Nghiên cứu tuyển chọn và nuôi cấy vi khuẩn tả (vibrio cholerae) sinh độc tố tả in vitro

Nội dung text: Nghiên cứu tuyển chọn và nuôi cấy vi khuẩn tả (vibrio cholerae) sinh độc tố tả in vitro

1. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN VÀ NUÔI CẤY VI KHUẨN TẢ (VIBRIO CHOLERAE) SINH ĐỘC TỐ TẢ IN VITRO Đỗ Minh Trung*; Phạm Thế Tài*; Hoàng Đắc Thăng* Lê Thu Hồng**; Lê Thu Hà***; Lê Văn Đông* TÓM TẮT Tả là bệnh nhiễm trùng đường ruột do vi khuẩn tả (VKT) Vibrio cholerae gây ra. Độc tố tả (ĐTT) (cholera toxin) là yếu tố độc lực chủ yếu của VKT, đồng thời là tác nhân chính gây bệnh tả. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy chỉ những chủng VKT sinh ĐTT mới liên quan tới các vụ dịch tả. Vì vậy, ĐTT là chỉ điểm quan trọng của các chủng vi khuẩn gây dịch tả. Tuy nhiên, VKT thường chỉ sinh ĐTT trong điều kiện in vivo, khi đã nhiễm và tăng sinh trong môi trường đường ruột của đối tượng bị nhiễm. Trong điều kiện nuôi cấy in vitro bằng môi trường nuôi cấy thông thường, vi khuẩn này tăng sinh mà không tiết độc tố. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tái phân lập 10 chủng VKT từ các vụ dịch tiêu chảy cấp do tả trước đây; hoạt hóa, tăng sinh và lựa chọn được chủng VKT tăng sinh mạnh nhất. Chủng vi khuẩn này sinh ĐTT trong điều kiện nuôi cấy in vitro bằng môi trường nuôi cấy có chứa pepton, cao men bia, NaCl và NaHCO3 qua khảo sát bằng kỹ thuật GM1-ELISA đặc hiệu với ĐTT. * Từ khóa: Vi khuẩn tả; Độc tố tả; Kỹ thuật GM1-ELISA. SELECTION AND BACTERIAL CULTURE OF VIBRIO CHOLERAE PRODUCING CHOLERA TOXIN IN VITRO SUMMARY Cholera is an intestinal infection caused by the bacterium Vibrio cholerae (V. cholerae). Cholera toxin (CT) secreted by V. cholerae is the causative agent of cholera and is a major agent involved in severe diarrheal diseases. Previous studies have found that only the strains of V. cholerae which secret CT are related to outbreaks of cholera. Therefore, ability of CT secretion is an important characteristic of V. cholerae strains that cause cholera outbreaks. However, V. cholerae only secrets CT in vivo conditions, when the bacteria have infected and developed inside intestinal tract of exposed persons. If the V. cholerae is in vitro cultured in normal medium, it increases the number without CT secretion. One of preventive methods to cholera is the usage of antibodies anti CT. * Học viện Quân y ** Bệnh viện 103 *** Viện Vệ sinh Phòng dịch Quân đội Người phản hồi (Corresponding): Lê Văn Đông (levandong@yahoo.com) Ngày nhận bài: 16/9/2013; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 31/10/2013 Ngày bài báo được đăng: 8/11/2013 83
2. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 With the aim of collecting a large amount of CT used as sources of antigenic material to produce antibodies anti-CT, this study targeted to select suitable V. cholerae strain in Vietnam and specific culture medium enabling CT secretion in vitro. Ten strains of V. cholerae causing previous outbreaks in Vietnam in 2007 were used as candidates for selection. The strain with the strongest reproductive capacity in TCBS agar was chosen. The culture medium which used in this study contained peptone, yeast extract, NaCl, NaHCO3. CT released in culture medium was determined by GM1-ELISA technique. * Key words: Vibrio cholerae; Cholera toxin; GM1-ELISA technique. ĐẶT VẤN ĐỀ chọn được các chủng V. cholerae sinh độc tố để sử dụng ĐTT làm nguyên liệu Bệnh tả gây ra bởi VKT (Vibrio chế tạo antidote. Hơn nữa, tách độc tố từ cholerae). VKT là một loại vi khuẩn những chủng lưu hành tại Việt Nam, tạo Gram âm sinh ĐTT (cholerae toxin). ra đáp ứng miễn dịch bảo vệ sẽ tốt hơn ĐTT tác động lên tế bào biểu mô niêm và chủ động trong nghiên cứu và sản mạc của ruột, gây tiêu chảy nặng kèm xuất antidote. Xuất phát từ ý nghĩa thực theo rối loạn nước, điện giải, là dấu hiệu tiễn trên nghiên cứu này được tiến hành đặc trưng của bệnh tả. Trường hợp bệnh nhằm: Tái hoạt hóa, tuyển chọn các chủng nặng có thể gây tử vong trong thời gian V. cholerae tăng sinh mạnh trong điều ngắn. Bệnh tả có khả năng bùng phát kiện nuôi cấy chọn lọc bằng môi trường thành đại dịch trong thời gian rất ngắn đặc hiệu với VKT và kích thích vi khuẩn và trên phạm vi rộng, ảnh hưởng nặng sinh độc tố trong điều kiện nuôi cấy in nề đến sức khoẻ, kinh tế xã hội và an vitro bằng môi trường kích thích sinh ninh của nhiều quốc gia. Tuy nhiên, độc tố. VKT thường chỉ sinh ĐTT trong điều kiện in vivo, khi đã nhiễm vào tăng sinh VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP trong môi trường đường ruột của đối NGHIÊN CỨU tượng bị nhiễm. Trong điều kiện nuôi cấy in vitro bằng môi trường nuôi cấy 1. Vật liệu nghiên cứu. thông thường, vi khuẩn này chỉ tăng * Đối tượng nghiên cứu: 10 chủng sinh mà không tiết độc tố. ĐTT từ V. cholerae được phân lập trong các vụ V. cholerae có ý nghĩa khi được sử dụng dịch tiêu chảy cấp do tả năm 2007 và ký làm nguyên liệu chế tạo antidote để hiệu lần lượt là V1, V2, V3, V4, V5, phòng chống khủng bố, trong trường V10, V25, V35, V47, V50. Đựng các hợp này, sử dụng độc tố tả như một loại chủng sau phân lập trong ống nghiệm vũ khí sinh học. Muốn thu được độc tố cryovial và lưu giữ ở -80°C tại Khoa Vi cần phải phân lập, nuôi cấy và tuyển sinh Y học, Bệnh viện 103. 84
3. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 * Hóa chất, thiết bị nghiên cứu: môi chủng VKT đó có khả năng tăng sinh tốt trường TCBS agar, thạch kiềm (Merck) trên môi trường thạch TCBS, là môi để nuôi cấy, phân lập và tuyển chọn V. trường nuôi cấy đặc hiệu của V. cholera. cholerae; hóa chất OPD, BSA, GM1, Hình thái của các khuẩn lạc trên môi kháng thể đơn clôn kháng ĐTT, kháng trường nuôi cấy thạch kiềm và TCBS thể IgG gắn enzym HRP (Sigma); ĐTT phải phù hợp với đặc điểm hình thái của chuẩn (Enzo); pepton, cao men bia, NaCl, chủng V. cholera. Các phản ứng sinh NaHCO3, NaH2PO4, NaOH, HCl, H2CO3, hóa bao gồm: oxidase, gluco, gas, lacto, (NH)2SO4 (Merck); gram kit, PBS, thuốc saccaroza, lysine, ornithine, 1% NaCl và thử catalase, thuốc thử oxidase, Tween nhuộm gram. Các khuẩn lạc phù hợp về (BioRad). Plate ELISA và các hóa vật tư tính chất sinh hóa học được xác định tiêu hao dùng cho nuôi cấy V. cholerae, bằng phản ứng ngưng kết với kháng thể phản ứng ELISA, phản ứng sinh hóa tả O1 và Ogawa. khác đều đạt tiêu chuẩn phân tích và * Nuôi cấy kích thích V. cholerae sinh được cung cấp từ Merck, Sigma và các ĐTT in vitro: hãng có uy tín khác. Sau khi tuyển chọn được chủng 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. V. cholerae tăng sinh mạnh trong môi * Hoạt hóa, nuôi cấy tăng sinh và tuyển trường thạch TCBS, chủng VKT đó chọn V. cholerae: được cấy chuyển sang môi trường kích thích sinh ĐTT. Thành phần của môi Sau khi lấy ra khỏi tủ lạnh -80ºC, các trường bao gồm pepton, cao men bia, ống nghiệm đựng VKT được giã đông NaHCO có bổ sung NaCl. Môi trường bằng cách đặt ở tủ ấm 370C trong 2 giờ 3 pepton kiềm có pH từ 8 - 9, là môi trước khi tiến hành nuôi cấy tăng sinh. trường tăng sinh tốt cho V. cholerae. Nuôi cấy tăng sinh: nuôi cấy mỗi Nồng độ từng thành phần đã được tối ưu chủng VKT trên hai đĩa thạch, bao gồm hóa để khả năng sinh ĐTT cao nhất. một đĩa thạch kiềm và một đĩa thạch Đưa chủng VKT tuyển chọn vào bình TCBS. chứa 500 ml pepton kiềm và để 35ºC Tuyển chọn chủng VKT: chủng VKT trong thời gian 24 giờ (1 giờ lắc bình được tuyển chọn phải đảm bảo cho kết nuôi cấy 1 lần để kích thích vi khuẩn quả phản ứng sinh hóa phù hợp với đặc mọc nhanh). Sản phẩm thu hoạch là dịch điểm của chủng V. cholera. Đồng thời, lên men của VKT. Dịch được ly tâm 86
4. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 4.500 vòng/phút x 25 phút loại bỏ cặn nồng độ 0,5 mg/ml, thời gian 10 phút. (bất hoạt bằng phương pháp cách thủy Xác định kết quả thông qua mật độ 80ºC/20 phút), thu dịch nổi, phần dịch quang học của giếng đo bằng máy đọc nổi là phần có chứa ĐTT. Kiểm tra sự có DTX 880 (Beckman Coulter, Mỹ) ở bước mặt của ĐTT trong dịch nổi bằng kỹ sóng 450 nm. thuật GM1-ELISA. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ * Phản ứng GM1-ELISA phát hiện BÀN LUẬN ĐTT: 1. Tái phân lập, hoạt hóa và tuyển Phản ứng GM1-ELISA được xây dựng chọn V. cholerae. theo nguyên lý kỹ thuật ELISA kiểu sandwich, sử dụng ganglioside GM1 là Từ 10 chủng V. cholerae được lưu phối tử đặc hiệu với ĐTT gắn lên pha giữ ở -80°C, chúng tôi tiến hành cấy hoạt hóa lại và kiểm tra tính chất sinh rắn làm phân tử bắt giữ ĐTT. Kháng thể vật hóa học để xác định lại V. cholerae. đơn clôn kháng ĐTT được dùng để phát Kết quả thu được 10 chủng V. cholerae hiện sự có mặt của ĐTT đã bị GM1 bắt trên môi trường phân lập khuẩn lạc có giữ. Các bước cụ thể như sau: gắn GM1 hình dạng đặc trưng. Trên môi trường vào các giếng của đĩa ELISA, để qua thạch kiềm: khuẩn lạc tròn trong, long đêm rồi rửa với PBS-T, block các giếng lanh như giọt sương, đường