Nghiên cứu tạo khối ung thư đại tràng người trên chuột thiếu hụt miễn dịch bằng kỹ thuật ghép dị loài

Nội dung text: Nghiên cứu tạo khối ung thư đại tràng người trên chuột thiếu hụt miễn dịch bằng kỹ thuật ghép dị loài

1. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2012 NGHIÊN CỨU TẠO KHỐI UNG THƢ ĐẠI TRÀNG NGƢỜI TRÊN CHUỘT THIẾU HỤT MIỄN DỊCH BẰNG KỸ THUẬT GHÉP DỊ LOÀI Bùi Khắc Cường*; Hồ Anh Sơn*; Nguyễn Lĩnh Toàn* TÓM TẮT Mô hình thực nghiệm trên động vật có vai trò quan trọng trong nghiên cứu ung thư. Trong đó, ghép dị loài tạo khối ung thư người trên chuột thiếu hụt miễn dịch là một phương pháp được ứng dụng ở các trung tâm nghiên cứu ung thư trên thế giới. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã ứng dụng thành công mô hình ghép dị loài tế bào ung thư đại tràng (UTĐT) người dòng HT-29 dưới da đùi phải của chuột thiếu hụt miễn dịch. Kết quả: 20/20 (100%) chuột ghép tế bào UTĐT này phát triển hình thành khối ung thư. Kích thước trung bình của khối ung thư đạt 22,8 ± 0,93 mm đường kính sau 4 tuần được ghép tế bào HT-29. Phân tích mô bệnh học cho thấy hình ảnh của một mô ung thư điển hình. * Từ khóa: Ung thư; Ung thư đại tràng; Ghép dị loài. Establishment of human colon adenocarcinoma tumor model on nude mice by xenograft method Summary Experimental animal model plays a key role in cancer researchs. Human tumours created by cancer cell line xenograft method have been used in cancer research centers in the world. In this study, we had succesfully applied the xenograft model to implant the human colon adenocarcinoma cell line (HT-29) into subcutanous of the righ thigh of nude mice. The results showed that the human colon adenocarcinoma cells developed tumor in 20/20 (100%) of nude mice. The mean size of tumor was 22.8 ± 0.93 mm diameter within 4 weeks after implantation of HT-29 cells. Histological analysis of tumors indicated a typical carcinoma tissue. * Key words: Cancer; Colon cancer; Xenograft. ĐẶT VẤN ĐỀ thư biểu mô tuyến. Nam giới mắc bệnh ung Ung thư biểu mô đại tràng là một loại thư này nhiều hơn nữ giới. Theo thống kê ung thư phổ biến ở hệ tiêu hóa, là nguyên của Tổ chức Y tế Thế giới (2008), ở Việt nhân gây tử vong đứng hàng thứ ba trong Nam, UTĐT đứng hàng thứ tư về cả số ca các trường hợp tử vong do ung thư ở Hoa mắc mới và số ca tử vong. Kỳ [1]. Tại thời điểm phát hiện bệnh trên Để đạt được tiến bộ trong nghiên cứu bệnh nhân (BN), một nửa trường hợp đã có ung thư nói chung, UTĐT nói riêng, cần thiết di căn xa. Phần lớn UTĐT thuộc loại ung phải có các mô hình ung thư in vivo phù hợp. * Học viện Quân y Chịu trách nhiệm nội dung khoa học: PGS. TS. Lê Văn Sơn TS. Nguyễn Đặng Dũng 1
2. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2012 Ở Việt Nam, có khá nhiều mô hình nghiên ra bằng cách gây đột biến trên gen Foxn1, cứu ung thư trên động vật thực nghiệm, tuy dẫn đến không có tuyến ức, do đó, chúng nhiên, các mô hình này còn có nhiều hạn không có tế bào lympho T tham gia đáp chế, đó là khối ung thư đồng loài trên động ứng miễn dịch. Kiểu hình của chuột này vật không phải là khối ung thư của người. không có lông nên có tên gọi chuột nude. Chính vì vậy, nghiên cứu các phương pháp Do thiếu tế