Nghiên cứu tách dòng và biểu hiện gen mã hóa protein ns1 của virut zika ở vi khuẩn escherichia coli

Nội dung text: Nghiên cứu tách dòng và biểu hiện gen mã hóa protein ns1 của virut zika ở vi khuẩn escherichia coli

1. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 4-2017 NGHIÊN CỨU TÁ CH DÒ NG VÀ BI ỂU HI ỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN NS1 CỦA VIRUT ZIKA Ở VI KHU ẨN ESCHERICHIA COLI Hoàng Qu ốc Tr ường*; V ũ Lê Qu ỳnh Chi*; Phan Qu ốc Hoàn* Park Huyn**; Vũ Xuân Ngh ĩa***; Lê Th ị Qu ỳnh Mai**** TÓM T ẮT Mục tiêu: nghiên c ứu tách dòng và bi ểu hi ện, tinh s ạch protein NS1. Ph ươ ng pháp: tách dòng trình t ự gen mã hóa protein NS1 vào vector TA và ti ến hành chuy ển sang vector pET-28A (+) tạo plasmid tái t ổ h ợp bi ểu hi ện protein NS1 trong vi khu ẩn E. coli . Kết qu ả: NS1 bi ểu hi ện thành công được xác nh ận b ằng k ỹ thu ật điện di bi ến tính SDS-PAGE và k ỹ thu ật chuy ển th ẩm mi ễn d ịch. Đây là k ết qu ả nghiên c ứu b ước đầu định h ướng t ạo b ộ sinh ph ẩm ch ẩn đoán phát hi ện virut Zika (ZIKV) t ại Vi ệt Nam. Kết lu ận: bi ểu hi ện thành công NS1 protein. * Từ khó a: Virut Zika; E. coli ; NS1. Cloning and Expression of a Full-Leng Recombinant NS1 Protein from Zika Virus in Escherichia coli Summary Objectives: In this study, Zika virus (ZIKV) NS1 was expressed and purified. Methods: Zika virus RNA was used as a template to produce DNA clones of the full-length NS1 genes via reverse transcriptase synthesis of cDNA by PCR amplification of the NS1 region. Products were cloned TA plasmid and subsequently subcloned into pET-28A (+) vector to construct a recombinant plasmid. The recombinant plasmid was transformed into E. coli BL21 strains and expressed NS1 protein. Results: Protein was identified by SDS-PAGE and western blotting. This research need to be further investigated to develop a NS1 diagnosis test of ZIKV in Vietnam. Conslusion: NS1 was expressed successfully. * Key words: Zika virus; E. coli; NS1. ĐẶT V ẤN ĐỀ ZIKV đã t ồn t ại trên ng ười được nhi ều Virut Zika là m ột virut ARN thu ộc h ọ qu ốc gia châu Phi và m ột s ố n ước châu Á Flaviviridae, chi Flavivirus, được phân l ập mô t ả, trong đó có Thái Lan, Singapore, lần đầ u tiên t ừ kh ỉ vàng Uganda n ăm Malaysia, Campuchia, Philippines và Vi ệt 1947. N ăm 1954, ZIKV được phân l ập t ừ Nam. Tháng 05 - 2015, ZIKV l ần đầ u 3 c ư dân Nigeria. Cho đến nay, nhi ều tiên được mô t ả phát hi ện bên ngoài châu nghiên c ứu kh ẳng đị nh kháng th ể kháng Phi và châu Á khi phân l ập t ại Brazil. * B ệnh vi ện Trung ươ ng Quân đội 108 ** Tr ường Đạ i h ọc Y Wonkawang *** H ọc vi ện Quân y **** Vi ện V ệ sinh D ịch t ễ Trung ươ ng Ng ười ph ản h ồi (Corresponding): Vũ Xuân Ngh ĩa (nghia69@gmail.com) Ngày nh ận bài: 16/01/2017; Ngày ph ản bi ện đánh giá bài báo: 18/03/2017 Ngày bài báo được đă ng: 22/03/2017 23
2. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 4-2017 Tháng 2 - 2016, T ổ ch ức Y t ế Th ế gi ới Kỳ khuy ến cáo s ử d ụng test phát hi ện tuyên b ố lây nhi ễm ZIKV là v ấn đề y t ế NS1, xét nghi ệm Zika IgM ELISA và k ỹ thu ật kh ẩn c ấp trong c ộng đồ ng qu ốc t ế [1]. sinh h ọc phân t ử để phân bi ệt v ới nhi ễm Đường lây truy ền ZIKV được xác nh ận là do Chikungunia ho ặc Dengue. NS1, protein vector trung gian mu ỗi v ằn A. aegypti và không c ấu trúc c ủa ZIKV là m ột glycoprotein A. albopictus, có th ể qua quan h ệ tình d ục với tr ọng l ượng phân t ử 43 - 50 kD đã [2]. Trong khi các tri ệu ch ứng lây nhi ễm được công b ố v ề c ấu trúc sau 9 tháng ZIKV th ầm l ặng ho ặc có th ể b ệnh gi ống WHO c ảnh báo ZIKV liên quan đến b ệnh sốt dengue, các b ằng ch ứng ZIKV gây bi ến đầu nh ỏ ở thai nhi và tr ẻ s ơ sinh [6, 7]. ch ứng nghiêm tr ọng đế n h ệ th ần kinh Năm 2016, hai công trình khoa h ọc công trung ươ ng ở thai nhi/tr ẻ s ơ sinh (b ệnh bố trên t ạp chí EMBO và Nat Struct Mol đầu nh ỏ, microcephaly), tri ệu ch ứng Biol v ề c ấu trúc c ủa NS1 đã ch ứng minh Guillain-Barré ở ng ười tr ưởng thành và t ế các đặc tính b ề m ặt khác bi ệt c ủa ZIKV bào g ốc v ạn n ăng th ần kinh c ủa ng ười so v ới nh ững virut khác thu ộc h ọ Flavivirus được công b ố v ới các b ằng ch ứng khoa về tính đặc hi ệu v ới kháng th ể kháng học tin c ậy [3, 4, 5]. ZIKV NS1 và làm sáng t ỏ vai trò c ủa Tại Vi ệt Nam, theo thông tin đă ng trên protein này trong c ơ ch ế lây nhi ễm ZIKV. trang m ạng c ủa Vi ện V ệ sinh D ịch t ễ Trong nghiên c ứu này, gen NS1 c ủa ZIKV Trung ươ ng, tính đến ngày 20 - 11 - được tách dòng và bi ểu hi ện trong vi 2016, trên địa bàn toàn Thành ph ố H ồ khu ẩn E. coli v ới đị nh h ướng ch ế t ạo các Chí Minh xác nh ận có 62 tr ường h ợp bộ sinh ph ẩm phát hi ện ZIKV ở m ức độ nhi ễm ZIKV t ại 16/24 qu ận huy ện. Trong gen và kháng nguyên NS1 t ại Vi ệt Nam. đó, qu ận Bình Th ạnh phát hi ện 13 tr ường ĐỐI T ƯỢNG VÀ PH ƯƠ NG PHÁP hợp, Qu ận 2 có 10 ca, ti ếp đế n là các NGHIÊN C ỨU qu ận 9, 12 và Tân Phú m ỗi qu ận có 6 ca 1. V ật li ệu nghiên c ứu. xác định d ươ ng tính v ới ZIKV. Ngày 17 - 10 - 2016, lãnh đạo B ộ Y t ế và các ARN t ổng s ố của ZIKV do Khoa Sinh chuyên gia c ủa V ăn phòng Đáp ứng D ịch học Truy ền nhi ễm, Trung tâm Nghiên c ứu kh ẩn c ấp EOC (B ộ Y t ế), chuyên gia c ủa bệnh lây sang ng ười, Tr ường Đại h ọc Trung tâm Ki ểm soát và Phòng ng ừa d ịch Wonkwang, Hàn Qu ốc cung c