kính 1 - bằng BSA 1%, thời gian 30 phút, sau đó 2 mm; trên môi trường thạch TCBS: rửa bằng PBS-T. ĐTT chuẩn (chứng khuẩn lạc có màu vàng, lồi bóng, đường dương, độ tinh sạch > 95%); dịch nuôi kính 2 - 3 mm. cấy cần xác định ĐTT và môi trường nuôi cấy không có V. cholera (chứng âm) Mặc dù V. cholerae có thể phát triển được cho vào các giếng đã gắn GM1 để trên nhiều loại môi trường khác nhau. cho ĐTT gắn với GM1 trong giếng, rồi Tuy nhiên, môi trường TCBS được sử rửa bằng PBS-T. Cho kháng thể kháng dụng rộng rãi vì có tính chọn lọc tốt để ĐTT vào các giếng, thời gian 1 giờ, rửa phân lập và tuyển chọn V. cholerae. các giếng bằng PBS-T, cho kháng thể V. cholerae thuộc họ Vibrionaceae thứ hai gắn enzym HRP vào các giếng, cùng với Aeromonas, Phobacterium và thời gian 1 giờ, rửa lại bằng PBS-T. Plesiomonas. Các giống này có thể phân Cho cơ chất vào các giếng phản ứng với biệt được bằng phản ứng sinh hóa. 87
5. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 Bảng 1: Kiểm tra V. cholerae bằng các test thử phản ứng sinh hóa. TEST KIA H2S GAS OXIDASE SACAROSE LYSINE ORMITHINE 1% NaCl CHỦNG Glu (+) V01 - - + + + + + Lacto (+) Glu (+) V02 - - + + + + + Lacto (+) Glu (+) V03 - - + + + + + Lacto (+) Glu (+) V04 - - + + + + + Lacto (+) Glu (+) V05 - - + + + + + Lacto (+) Glu (+) V10 - - + + + + + Lacto (+) Glu (+) V25 - - + + + + + Lacto (+) Glu (+) V35 - - + + + + + Lacto (+) Glu (+) V47 - - + + + + + Lacto (+) Glu (+) V50 - - + + + + + Lacto (+) Cũng giống như các phẩy khuẩn khác, V. cholerae là một vi khuẩn Gram âm, hiếu kỵ khí tùy tiện, không sinh nha bào, có khả năng lên men các loại carbonhydrat và chuyển hóa bằng cách oxy hóa. Kết quả các phản ứng sinh hóa bao gồm: oxidase (+), gluco (+), gas (-), lacto (+) chậm, saccaroza (+), lysine (+), ornithine (+), 1% NaCl (+). Kết quả này phù hợp với đặc điểm sinh hóa của V. cholerae. Sau khi lựa chọn 10 chủng VKT, chúng tôi tiến hành pha các chủng VKT trong nước muối sinh lý 0,9% vô trùng để tạo thành hỗn dịch 108 vi khuẩn⁄ml, cấy 0,1 ml hỗn dịch 108 vi khuẩn⁄ml của mỗi chủng được ria cấy đều trên bề mặt đĩa thạch, ủ 35ºC⁄18 giờ. Quan sát và đếm số lượng khuẩn lạc trên môi trường thạch Muller - Hinton, từ đó làm cơ sở lựa chọn chủng có khả năng phát triển tốt nhất làm chủng tăng sinh độc tố tả. 88
6. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 Bảng 2: Số lượng vi khuẩn mọc trên thạch Muller-Hinton. CHỦNG VKT THẠCH MULLER - HINTON V01 V02 V03 V04 V05 V10 V25 V35 V47 V50 Số vi khuẩn mọc 102 102 103 104 102 103 103 104 102 105 Kết quả cho thấy, chủng V50 có khả năng tăng sinh mạnh nhất. Vì vậy, chủng V50 được lựa chọn để tiến hành nuôi cấy sinh ĐTT trong môi trường pepton kiềm. 2. Nuôi cấy V. cholerae sinh ĐTT trong môi trƣờng in vitro. Sau khi nuôi cấy chủng V50 trong môi trường pepton kiềm kích thích sinh ĐTT, thu hoạch dịch nuôi cấy, xử lý và kiểm tra sự có mặt của ĐTT. Kết quả phát hiện ĐTT trong dịch lên men nuôi cấy trong môi trường