bào lympho T nên chúng không điều trị nhắm đích gặp nhiều khó khăn vì có đáp ứng miễn dịch thải ghép [2, 6]. Vì tính đặc hiệu loài và protein đích của tế bào vậy, loài chuột này có thể dung nạp được ung thư (TBUT). Trong khi đó, mô hình ghép nhiều loại tế bào từ các loài khác nhau. TBUT người trên động vật thiếu hụt miễn Chuột thiếu hụt miễn dịch được nhập khẩu dịch bằng ghép dị loài đã được áp dụng khá từ Công ty Charles-River (Hoa Kỳ). phổ biến ở nhiều trung tâm nghiên cứu ung - Môi trường nuôi cấy và bảo quản tế thư lớn trên thế giới [4, 5]. Mô hình này có bào: môi trường nuôi cấy tế bào McCoy's giá trị cho các nghiên cứu về khám phá các 5a Medium Modified (Catalog No. 30-2007, thuốc mới có tác dụng điều trị ung thư như ATCC), bổ sung 10% dung dịch huyết thanh thuốc điều trị nhắm đích, liệu pháp gen trị bào thai bê (FBS), dung dịch penicillin/ liệu ung thư hiện nay. Tuy nhiên, mô hình streptomycin, dung dịch PBS, dung dịch ghép TBUT người trên chuột thiếu hụt miễn Trypsin-EDTA (ATCC, Hoa Kỳ). Môi trường dịch mới bắt đầu được ứng dụng ở Học nuôi cấy đầy đủ thành phần cho thêm 5% viện Quân y. Đến thời điểm hiện tại, bằng DMSO được sử dụng để bảo quản tế bào các phương pháp truy cập thông tin khoa [1, 4]. học trong nước, chúng tôi chưa thấy bất kỳ công bố nào về ứng dụng mô hình ghép 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. TBUT đại trực tràng người trên động vật * Nuôi cấy tế bào UTĐT người: thiếu hụt miễn dịch ở nước ta. Nuôi cấy tế bào UTĐT người dòng HT - 29 Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi thực nuôi cấy trong môi trường McCoy's 5a hiện nghiên cứu này nhằm: Tạo khối ung Medium Modified bổ sung 10% FBS, 1% thư người từ tế bào UTĐT người trên chuột penicillin và streptomycin. Nuôi cấy tăng thiếu hụt miễn dịch bằng kỹ thuật ghép sinh TBUT trong chai có diện tích đáy chai dị loài. 75 cm2, đặt trong tủ vô trùng, duy trì nhiệt 0 độ 37 C và CO2 5%. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thay môi trường nuôi cấy 3 ngày/lần. Khi tế bào đạt mật độ 80% diện tích bề mặt 1. Đối tƣợng nghiên cứu. chai, tách khỏi chai nuôi bằng Trypsin - Tế bào UTĐT người dòng HT-29 (ATCC, EDTA 0,05% và cấy chuyển sang chai Hoa Kỳ). Đây là một dòng TBUT biểu mô nuôi cấy mới. Khi số lượng tế bào đủ lớn, tuyến của đại tràng được phân lập từ một thu hoạch tế bào và đếm số lượng tế bào BN nữ da trắng, có biểu hiện về một số thu được, điều chỉnh mật độ tế bào đạt oncogen như: myc +; ras +; myb +; fos +; mật độ 107 tế bào/ml. Hỗn dịch tế bào này sis +; p53 +; abl -; ros -; src -. được sử dụng để ghép trên chuột thiếu hụt - Chuột thiếu hụt miễn dịch (nude mice, miễn dịch. nu/nu Foxn1 ): chuột nhắt đực thiếu hụt miễn * Nuôi chuột thiếu hụt miễn dịch “nude dịch, là một loại chuột thí nghiệm được tạo mice”: 2
3. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2012 20 chuột nhắt đực thiếu hụt miễn dịch khỏi đùi và làm xét nghiệm mô bệnh học, được nuôi trong phòng vô trùng, duy trì phân tích hình ảnh mô ung thư. nhiệt độ phòng ở 28 ± 0,50C, độ ẩm 55 ± 5%, ánh sáng tự động điều khiển bật lúc 7 giờ, tắt lúc 19 giờ. Tiệt trùng thức ăn và nước uống trước khi sử dụng. Mỗi lồng chuột được để trên hệ thống giá có thông khí độc lập và lọc qua màng lọc vi khuẩn bảo đảm khả năng cách ly tốt với mầm bệnh. * Quy trình ghép TBUT người trên chuột a thiếu hụt miễn dịch: TBUT người sau khi thu hoạch đạt mật độ 107 tế bào/ml ghép lên chuột thiếu hụt miễn dịch, số lượng huyền dịch tế bào sử dụng để ghép là 0,1 ml/chuột, tương đương 106 tế bào. Vị trí ghép dưới da vùng đùi sau bên phải. Sau khi ghép, tiếp tục nuôi chuột b trong phòng vô trùng và theo dõi chặt chẽ diễn biến tại vị trí ghép cũng như toàn thân. Hình 1: Khối u hình thành trên chuột thiếu hụt miễn dịch. Khi khối u có thể quan sát bằng mắt thường, tiến hành đo kích thước 3 ngày/lần để theo a. Sau 6 ngày; b. Sau 30 ngày dõi tốc độ phát triển khối u. * Đường kính khối ung thư trên chuột: 3. Xử lý số liệu. sau 6 ngày ghép là 3,3 ± 0,26 mm; sau 30 ngày ghép là 22,8 ± 0,93 mm. Sử dụng phần mềm thống kê Statview 5.0. 2. Hình ảnh mô bệnh học của khối u KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU hình thành trên chuột. 1. Tỷ lệ hình thành và kích thƣớc khối Khối u sau khi bóc tách ra khỏi đùi chuột, 0 u trên chuột. cắt thành mảnh nhỏ, bảo quản ở -80 C, lấy 3 mảnh bảo quản trong dung dịch formalin Sau 1 tuần ghép tế bào, tỷ lệ xuất hiện 10% trong vòng 24 - 48 giờ. Sau đó, đúc khối u quan sát được bằng mắt thường là mảnh mô ung thư trong khối parafin, cắt lát 20/20 (100%). Kích thước khối u thay đổi từ 5 μm, nhuộm HE để phân tích hình ảnh mô 2 - 5 mm. Sau 3 tuần, khối u phát triển khá bệnh học mô ung thư hình thành trên chuột. nhanh làm thay đổi hình dạng đùi và ảnh hưởng tới quá trình vận động của chuột, Hình ảnh đại thể: khối u được tạo thành đường kính khối u đo được từ 12 - 18 mm. từ nhiều khối u nhỏ, tạo hình ảnh đa cung, Sau 4 tuần, khối ung thư phát triển đạt kích các cung liên kết với nhau. Ranh giới tương thước với đường kính từ 15 - 32 mm (hình đối rõ với các mô xung quanh, có thể bóc 1a, b). Tại thời điểm sau 4 tuần, phẫu thuật tách khỏi đùi chuột tương đối dễ dàng. chuột mang khối ung thư, bóc tách khối u ra Hình ảnh vi thể mô ung thư của khối u có cấu trúc gồm tế bào biểu mô trụ tăng 3
4. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2012 sinh, sắp xếp thành các ống tuyến nhỏ hoặc BÀN LUẬN tập trung thành từng đám. Lót lòng tuyến có vị trí chỉ một hàng tế bào, có vị trí nhiều Qua kết quả nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ hàng tế bào. Các tế bào biểu mô tuyến có thành công trong việc tạo khối ung thư nhân không đều, tăng sắc, hạt nhân rõ, có người trên chuột thiếu hụt miễn dịch rất cao, đạt 100% tổng số chuột ghép. Kết quả nhiều nhân chia bất thường. U có vùng bị nµy phù hợp với nghiên cứu của một số tác hoại tử, mô đệm u xâm nhiễm tế bào viêm. giả đã công bố: tỷ lệ thành công trong kỹ U xâm lấn tổ chức cơ vân (hình 2a, c). thuật ghép dị loài từ 85 - 100% (GG Steel [2] và Kubota T [3]). So với các mô hình ung thư thực nghiệm khác trên động vật, mô hình này có tỷ lệ thành công tương đương hoặc cao hơn. Bên cạnh đó, một ưu điểm nữa của kỹ thuật này là thời gian thực hiện nhanh, trong 1 tuần đã có thể đánh giá hiệu quả tạo khối ung thư trên động vật. Kỹ thuật này tạo ra các khối u với kích thước tương đối đồng đều, cùng ở một vị trí a ngay dưới da. Vì