ấp. Sinh bệnh (CDC) M ỹ, T ổ ch ức Y t ế Th ế gi ới ph ẩm t ổng h ợp cADN (SuperScriptTM Kit), (WHO) và lãnh đạo Vi ện V ệ sinh D ịch t ễ tách dòng gen TA/pGEM-T easy vector TW; C ục Qu ản lý Khám, Ch ữa b ệnh; V ụ (Hãng Promega). Ch ủng Escherichia coli Sức kh ỏe Bà m ẹ và Tr ẻ em (B ộ Y t ế); Top 10F’, ch ủng vi khu ẩn BL21 và vector Bệnh vi ện Ph ụ s ản TW đã h ọp và thông pET28-A (+) ( Hã ng Novagen). Kít tinh sạ ch báo, trao đổi v ề tr ường h ợp bé gái sả n ph ẩm PCR, Gel Extraction Kit (Hãng 4 tháng tu ổi đầ u tiên t ại Vi ệt Nam m ắc d ị QIAGEN). Kít tinh s ạch protein (ProBondTM tật đầ u nh ỏ nghi do ZIKV. Em bé là con Purification System) ( Hã ng Invitrogen). của bà m ẹ 23 tu ổi, dân t ộc Ê Đê, s ống t ại 2. Ph ươ ng pháp nghiên c ứu. Đắk L ắk. Khi mang thai th ời điểm 3 tháng * Tách dòng và gi ải trình t ự gen NS1 và 6 tháng, ng ười m ẹ b ị s ốt, phát ban. của ZIKV: Để kh ẳng đị nh nhi ễm ZIKV, Trung tâm Khu ếch đại gen mã hoá cho NS1 b ằng Ki ểm soát và Phòng ng ừa d ịch b ệnh Hoa cặp m ồi đặc hi ệu có gắn thêm vị trí củ a 2 24
3. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 4-2017 enzym EcoR I và Not I ở đầu 5’ tươ ng ứng * Bi ểu hi ện và tinh s ạch NS1rec: củ a m ồi xuôi và mồi ng ượ c: mồi xuôi Để bi ểu hi ện gen mã hóa NS1rec, bi ến (Hoang_NS1-5’): 5’-CCGGAATTCCGGAT- nạp plasmid pET-NS1rec vào vi khu ẩn E. GGTGGGGTGCTCAGT G-3’; m ồi ng ược coli ch ủng BL21. Ch ủng bi ểu hi ện protein (Hoang_NS1-3’): 5’-ATAAGAATGCGGCCG- NS1 được nuôi c ấy trong 400 ml môi CTAAACTATTCATGACCCCGCTGTC AC-3’. tr ường LB (b ổ sung 100 µg/ml kanamycin) cADN đượ c t ổng h ợp theo b ộ kít ở nhi ệt độ 37°C v ới t ốc độ l ắc 200 SuperScript TM và dù ng là m khuôn cho vòng/phút, b ổ sung IPTG ở điều ki ện t ối phả n ứng PCR để khu ếch đại gen NS1 . Chu ưu 1 mM n ồng độ cu ối cùng khi m ật độ trình nhi ệt nh ư sau: b ước 1: 95 °C - 3 nuôi c ấy vi khu ẩn OD600 nm đạt 0,5 - 1. phút; b ước 2: 95 °C - 30 giây; b ước 3: Sau 3 - 4 gi ờ c ảm ứng bi ểu hi ện, thu h ồi 58 °C - 30 giây; b ước 4: 72 °C - 1 phút 30 vi khu ẩn b ằng ly tâm v ới t ốc độ 3.000 g/30 giây; b ước 5: l ặp l ại 40 chu k ỳ t ừ b ước 2 phút ở 4°C. NS1 được bi ểu hi ện ở d ạng đến bước 4; b ước 6: 72 °C - 10 phút. Gen NS1 được g ắn vào vector pGEM-T easy th ể vùi trong ch ủng vi khu ẩn BL21. Hòa tạo pNS1, bi ến n ạp vào ch ủng vi khu ẩn E. cặn vi khu ẩn sau bi ểu hi ện v ới 10 ml đệm coli TOP 10F’ b ằng ph ươ ng phá p s ốc TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0 và 5 mM EDTA), nhi ệt. Cá c dò ng plasmid tá i t ổ hợp mang phá màng t ế bào b ằng 3 chu k ỳ trên máy gen NS1 đượ c ch ọn l ọc theo ph ươ ng nén French v ới áp l ực nén 100 bars