆ ĐỘT BIẾN GEN KHÁNG THUỐC CỦA HBV Ở ĐỐI TƢỢNG TIÊM CHÍCH MA TÚY VÀ GÁI MẠI DÂM TẠI HẢI PHÒNG Nguyễn Hùng Cường*; Nguyễn Bảo Trân*; Hoàng Thị Thanh Huyền* Azumi Ishizaki**; Hiroshi Ichimura**; Phạm Văn Thức* TÓM TẮT Thu thập 633 mẫu huyết thanh từ đối tượng tiêm chích ma tuý (TCMT) (n = 492) và gái mại dâm (GMD) (n = 141) tại các Trung tâm Giáo dục và Lao động xã hội, Thành phố Hải Phòng. Tách chiết HBV-ADN từ mẫu huyết thanh có kết quả sàng lọc HBsAg dương tính. Khuếch đại vùng gen Pol-RT của HBV nhờ phản ứng Nested PCR và sản phẩm sau PCR được giải trình tự gen trực tiếp. Phân tích đột biến kháng thuốc của HBV bằng chương trình GENETYX và hướng dẫn của Standford University trên cơ sở kết quả giải trình tự vùng gen Pol-RT. Kết quả: tỷ lệ nhiễm HBV ở cả hai nhóm đối tượng TCMT và GMD tại Hải Phòng là 10,59%. Trong đó, nhóm TCMT là 10,57% và nhóm GMD là 10,64%. Ba genotýp/subtýp của HBV được phát hiện tại khu vực duyên hải phía Bắc; HBV subtýp B4 có tỷ lệ phân bố phân bố cao nhất (77,61%), tiếp theo là subtýp C1 (19,4%) và subtýp I1 (2,99%). Tỷ lệ đột biến gen kháng thuốc lamivudine trong 67 chủng HBV nghiên cứu là 3,84% và kháng thuốc adefovir và entercavir là 0%. Một chủng HBV genotýp B xuất hiện đột biến kiểu YMDD. Axít amin tại vị trí aa 204 của vùng gen Pol-RT là methionine được thay thế bằng aa isoleucin và bộ tứ aa YMDD (tyrosine-methionine-aspartate-aspartate) chuyển thành YIDD. Đây là đột biến kháng đa thuốc dòng nucleoside analogue, ngoài kháng lamivudine, chủng virut này còn kháng cả 2 thuốc là telbivudine và telnofovir. Một chủng HBV genotýp B xuất hiện đột biến tại vị trí aa 80 của vùng gen Pol-RT, aa leucine tại vị trí 80 được thay thế bằng aa isoleucin, chủng này chỉ kháng lamivudine đơn độc và theo cơ chế đột biến L80I. Xuất hiện đột biến tự nhiên kiểu YIDD là yếu tố cảnh báo nguy cơ điều trị thất bại với thuốc lamivudine và tenofovir. * Từ khoá: Viêm gan virut B; Đột biến gen kháng thuốc; Tiêm chích ma túy; Gái mại dâm. Study on drug resistant hepatitis B virus mutant frequency among drug intravenous user and female sex worker groups in Haiphong, Vietnam Summary Plasma samples were collected from 633 subjects among two groups (drug intravenous user [IDU]: 492; female sex worker [FSW]: 141) in the Rehabilitation Center in Haiphong. Plasma viral DNA was extracted from samples that were positive for hepatitis B suface antigen (HBsAg). Pol-RT regions of HBV were amplified by PCR with primers (HB1F(18-39)/HB1R(534-557) and HB2F(414- 433)/HB2R(970-989)). PCR products were sequenced directly and analized by GENTYX program, introducted by Standford University. * Đại học Y Hải Phòng ** Đại học Kanazawa, Nhật Bản Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Hùng Cường (nhcuong@hpmu.edu.vn) Ngày nhận bài: 21/5/2013; Ngày phản biện đánh giá bài báo:20/6/2013 Ngày bài báo được đăng: 15/7/2013 Results: HBsAg prevalence was 10.57% and 10.64% among IDU and FSW groups in Haiphong. Three HBV genotypes/subtypes were confirmed, subtypes B4 was predominant (79.87%), followed by subtypes C1 (18.87%) and subtypes I1 (1,26%). Two subtypes I1 strains were indentified. Subtype 57
2. TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6 - 2013 I1 was identified with very rare prevalence in Vietnam. Lamivudine resistant rate was 3.84% (L80I mutation: 1.92%; M204I mutation: 1.92%) and tenofovir resistant rate was 1.92% (M204I mutation). The resistant rate of adefovir and entercavir was 0%. M204I mutation (YMDD =>YIDD) was cross- resistant mutation, HBV will resistant with lamivudine, tebivudine and tenofovir. The appearance of cross-resistant mutations can expect treatment failure with multi-drugs in future. The buidinge of a national program to monitor the appearance HBV drug resistant mutations is very important. * Key words: HBV; Drug resistant mutation; Intravenous drug user; Female sex worker. ĐẶT VẤN ĐỀ Tổng cộng 633 đối tượng, trong đó: - Nhóm TCMT: 492 đối tượng có TCMT, Viêm gan virut B (HBV) là vấn đề sức đang quản lý cai nghiện ở các Trung tâm khỏe được quan tâm trên toàn thế giới. Giáo dục và Lao động xã hội Hải Phòng. Khoảng 5% dân số thế giới bị nhiễm HBV, tương đương với 350 triệu người [8, 9]. - Nhóm GMD: 141 đối tượng hành nghề Theo kết quả nghiên cứu của chúng tôi mại dâm, đang quản lý tại các Trung tâm tháng 9 - 2008 trên 1.077 đối tượng ở Hải Giáo dục và Lao động xã hội Hải Phòng. Phòng, tỷ lệ nhiễm HBV là 12,2% [1]. Đa số 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. nhiễm HBV mạn tính, một số khá lớn là tình * Kỹ thuật và sinh phẩm sử dụng trong trạng viêm gan B mạn tính và có nhu cầu nghiên cứu: điều trị bệnh. Thuốc điều trị HBV hiện nay gồm: interferon alfa, peginterferon alfa, các - Các mẫu huyết thanh được sàng lọc nucleosid [3, 4, 5]. Trong đó, các chế phẩm nhiễm HBV bằng kít Determin của ABBOTT của interferon có giá thành rất cao và đa số (Nhật Bản) nhằm phát hiện kháng nguyên bệnh nhân không có cơ hội sử dụng. Các bề mặt của virut viêm gan B (HBsAg). thuốc thuộc nhóm nucleosid analogues - Các mẫu có kết quả HBsAg dương tính gồm: lamivudine, adefovir dipivoxil, entecavir, sẽ được tách HBV-ADN, sử dụng kít Smitest tenofovir và emtricitabine hiện đang sử EX-R&D (Genome science laboratories, dụng chủ yếu và rất có hiệu quả trong điều Fukushima, NhËt Bản). trị HBV [2]. Tuy nhiên, vấn đề lựa chọn - Chạy PCR khuyếch đại vùng gen Pol-RT phác đồ điều trị hợp lý và có sơ sở để đảm của HBV bằng sinh phẩm ampli Tag Gold, bảo hiệu quả của quá trình điều trị gặp nhiều khó khăn do thông tin về kháng thuốc Ampplied Biosystems với các cặp primer: của HBV tại Việt Nam được công bố không HB1F(18-39)/HB1R(534-557) và HB2F(414- nhiều. Vì vậy, hiệu quả điều trị còn thấp và 433)/HB2R(970-989) (Fuminaka Sugauchi làm cho nguy cơ kháng thuốc của HBV ngày và CS, 2001). càng cao. Mục tiêu của nghiên cứu này - Giải trình tự gen trực tiếp bằng kit Big nhằm: Nghiên cứu tỷ lệ đột biến gen kháng Dye terminator (genetic analyzer, ABI PRISM thuốc của HBV ở đối tượng TCMT và GMD 3130, Applied biosystems). tại Hải Phòng. * Xử lý số liệu bằng các phần mềm: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP - So sánh trình tự nucleotid các trình tự NGHIÊN CỨU sử dụng chương trình phần mềm Clustal W 1. Đối tƣợng nghiên cứu. (Thompson, 1994) và đoạn trình tự mẫu lấy 58
3. TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6 - 2013 từ Genbank/EMBL/DDBJ. hợp hướng dẫn của Standford university - Xác định đột biến kháng thuốc của HBV trên địa chỉ Web: trên cơ sở giải trình tự gen vùng Pol-RT HBV/HBVseq/development/hbvseq.pl?actio của HBV. Đối chiếu kết quả đột biến theo n=showSequenceForm hướng dẫn liệt kê theo bảng 1 [2, 9] và kết Bảng 1: Vị trí đột biến kháng lamivudine, telbivudine, adeforvir, telnofovir và entercavir. Lamivudine Telbivudine Adeforvir Telnofovir Entercavir Vị trí đột L80V/I; M204I A181V/T; A194T; V173L; L180M; M204V; biến V173L; N236T; L180M; I169T; T184G; S202I; L180M; N238D; M250V M204I; V214A; M204V/I; V84M; Q215S I169T; A181T; S85A; M204S; V214A; T184S; Q215S Q215S KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 1. Tỷ lệ nhiễm HBV. Bảng 2: Tỷ lệ nhiễm HBV nhóm đối tượng TCMT và GMD ở Hải Phòng. HBsAg (+) NHÓM n TUỔI TRUNG BÌNH n % TCMT 492 38,72 52 10,57 GMD 141 28,88 15 10,64 Tổng 633 67 10,59 Tû lệ nhiễm HBV tại Hải Phòng là 10,59%, không có sự khác biệt về tỷ lệ nhiễm HBV giữa nhóm TCMT và GMD (p > 0,05). 2. Phân bố kiểu genotýp của HBV. Bảng 3: Phân bố kiểu genotýp của HBV dựa trên vùng gen Pre-S1. GENOTÝP B4 GENOTÝP C1 GENOTÝP I1 NHÓM n n % n % n % TCMT 52 41 78,85 10 19,23 1 1,92 GMD 15 11 73,33 3 20 1 6,67 Tổng 67 52 77,61 13 19,40 2 2,99 Nhóm nghiên cứu đã tiến hành giải trình tự vùng gen Pre-S1 của 67 chủng HBV. Trên cơ sở các trình tự được giải mã này, chúng tôi truy cập vào trang Web: 60
4. TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6 - 2013 để tiến hành lấy các đoạn gen Pre-S1 reference của genotýp HBV đã công bố và đối chiếu kết quả. Kết quả cho thấy genotýp B4 rất phổ biến tại Hải Phòng và chiếm 77,61%, tiếp theo là genotýp C (19,4%). Có 2 chủng (2,99%) thuộc genotýp I1 được xác định. Đây là những chủng it gặp tại Việt Nam [6, 7]. 3. Tỷ lệ đột biến kháng thuốc của HBV. Bảng 4: Tỷ lệ đột biến gen kháng thuốc của HBV với lamivudine. VỊ TRÍ ĐỘT BIẾN GENOTÝP B4 (n = 52) GENOTÝP C1 (n = 13) GENOTÝP I1 (n = 2) n % n % n % L80V 0 0 0 L80I 1 1,92 0 0 I169T 0 0 0 V173L 0 0 0 L180M 0 0 0 A181T 0 0 0 T184S 0 0 0 M204V 0 0 0 M204I 1 1,92 0 0 M204S 0 0 0 Q215S 0 0 0 Tổng 2 3,84 0 Tỷ lệ đột biến gen kháng thuốc lamivudine kháng đa thuốc dòng nucleoside analogue, trong 67 chủng HBV nghiên cứu là 3,84% ngoài kháng lamivudine, chủng virut này (2/67). Các đột biến kháng lamivudine đều có thể kháng cả 2 thuốc là telbivudine và của genotýp B và không thấy xuất hiện đột telnofovir. Đây là 2 thuốc được sử dụng khá biến kháng lamivudine của HBV genotýp C phổ biến trong điều trị trên thế giới, nhưng trong 67 chủng HBV nghiên cứu. Một chủng hiện chưa được sử dụng nhiều tại Việt Nam. HBV genotýp B xuất hiện đột biến kiểu YMDD Một chủng HBV genotýp B xuất hiện đột tại vị trí aa 204 của vùng gen Pol-RT. Axít biến tại vị trí aa 80 của vùng gen Pol-RT, amin tại vị trí aa 204 của vùng gen Pol-RT là methionine được thay thế bằng aa isoleucin aa leucine tại vị trí 80 được thay thế bằng và bộ tứ aa YMDD (tyrosine-methionine- aa isoleucin. Như vậy, chủng này sẽ chỉ aspartate-aspartate) chuyển thành YIDD. kháng lamivudine đơn độc và theo cơ chế Với cơ chế đột biến M204I. Đây là đột biến đột biến L80I. 61
5. TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6 - 2013 Bảng 5: Tỷ lệ đột biến gen kháng thuốc Tỷ lệ đột biến gen kháng thuốc adeforvir của HBV với adefovir. và entercavir trong 67 chủng HBV nghiên VỊ TRÍ GENOTÝP GENOTÝP GENOTÝP cứu là 0% (0/67), tỷ lệ đột biến gen kháng ĐỘT B4 (n = 52) C1 (n = 13) I1 (n = 2) thuốc tenofovir là 1,92% (1/67). BIẾN n % n % n % Sự xuất hiện đột biến tự nhiên tại vị trí V84M 0 0 0 aa 204 vùng gen Pol-RT theo kiểu YIDD là S85A 0 0 0 một yếu tố quan trọng để cảnh báo nguy cơ A181V 0 0 0 bệnh nhân được điều trị trên lâm sàng sẽ A181T 0 0 0 thất bại với