vậy, tạo thuận lợi cho quá trình theo dõi phát triển của khối u hàng ngày bằng các biện pháp không can thiệp. Điều này có ý nghĩa trong nghiên cứu, bởi vì, để đánh giá khối u phát triển trên động vật rất phức tạp, nếu khối u không ở các khu vực ngoại vi sẽ rất khó khăn trong theo dõi. Điều quan trọng là, các khối ung thư phát triển trên loài chuột này được hình b thành có nguồn gốc là TBUT đại trực tràng dòng HT-29 của người nên có giá trị lớn trong nghiên cứu điều trị đích, liệu pháp gen và sàng lọc thuốc kháng ung thư mới. Bởi vì, đích cuối cùng là điều trị loại ung thư người có tính đặc hiệu loài và tế bào rất cao. Vì vậy, mục đích nghiên cứu thử nghiệm tác dụng điều trị của các chế phẩm mới trên khối ung thư này sẽ đạt được và tương đồng về đặc điểm di truyền, cấu trúc c và chức năng của khối ung thư trên người Hình 2: Hình ảnh mô bệnh học mô UTĐT hơn so với những mô hình ung thư thực phát triển trên chuột sau ghép 30 ngày: nghiệm khác. hình ảnh TBUT biểu mô tuyến điển hình. KẾT LUẬN a. Độ phóng đại 40X; b. Độ phóng đại 100X; Qua kết quả nghiên cứu thiết lập và tiến c. Độ phóng đại 400X. hành trên chuột thiếu hụt miễn dịch, chúng tôi rút ra kết luận: 4
5. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2012 - Đã xây dựng thành công quy trình tạo 2. GG Steel, MJ Peckham. Human tumour khối ung thư người bằng ghép TBUT người xenografts: A critical appraisal. Br J Cancer. trên chuột thiếu hụt miễn dịch qua 3 bước: 1980, 41, Suppl, IV, pp.133-139. + Nuôi cấy tăng sinh tế bào đạt 107 tế 3. Kubota T. Metastatic models of human bào/ml. cancer xenografted in the nude mouse: the importance of orthotopic transplantation. J Cell + Ghép 106 tế bào vào dưới da đùi chuột Biochem. 1994, 56 (1), pp.4-8. thiếu hụt miễn dịch. 4. Lei K, Ye L, Yang Y, Wang GJ, Jiang QY, + Theo dõi khối u hình thành trên chuột Jiang Y, Wei YQ, Deng HX. RNA interference- 3 ngày/lần, khi đạt kích thước mong muốn mediated silencing of focal adhesion kinase sẽ sử dụng cho các mục đích nghiên cứu inhibits growth of human colon carcinoma tương ứng. xenograft in nude mice. J Biomed Nanotechnol. - Tỷ lệ tạo thành công khối UTĐT dòng 2010, 6 (3), pp.272-278. HT-29 của người trên chuột thiếu hụt miễn 5. Liu L, Nakatsuru Y, Gerson SL. Base dịch đạt 100%. Các khối u hình thành trên excision repair as a therapeutic target in colon chuột có thể quan sát được bằng mắt cancer. Clin Cancer Res. 2002, 8 (9), pp.2985- thường, theo dõi khối u phát triển bằng 2991. cách đo kích thước trực tiếp. Phân tích mô 6. Paulsen JE, Elgjo K. Effect of tumour size bệnh học chứng minh hình ảnh của một mô on the in vivo growth inhibition of human colon ung thư điển hình. carcinoma cells (HT-29) by colon mitosis inhibitor. In Vivo. 2001, 15 (5), pp.397-401. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Cusack JC Jr, Liu R, Xia L, Chao TH, Pien C, Niu W, Palombella VJ, Neuteboom ST, Palladino MA. NPI-0052 enhances tumoricidal response to conventional cancer therapy in a colon cancer model. Clin Cancer Res. 2006, 12 (22), pp.6758- 6764. Ngày nhận bài: 19/9/2012 Ngày giao phản biện: 10/10/2012 Ngày giao bản thảo in: 16/11/2012 5
6. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2012 6