pháp khu ẩn l ạc xanh tr ắng [8] và cắt ki ểm ở 4°C. D ịch phá t ế bào được ly tâm v ới tra b ằng enzym gi ới hạ n Eco RI và g ửi gi ải tốc độ 20.000 g/20 phút 4°C, c ặn t ế bào trình t ự đến Hãng Cosmogenetech (Hàn hòa trong 10 ml Buffer A (10 mM Tris- Qu ốc). X ử lý k ết qu ả gi ải trình t ự b ằng HCl, 100 mM NaH 2PO 4, 10 mM β- ph ần m ềm Bioedit và phân tích tr ực tuy ến mercaptoethanol và 8 M urea) trong 1 gi ờ với Ngân hàng Gen th ế gi ới s ử d ụng ở nhi ệt độ 4 oC. D ịch protein ở d ạng tan công c ụ BLAST. được thu h ồi sau khi ly tâm v ới t ốc độ * Thi ết k ế plasmid bi ểu hi ện protein tái 20.000 g/20 phút 4°C, protein NS1 ti ếp tổ h ợp NS1: tục tinh ch ế s ử d ụng c ột s ắc ký ái l ực Ni-NTA Cắt gen NS1 ra khỏ i pNS1 bằng 2 enzym (Qiagen, Đức) theo h ướng d ẫn c ủa nhà EcoRI và NotI , s ản ph ẩm c ắt được tinh sản xu ất. Đánh giá m ức độ bi ểu hi ện và sạch b ằng Gel Extraction Kit thu được quy trình tinh s ạch protein tái t ổ h ợp NS1 gen NS1p và g ắn vào vector pET28-A(+) bằng k ỹ thu ật điện di bi ến tính SDS-PAGE. đã được c ắt m ở vòng b ằng 2 enzym * K ỹ thu ật chuy ển th ấm mi ễn d ịch: tươ ng ứng để t ạo ra vector bi ểu hi ện pET-NS1rec. Các dòng plasmid tái t ổ h ợp NS1rec được phân tích ph ản ứng mang gen NS1rec được ch ọn l ọc b ằng k ỹ kháng nguyên-kháng th ể s ử d ụng kháng thu ật plasmid PCR, s ử d ụng c ặp m ồi đặc th ể chu ột kháng histidin b ằng k ỹ thu ật hi ệu cho vector pET28-A (+), T7 promoter chuy ển th ấm mi ễn d ịch. C ụ th ể, m ẫu primer #69348-3 và T7 terminator primer ch ủng bi ểu hi ện protein NS1 điện di bi ến #69337-3 (Novagen, Hoa Kỳ) và do Công tính trên gel 12,5% SDS-PAGE, sau đó ty Cosmogenetech (Hàn Qu ốc) gi ải trình nhu ộm v ới Coomassie brilliant blue R250 tự xá c định đúng chi ều g ắn tr ước khi bi ểu (Sigma-Aldrich) ho ặc chuy ển sang màng hi ện t ạo protein tái t ổ h ợp. nitrocellulose (Amersham/GE Healthcare, 25
4. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 4-2017 Hoa K ỳ) b ằng thi ết b ị chuy ển màng th ước kho ảng 1,1 kb t ươ ng ứng v ới kích Trans-Blot® SD Semi-Dry Electrophoretic th ước c ủa NS1 được khu ếch đại. tinh Transfer Cell (BioRad, Hoa K ỳ) theo h ướng sạch và g ắn s ản ph ẩm PCR vào vector dẫn c ủa nhà s ản xu ất. Màng chuy ển tách dòng pGEM-T easy, bi ến n ạp vào vi protein được ph ủ v ới 5% skim milk trong khu ẩn E. coli TOP10F’, cấy trả i trên đĩa đệm PBS-T trong 1 gi ờ ở 37°C. Pha loãng thạ ch LB b ổ sung ampicillin (100 µg/ml). kháng th ể chu ột kháng His.H8 (Pierce 6X Plasmid t ừ 3 dòng khu ẩn l ạc tr ắng và His Epitope Taq Antibody) theo t ỷ l ệ 1 dòng khu ẩn l ạc xanh đượ c tá ch chi ết và 1:2.500 trong đệm PBS + 