thuốc lamivudine và thậm chí cả với telbivudine và tenofovir ngay từ lần V214A 0 0 0 điều trị đầu tiên. Do vậy, vấn đề thầy thuốc Q215S 0 0 0 lâm sàng chỉ định làm xét nghiệm phát hiện N236T 0 0 0 đột biến kháng thuốc nhằm lựa chọn thuốc N238D 0 0 0 điều trị hợp lý và tiên lượng hiệu quả điều Tổng 0 0 0 trị cho người bệnh cần đặt ra sớm, điều này sẽ tiết kiệm được thời gian, chi phí điều trị Bảng 6: Tỷ lệ đột biến gen kháng thuốc và đảm bảo phác đồ điều trị cho bệnh nhân của HBV với entercavir. tối ưu nhất. VỊ TRÍ GENOTÝP GENOTÝP GENOTÝP ĐỘT B4 (n = 52) C1 (n = 13) I1 (n = 2) BIẾN KẾT LUẬN n % n % n % I169T 0 0 0 - Tỷ lệ nhiễm HBV ở 633 đối tượng V173L 0 0 0 (TCMT = 492 và GMD = 141) ở Hải Phòng L180M 0 0 0 là 10,59% (67/633), trong đó, đối tượng T184G 0 0 0 TCMT là 10,67% và GMD 10,64%. Genotýp phổ biến trên nhóm đối tượng nghiên cứu S202I 0 0 0 này là genotýp B (B4 là 77,61%); tiếp theo M204V 0 0 0 là genotýp C (C1: 19,4%) và genotýp I (I1: M250V 0 0 0 2,99%). Tổng 0 0 0 - Tỷ lệ đột biến gen kháng thuốc lamivudine Bảng 7: Tỷ lệ đột biến gen kháng thuốc trong 67 chủng HBV được giải trình tự gen của HBV với tenofovir. là 3,84% (2/67), tất cả là HBV genotýp B, không thấy xuất hiện đột biến kháng thuốc B4 (n = 52) C1 (n = 13) I1 (n = 2) của các chủng genotýp C. Xuất hiện một n % n % n % chủng đột biến tại vị trí aa 80 của vùng Pol-RT (L80I) và một chủng có đột biến kiểu YMDD L180M 0 0 0 tại vị trí aa 204 của vùng Pol-RT (M204I). A194T 0 0 0 Với đột biến M204I, bộ tứ aa là YMDD đổi M204I 1 1,92 0 0 thành YIDD và chủng virut này kháng cả V214A 0 0 0 lamivudine, telbivudine và telnofovir. Tỷ lệ đột Q215S 0 0 0 biến gen kháng thuốc adeforvir và entercavir Tổng 1 1,92 0 0 trong 67 chủng HBV nghiên cứu là 0%. 62
6. TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6 - 2013 TÀI LIỆU THAM KHẢO 5. Wen X, Li X, Xie H. Lamivudine for acute hepatitis B infection. Hepatology in AASLD 1. Nguyen HC, Ishizaki A, Phan TTC, Hoang practice, Guideline. 2007. TTH, Nguyen VT, Tanimoto T, Lihana PW, 6. Tran Thien Tuan Huy, Hiroshi Ushijima et al. Matsushita K, Bi X, Pham VT, Ichimura H. Characteristics of core promoter and Precore stop Prevalence of HBV infection among different codon mutants of hepatitis B virrus in Vietnam. HIV-risk groups in Hai Phong, Vietnam. J Med J of Med Virology. 2007, 74, pp.228-236. Virol. 2011, 83, pp.399-404. 7. Bui Xuan Truong, Yoshihiko Yano, Yasushi 2. Zoulim F, Locarnini S. Hepatitis B virus Seo et al. Variations in the core promoter/pre- resistance to nucleos(t)ide analogues. Gastroenterolgy core region in HBV genotype C in Japanese and 2009, Nov, 137 (5), pp.1593-608. Northern Vietnamese patients. J of Med Virology. 3. Kobayashi M, Suzuki F. Response to long- 79, pp.1293-1304. term lamivudine treatment in patients infected 8. Saul Krugman, M.D et al. Hepatitis B with hepatitis B virus genotypes A, B and C. infection: Strategies for clinicians. Infections in J Med Virol. 2006, 78 (10), pp.1276-1283. medicine. New York University Medical Center. 4. Kumar M, Satapathy S, Monga R. A 2008, pp.5-30. randomized controlled trial of lamivudine to treat 9. Kao JH, Chen DS. Global control of hepatitis acute hepatitis B. Hepatology. 2007, 45 (1), B virus infection. Lancet Infect Dis. 2009, Jul, 2 (7), pp.97-101. pp.395-403. Review. 63
7. TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6 - 2013 64