sinh độc tố được thể hiện trong hình dưới. Hình 1: Phát hiện cholera toxin trong dịch nuôi cấy V. cholerae bằng kỹ thuật GM1-ELISA. (CT: Cholera toxin chuẩn; DN: dịch lên men V. cholerae được ly tâm, lọc vô khuẩn thu dịch nổi; DC: Môi trường nuôi cấy chưa có V. cholerae). Dựa vào cơ chế thụ thể đặc hiệu của nhằm phát hiện ĐTT từ dịch lên men ĐTT là gangliosid GM1 và phản ứng ELISA, nuôi cấy V. cholerae. Kết quả cho thấy: tiến hành làm xét nghiệm GM1-ELISA sau khi đồng nhất các mẫu về cùng một 89
7. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 nồng độ protein đối với 3 loại mẫu: ĐTT TÀI LIỆU THAM KHẢO chuẩn (chứng dương), mẫu DN là mẫu 1. Phùng Đắc Cam. Vibrio cholerae và bệnh dịch lên men V. cholerae sau khi ly tâm dịch tả. Nhà xuất bản Y học. Hà Nội. 2003. thu dịch nổi bỏ cặn và mẫu DC (chứng 2. Bộ Y tế. Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị tiêu chảy cấp. Tạp chí Y học thực hành. âm), sử dụng bước sóng 450 nm đo mật 2007, số 4, tr.24-27. độ quang, kết quả OD ở tỷ lệ pha loãng 3. Hà Thị Quyến, Dương Hồng Quân, 1/10 lần lượt là 2,1558 (chứng dương); Đinh Duy Kháng, Phùng Đắc Cam. Nghiên 0,9594 (dịch nổi) và 0,483 (chứng âm). cứu chế tạo bộ kit để phát hiện nhanh vi khuẩn tả (Vibrio cholerae) trong nước. Tạp chí Như vậy, hệ số OD mẫu dịch nổi gấp Sinh học. 2005, số 27 (4), tr.57-60. khoảng 2 lần so với chứng âm (0,9594 4. Nguyễn Bình Minh. Áp dụng kỹ thuật so với 0,483). Kết quả trên cho thấy sau ngưng kết latex thụ đảo động (RPLA) định khi nuôi cấy V. cholerae trong môi trường lượng ĐTT. Tạp chí Y học dự phòng. 2008, pepton kiềm, ĐTT đã xuất hiện trong số 2 (94), tr.57-61. 5. Davy Vanden Broeck, Caroline Horvath, môi trường dịch nổi và có hoạt tính Marc J.S. De Wolf. Vibrio cholerae: Cholera thể hiện ở kết quả xét nghiệm ELISA. toxin. The International Journal of Biochemistry Với cholera toxin thu được từ dịch nổi, & Cell Biology. 2007, 39, pp.1771-1775. đây sẽ là sản phẩm, nguyên liệu cho việc 6. Akihiro Minami, Satoru Hashimoto, tách tinh sạch phục vụ cho những nghiên Hisao ABE, Michiko Arita, Tooru Taniguchi, Takeshi Honda, Toshio Miwatani, and Mitsuaki cứu sau này. Nishibuchi. Cholera enterotoxin production in Vibrio cholerae 01 strains isolated from KẾT LUẬN the environment and from humans in Japan. Applied and Environmental Microbiology, Nghiên cứu đã tái phân lập và nuôi Aug. pp.2152-2157. cấy hoạt hóa thành công 10 chủng V. 7. Masaaki Iwanaga and Koichiro cholerae, từ đó tuyển chọn được chủng Yamamoto. New medium for the production V. cholerae ký hiệu V50 có khả năng of cholera toxin by vibrio cholerae 01 biotype El Tor. Journal of Clinical Microbiology. Sept. tăng sinh mạnh và sinh ĐTT trong điều pp.405-408. kiện nuôi cấy in vitro với môi trường 8. Mark Dertzbaugh. Method for purifying chứa pepton, cao men bia, NaHCO3 có cholera toxin. United States Patent. Patent bổ sung NaCl. number 6,008, 329. 90
8. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 91