0.05% Tween-20 điện di ki ểm tra trên gel agarose 1%. Tất để ph ủ màng ở 37°C trong 1 gi ờ. Màng cả 3 dòng plasmid tách t ừ khu ẩn l ạc tr ắng sau khi r ửa, làm ph ản ứng v ới kháng th ể đều có v ị trí cao h ơn so v ới plasmid tách th ứ 2, kháng th ể anti-mouse rabbit IgG chi ết t ừ dòng khu ẩn l ạc xanh ( hì nh 1B ). (HRP) (ab97046) v ới t ỷ l ệ pha loãng 1:5.000 Do v ậy, chúng đều có kh ả n ăng mang trong 1 gi ờ ở 37°C để phát hi ện kháng gen NS1 . Do vector pGEM-T easy có nguyên NS1rec có g ắn His. Ph ản ứng ch ứa 2 v ị trí nh ận bi ết c ủa Eco RI n ằm ở 2 hi ện màu s ử d ụng 3, 3’-Diaminobenzidine đầu củ a đoạ n gen ngoạ i lai, nên n ếu gen tetra hydrochloride hydrate (DAB, Cat. # ngoạ i lai đượ c chè n và o vector nà y, khi D5637, Sigma-Aldrich, Hoa K ỳ) trong 10 cắt b ằng Eco RI, chú ng sẽ văng ra khỏ i ml đệm PBS + 0.05% (v/v) H 2O2. vector. Do v ậy, chúng tôi ch ọn 3 dòng khu ẩn l ạc tr ắng ở trên c ắt ki ểm tra b ằng KẾT QUẢ NGHIÊN C ỨU VÀ Eco RI. Ki ểm tra k ết qu ả b ằng điện di trên BÀN LU ẬN gel agrose 1% ( hình 1C ) cho th ấy, c ả 1. Kết quả tá ch dò ng gen NS1. 3 dòng plasmid sau khi cắt đều xu ất hi ện Khu ếch đại gen NS1 của ZIKV b ằng 1 b ăng ADN v ới kích th ước t ươ ng ứng ph ản ứng PCR nh ư đã mô t ả ở ph ần với kích th ước c ủa s ản ph ẩm PCR gen ph ươ ng pháp. Ki ểm tra sả n ph ẩm PCR NS1 , trong khi không xu ất hi ện b ăng này bằng điện di trên gel agarose 1% ( hình ở gi ếng ch ứa dòng khu ẩn l ạc xanh ( gi ếng 1A ) xu ất hi ện 1 b ăng duy nh ất có kích 1, hình 1C ). Hình 1 : K ết qu ả tách dòng gen NS1. (A) K ết qu ả khu ếch đại gen NS1, M: Thang ADN chu ẩn; ĐC 1: Ch ứng âm, ĐC 2: Sản ph ẩm nhân gen NS1. (B) K ết qu ả tách chi ết plasmid. ĐC 1: Plasmid được tách 26
5. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 4-2017 chi ết t ừ khu ẩn l ạc xanh; ĐC 2 - 4: Các plasmid được tách chi ết t ừ 03 khu ẩn l ạc tr ắng riêng r ẽ. (C) Kết quả cắt pNS1 trong vector TA b ằng EcoRI; ĐC 1: Plasmid được tách chi ết t ừ khu ẩn l ạc xanh; ĐC 2 - 4: Plasmid được tách chi ết t ừ khu ẩn l ạc tr ắng; ĐC 6: Sản ph ẩm PCR khu ếch đại gen NS1. Để kh ẳng định ch ắc ch ắn gen được tách dòng là NS1, chúng tôi ch ọn 2 m ẫu plasmid đã ki ểm tra enzym c ắt giới h ạn Eco RI để gi ải trình t ự. So sánh k ết qu ả gi ải trình t ự v ới trình t ự NS1 trên Ngân hàng Gen Qu ốc t ế qua ch ươ ng trình so sánh tr ực tuy ến BLAST ( Kết qu ả ở hình 2 cho th ấy, trình tự mà chúng tôi thu được là gen NS1 c ủa ZIKV v ới độ t ươ ng đồng 100% v ề trình t ự nucleotid với ch ủng ZIKV MR-766/1947, v ới mã s ố đă ng ký trên Ngân hàng Gen Qu ốc t ế là: KX601169.1. Nh ư v ậy, đã tách dòng thành công gen NS1 c ủa ZIKV. Hình 2 : K ết qu ả gi ải trình t ự gen NS1 . Một ph ần trình t ự đầu 5’ c ủa gen NS1 và k ết qu ả so sánh v ới trình t ự NS1 tách dòng từ ZKV trên Ngân hàng Gen Qu ốc t ế qua công c ụ so sánh tr ực tuy ến BLAST ( 27
6. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 4-2017 2. Kết quả thi ết k ế vector bi ểu hi ện pNS1rec. Hình 3: Kết qu ả ki ểm tra s ản ph ẩm khu ếch đại gen NS1 trong vector bi ểu hi ện pNS1rec. ĐC 1: S ản ph ẩm PCR khu ếch đại t ừ plasmid c ủa khu ẩn l ạc xanh; ĐC M: Thang ADN chu ẩn 1 kb; ĐC 2, 3, 4, 5: S ản ph ẩm PCR khu ếch đại t ừ 04 plasmid pNS1rec tách t ừ 4 khu ẩn l ạc riêng r ẽ; ĐC 6: S ản ph ẩm PCR gen NS1. Vector tái t ổ h ợp pNS1rec đượ c thi ết k ế tươ ng ứng v ới 4 dòng khu ẩn l ạc tr ắng. nh ư mô tả ở trên. sau đó bi ến nạ p Trong khi ở đường ch ạy s ố 1, ch ỉ khu ếch pNS1rec vào vi khu ẩn E. coli TOP 10F’. đại đoạn gen c ủa vector ch ứng âm (khu ẩn Ch ọn ng ẫu nhiên 4 dòng khu ẩn l ạc, nuôi lạc xanh), là plasmid không ch ứa gen cấy trên môi tr ườ ng LB lỏ ng có bổ sung NS1 . Chúng tôi c ũng g ửi m ẫu gi ải trình t ự Kan, tách chi ết plasmid và ki ểm tra s ự có gen NS1 trong vector bi ểu hi ện pET28A(+) mặt c ủa gen NS1, s ử d ụng c ặp m ồi đặc đến Công ty Cosmogenetech (Hàn Qu ốc), hi ệu T7 promoter primer #69348-3 và T7 kết qu ả gi ải trình t ự xá c định chính xác terminator primer #69337-3 (Novagen, chi ều g ắn c ủa gen NS1 trong vector này Hoa K ỳ). K ết qu ả hình 3 cho th ấy, s ử d ụng (không trình bày k ết qu ả gi ải trình t ự). Nh ư cặp m ồi đặc hi ệu cho vector pET28A(+) vậy, gen NS1 c ủa ZIKV được chèn chính đều khu ếch đại đoạn gen có kích th ước xác và theo đúng chi ều g ắn trong vector kho ảng 1,4 kb ở các đường ch ạy 2 - 5, bi ểu hi ện pET28A (+). 3. K ết qu ả bi ểu hi ện protein tái t ổ h ợp NS1 trong vi khu ẩn E. coli. Hình 4: K ết qu ả ki ểm tra bi ểu hi ện c ủa protein NS1rec trong vi khu ẩn E. coli ch ủng BL21. ĐC 1 và 3: Tr ước c ảm ứng v ới 1 mM IPTG; ĐC M: Thang protein chu ẩn; ĐC 2 và 4: Sau 3 gi ờ c ảm ứng v ới 1 mM IPTG. 28
7. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 4-2017 Protein NS1rec bi ểu hi ện trong ch ủng BL21 có tr ọng l ượng phân t ử (MW) d ự đoán là 43 kDa v ới 6x His.Tag ở đầu t ận cùng N-NH2. K ết qu ả kh ảo sát m ức độ bi ểu hi ện của NS1rec ở hình 4 cho th ấy sau c ảm ứng v ới 1 mM IPTG ở nhi ệt độ 37°C, t ốc độ l ắc 200 vòng/phút xu ất hi ện b ăng protein đậm có kích th ước kho ảng 43 kDa ở đường ch ạy s ố 2 và 4. Trong khi b ăng này xu ất hi ện m ờ nh ạt ở nh ững m ẫu tr ước c ảm ứng IPTG ( đường ch ạy s ố 1 và 3). Nh ư v ậy, s ơ b ộ chúng tôi có th ể k ết lu ận protein tái t ổ hợp NS1 c ủa ZIKV đã bi ểu hi ện thành công trong vi khu ẩn E. coli . Điều này được ch ứng minh qua k ết qu ả gi ải trình c ủa gen NS1 đã chèn theo đúng chi ều g ắn trong vector bi ểu hi ện pET28A (+) và k ết qu ả điện di bi ến tính protein SDS-PAGE ở hình 4. Hình 5 : K ết qu ả kh ảo sát tính tan c ủa protein NS1rec trong vi khu ẩn E. coli . (A) K ết qu ả kh ảo sát ảnh h ưởng c ủa nhi ệt độ t ới tính tan c ủa NS1rec và (B) K ỹ thu ật chuy ển th ấm mi ễn d ịch xác nh ận bi ểu hi ện c ủa NS1rec trong E. coli. ĐC 1: M ẫu không cảm ứng IPTG, ĐC 2, 3: D ịch n ổi và c ặn t ế bào sau c ảm ứng 4 gi ờ v ới 1 mM IPTG ở 28 oC; ĐC 5, 6: Dịch n ổi và c ặn t ế bào sau c ảm ứng 4 gi ờ v ới 1 mM IPTG ở 37 oC. Tuy nhiên, NS1rec bi ểu hi ện ở d ạng th ể vùi (không hòa tan) trong vi khu ẩn sau khi đã t ối ưu các điều ki ện bi ểu hi ện khác nhau nh ư: nhi ệt độ nuôi c ấy, n ồng độ c ảm ứng IPTG và t ốc độ c ấy khu ẩn (không trình bày s ố li ệu trong nghiên c ứu này). Protein NS1rec t ập trung ch ủ y ếu ở c ặn t ế bào ( ĐC 3 và 6 c ủa hình 5), k ết qu ả này được kh ẳng định b ằng k ỹ thu ật chuy ển th ấm mi ễn d ịch s ử d ụng kháng th ể chu ột kháng His.H8 (Pierce 6X His Epitope Taq Antibody) ( hình 5B ). KẾT LU ẬN nồng độ IPTG 1 mM và thu m ẫu sau 4 Chú ng tôi đã tách dòng và bi ểu hi ện gi ờ cả m ứng. K ết qu ả này được định thành công gen mã hóa cho protein NS1 hướng để t ạo các b ộ sinh ph ẩm phát hi ện của ZIKV trong vi khu ẩn E. coli . Điều ki ện ZIKV ở m ức độ gen và phát tri ển sinh tối ưu để bi ểu hi ện protein này là 28 °C, ph ẩm ch ẩn đoán huy ết thanh h ọc. 29
8. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 4-2017 TÀ I LI ỆU THAM KHẢ O 5. H. Tang et al. Zika virus infects human cortical neural progenitors and attenuates their 1. L. R. Petersen et al. Zika virus. N Engl J growth. Cell Stem Cell. 2016, 18, pp.587-590. Med. 2016, 374, pp.1552-1563. 6. Xu X et al. Contribution of intertwined 2. D. Musso et al. Potential sexual loop to membrane association revealed by transmission of Zika virus. Emerg Infect Dis. Zika virus full-length NS1 structure. EMBO. 2015, 21, pp.359-361. 2016, J35, pp.2170-2178. 3. E.J. Rubin et al. Zika virus and 7. Brown W.C et al. Extended surface for microcephaly. N Engl J Med. 2016, 374, membrane association in Zika virus NS1 structure. Nat Struct Mol Biol. 2016, 23, pp.984-985. pp.865-867. 4. V.M. Cao-Lormeau et al. Guillain-Barré 8. Sambrook. J, Russell D.W. Molecular syndrome outbreak associated with Zika virus cloning: A laboratory manual. 3rd Edition. infection in French Polynesia: A case-control pp.A4.40-42. Cold Spring Harbor Laboratory study. Lancet. 2016, 387, pp.1531-1539. Press. Cold Spring Harbor. N.Y. 2001. 30