Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết và độc tính của cao lá dâu trên động vật thực nghiệm

Nội dung text: Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết và độc tính của cao lá dâu trên động vật thực nghiệm

1. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014 NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG HẠ ĐƢỜNG HUYẾT VÀ ĐỘC TÍNH CỦA CAO LÁ DÂU TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM Nguyễn Văn Ba*; Phạm Xuân Phong** TÓM TẮT Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của cao lá Dâu trên mô hình thỏ trắng tăng đường huyết do streptozocin và xác định độc tính trên chuột và thỏ, chúng tôi rút ra một số kết luận sau: cao lá Dâu ở liều uống 300 mg/kg/24 giờ sau 42 ngày có tác dụng giảm 43% đường huyết trên thỏ trắng tăng đường huyết do streptozocin và tốt hơn gliclazide liều 15 mg/kg/24 giờ. LD50 của cao khô lá Dâu (CKLD) đường uống là 7.550 mg/kg thể trọng/24 giờ, chưa thấy độc bán trường diễn trên động vật thực nghiệm. * Từ khóa: Cao lá Dâu; Hạ đường huyết; Đái tháo đường týp 2. RESEARCH ON THE HYPOGLYCEMIC EFFECT AND TOXICITY OF EXTRACTS OF MULBERRY LEAVES ON EXPERIMENTAL ANIMALS Summary After studying the hypoglycemic effects of Mulberry leaf extract on streptozocin-induced diabetes mellitus rabbit model and the toxicity on mice and rabbit, we had several conclusions: Mulberry leaf extract at oral dosage of 300 mg/kg/24h, after 42 days on rabbit showed hypoglycemic effects on 43% of streptozocin-induced diabetes mellitus rabbit and more effective than gliclazide at dosage of 15 mg/kg/24h. LD50 of dried Mulberry leaf extract at dosage of 7,550 mg/kg/24h, there were no proof of chronic toxicity of Mulberry extract on experimental animals. * Key words: Extracts of Mulberry leaves; Hypoglycemia; Type 2 diabetes mellitus. ĐẶT VẤN ĐỀ thảo dược đang được quan tâm do ít tác dụng phụ so với các thuốc hóa dược. Đái tháo đường (ĐTĐ) týp 2 là bệnh Chính vì vậy, các nhà khoa học đang chuyển hóa, đang có khuynh hướng gia nghiên cứu nhằm tìm kiếm những chế tăng ở các nước phát triển. Bên cạnh việc phẩm trị liệu ĐTĐ hiệu quả có nguồn gốc áp dụng chế độ ăn hợp lý, BN ĐTĐ phải từ dược liệu sẵn có, rẻ tiền, dạng sử tuân thủ nghiêm việc sử dụng thuốc kiểm dụng tiện lợi để người bệnh và thầy thuốc soát đường huyết [2]. có thêm lựa chọn. Trong đó, lá Dâu được Hiện nay, thuốc điều trị bệnh ĐTĐ rất nhiều công trình nghiên cứu công bố về phong phú, trong đó, thuốc có nguồn gốc tác dụng hạ đường huyết [4, 5, 7]. * Học viện Quân y ** Bệnh viện Y học Cổ truyền Quân đội Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Văn Ba (bsnguyenvanba@yahoo.com) Ngày nhận bài: 19/01/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 01/04/2014 Ngày bài báo được đăng: 07/04/2014 25
2. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014 Để có cơ sở áp dụng chế phẩm trên bột với liều 1,5 g/kg thể trọng. Thể tích thử nghiệm lâm sàng và điều trị bệnh, một lần uống là 3 ml/kg thể trọng. Thời điểm chúng tôi tiến hành nghiên cứu tác dụng xét nghiệm đường huyết: xuất phát điểm hạ đường huyết và khảo sát độc tính cấp (T0), sau 2 giờ (T2), sau 4 giờ (T4) và sau và độc tính bán trường diễn của CKLD 6 giờ (T6) khi uống tinh bột. trên mô hình thỏ trắng tăng đường huyết + Xác định tác dụng hạ đường huyết bởi streptozocin. theo mô hình gây ĐTĐ trên thỏ. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP Theo phương pháp gây ĐTĐ trên thỏ NGHIÊN CỨU trắng bằng cách tiêm streptozocin liều 75 mg/kg thể trọng (40 thỏ). Sau 72 giờ tiêm 1. Đối tƣợng nghiên cứu. streptozocin, định lượng glucose máu trước + CKLD đạt tiêu chuẩn cơ sở, do Viện khi cho chuột uống thuốc. Chia ngẫu nhiên Nghiên cứu Rau quả cung cấp. 40 thỏ thành 4 nhóm, mỗi nhóm 10 con. Nhóm 1 (nhóm chứng sinh học): uống + Nghiên cứu độc tính cấp trên 90 chuột nước cất 2 lần. Nhóm 2 (nhóm thuốc đối nhắt trắng trọng lượng cơ thể (TLCT) từ chứng): uống gliclazide liều 15 mg/kg thể 20,0 - 22,0 g. trọng. Nhóm 3 (CKLD mức liều 1): uống + Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết CKLD với liều 150 mg/kg thể trọng. Nhóm và độc tính bán trường diễn trên 116 thỏ 4 (CKLD mức liều 2): uống CKLD với liều trắng (trọng lượng từ 1,8 - 2,2 kg). 300 mg/kg thể trọng. Thời điểm xét nghiệm glucose huyết: trước khi cho chuột uống - Động vật thí nghiệm do Ban Chăn nuôi - thuốc (T0), sau 2 giờ (T2), sau 4 giờ (T4) Học viện Quân y cung cấp, được nuôi và sau 6 giờ (T6) uống thuốc. dưỡng trong điều kiện phòng thí nghiệm của Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học, - Xác định độc tính của cao lá Dâu. Học viện Quân y, ăn thức ăn theo tiêu + Xác định độc tính cấp của CKLD theo chuẩn cho động vật nghiên cứu, nước đường uống: (đun sôi để nguội) uống tự do. Theo phương pháp nghiên cứu độc 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. tính cấp của Abrham W.B, Turner A, quy - Nghiên cứu tác dụng hạ đường máu định của Bộ Y tế Việt Nam và Tổ chức trên thỏ thực nghiệm. Y tế Thế giới về nghiên cứu độc tính của thuốc y học cổ truyền [1, 3, 7, 8]. Thí + Xác định tác dụng hạ đường máu trên nghiệm tiến hành trên chuột nhắt trắng. thỏ khỏe mạnh: Chia ngẫu nhiên chuột làm 09 nhóm, mỗi Tiến hành thí nghiệm trên thỏ trắng. nhóm 10 con. Từng nhóm, cho chuột uống Thỏ trắng được chia ngẫu nhiên thành 4 CKLD với các mức liều 2.000 mg; 3.500 mg, nhóm, mỗi nhóm 10 con. Nhóm 1 (nhóm 5.000 mg; 6.500 mg; 8.000 mg; 9.500 mg; chứng sinh học): thỏ uống nước cất 2 lần. 11.000 mg, 12.500 mg và 14.000 mg/kg Nhóm 2 (nhóm thuốc đối chứng): uống thể trọng. Sau khi uống CKLD, nuôi dưỡng arcabose liều 25 mg/kg thể trọng. Nhóm 3 và theo dõi chuột liên tục trong 72 giờ. (CKLD mức liều 1): uống CKLD với liều Đánh giá sự thay đổi tập tính và tỷ lệ 150 mg/kg thể trọng. Nhóm 4 (CKLD với chuột chết theo từng nhóm thí nghiệm. liều 2): uống CKLD với liều 300 mg/kg thể Tính LD50 dựa trên liều cao nhất không trọng. au khi cho uống thuốc > 30 phút, gây chết một con chuột nào và liều thấp tiếp tục cho các nhóm thỏ trên uống tinh nhất gây chết toàn bộ chuột. 27
3. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014 + Nghiên cứu độc tính bán trường diễn Chỉ tiêu đánh giá: huyết học (số lượng trên thực nghiệm: hồng cầu, hemoglobin, bạch cầu và tiểu cầu). Hóa sinh: aspartate amino transferase Theo phương pháp Abrham, quy định (AST), alanin amino transferase (ALT), ure của Tổ chức Y tế Thế giới và Bộ Y tế Việt và creatinin. Xác định mô bệnh học gan, Nam về hiệu lực và an toàn của thuốc y lách và thận thỏ (vào ngày thứ 42, giết thỏ, học cổ truyền [1, 3, 7, 8]. làm xét nghiệm mô bệnh học gan, lách và Chia ngẫu nhiên thỏ thí nghiệm thành thận thỏ thực nghiệm). Thời điểm xét nghiệm 3 nhóm, mỗi nhóm 12 con. Nhóm 1 sau 6 tuần (ngày thứ 42) uống CKLD. (nhóm chứng): thỏ uống liên tục trong 42 - Xử lý số liệu: theo phương pháp ngày nước cất liều 5 ml/kg thể trọng/24 thống kê y học bằng phần mềm SPSS giờ. Nhóm 2: uống liên tục trong 42 ngày 13.0. Các số liệu được biểu thị dưới dạng CKLD với liều 1.000 mg/kg thể trọng/24 số trung bình ± trung bình sai chuẩn (SE). giờ (mức liều 1). Nhóm 3 cho uống liên tục trong 42 ngày CKLD với liều 1.500 mg/kg thể trọng/24 giờ (mức liều 2). KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 1. Tác dụng hạ đƣờng huyết trên động vật thực nghiệm của CKLD. Bảng 1: nh hưởng của CKLD đến nồng độ glucose máu ở thỏ khỏe mạnh. (mmol/l) p Chứng sinh học (a) Đối chứng (b) CKLD mức liều 1 (c) CKLD mức liều 2 (d) T0 6,74 ± 0,90 6,40 ± 1,14 7,05 ± 0,79 6,90 ± 0,80 > 0,05 T2 7,14 ± 0,74 7,34 ± 0,82 6,55 ± 0,93 5,84 ± 0,87 pd-b < 0,05 pb-a < 0,05 pd-a < 0,05 T4 6,94 ± 0,76 4,94 ± 0,95 6,35 ± 0,68 5,00 ± 0,85 pc-b < 0,05 pd-c < 0,05 T6 7,04 ± 0,76 6,80 ± 0,73 6,88 ± 0,84 7,12 ± 0,65 > 0,05 p4-0 < 0,05 p4-0 < 0,05 p > 0,05 > 0,05 - p4-2 < 0,05 p6-4 < 0,05 - Nồng độ glucose máu của các lô ở nồng độ glucose của lô thuốc đối chứng xuất phát điểm đều không thay đổi. Sau 2 giảm hơn so với lô uống CKLD liều 1 giờ uống tinh bột, nồng độ glucose máu ở (p < 0,05); nồng độ glucose máu của lô lô uống CKLD liều 2 giảm hơn so với lô uống CKLD liều 2 giảm thấp hơn so với lô thuốc đối chứng với p < 0,05. Ở thời điểm uống CKLD liều 1 (p < 0,05). sau 4 giờ, nồng độ glucose máu ở các lô - Nồng độ glucose máu của lô chứng thuốc đối chứng và lô uống CKLD liều 2 sinh học và lô uống CKLD liều 1 đều đều giảm hơn so với lô chứng, p < 0,05; không thay đổi trong suốt quá trình thí 28
4. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014 nghiệm. Ở lô uống thuốc đối chứng, nồng CKLD liều 2: nồng độ glucose máu ở thời độ glucose máu ở thời điểm sau 4 giờ điểm 4 giờ giảm thấp hơn so với xuất giảm thấp hơn so với xuất phát điểm và ở phát điểm và ở thời điểm sau 6 giờ uống thời điểm 2 giờ với p < 0,05. Ở lô uống tinh bột. Bảng 2: nh hưởng của CKLD đến nồng độ glucose máu ở thỏ gây ĐTĐ thực nghiệm. (mmol/l) p Chứng sinh học (a) Đối chứng (b) CKLD mức liều 1 (c) CKLD mức liều 2 (d) T0 12,24 ± 2,37 11,88 ± 2,40 11,24 ± 1,71 10,44 ± 1,19 > 0,05 T2 11,54 ± 2,50 9,84 ± 1,57 9,45 ± 2,05 8,64 ± 1,78 pd-a < 0,05 T4 10,94 ± 1,78 8,94 ± 1,32 8,30 ± 1,78 7,70 ± 2,03 pd-a< 0,05 pb-a < 0,05 T6 12,08 ± 1,95 7,34 ± 0,82 7,12 ± 0,84 6,88 ± 0,65 pc-a < 0,05 pd-a< 0,05 p4-0 < 0,05 p4-0 < 0,05 p > 0,05 p6-0 < 0,05 - p6-0 < 0,05 p6-0 < 0,05 - Nồng độ glucose máu của các lô ở trình thí nghiệm (p > 0,05). Ở lô thuốc thời điểm T0 (thời điểm sau khi tiêm đối chứng và lô uống CKLD liều 1, nồng streptozocin 72 giờ và trước khi cho độ glucose máu ở thời điểm T4 và T6 chuột uống thuốc) đều không có sự khác giảm thấp hơn so với ở thời điểm T0. biệt với p < 0,05. Ở lô uống CKLD liều 2, nồng độ glucose - Ở thời điểm T2 và T4, nồng độ glucose máu giảm thấp hơn so với ở thời điểm máu ở lô dùng CKLD liều 2 giảm thấp T0 (p < 0,05). hơn so với lô chứng sinh học (p < 0,05). 2. Tính an toàn của cao lá Dâu trên Ở thời điểm T6, nồng độ glucose máu ở động vật thực nghiệm. lô thuốc đối chứng và 2 lô uống CKLD đều giảm hơn so với lô chứng sinh học * Kết quả xác định độc tính cấp: với p < 0,05. Kết quả xác định liều chết 50% (LD50) - Nồng độ glucose máu của lô chứng bằng đường uống trên chuột nhắt trắng sinh học không thay đổi trong suốt quá của CKLD được thể hiện qua bảng 3. Bảng 3: Số chuột nhắt trắng chết trong thời gian 72 giờ sau khi uống CKLD. 29
5. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014 LÔ NGHIÊN CỨU n LIỀU CKLD (mg/kg/24 giờ) SỐ CHUỘT CHẾT SỐ CHUỘT SỐNG Lô 1 10 2.000 0 10 Lô 2 10 3.500 2 8 Lô 3 10 5.000 3 7 Lô 4 10 6.500 4 6 Lô 5 10 8.000 5 5 Lô 6 10 9.500 7 3 Lô 7 10 11.000 8 2 Lô 8 10 12.500 9 1 Lô 9 10 14.000 10 0 Liều thấp nhất không gây chết một con chuột là 2.000 mg/kg thể trọng/24 giờ. Liều cao nhất gây chết 100% chuột là 14.000 mg/kg thể trọng/24 giờ. Quan sát trong 72 giờ sau uống thuốc thấy: chuột sau khi uống thuốc có biểu hiện nằm co cụm vào góc chuồng nuôi. Lô chuột uống CKLD mức liều cao có biểu hiện vã mồ hôi. au 7 ngày, những chuột ngộ độc mà không chết đều trở lại bình thường. Kết quả phẫu tích và quan sát các tạng ở chuột bị chết thấy: các tạng phổi, dạ dày, ruột và gan xung huyết mạnh. Dựa vào công thức của Livschitz cải tiến tính được LD50 của CKLD theo đường uống là 7.550 mg/kg thể trọng/24 giờ. * Kết quả xác định độc tính bán trường diễn: Bảng 4: Chỉ số huyết học, sinh hóa gan, thận lô chứng và các lô nghiên cứu sau 6 tuần điều trị. CHỈ SỐ CÁC CHỈ SỐ HUYẾT HỌC INH HÓA THẬN INH HÓA GAN Hồng cầu Bạch cầu Tiểu cầu Huyết sắc Ure máu Creatinin SGOT máu SGPT máu NHÓM 6 3 3 3 (10 /mm ) (10 /mm ) (103 /mm3) tố (g/dl) thỏ (mmol/l) máu thỏ () thỏ (UI/l) thỏ (UI/l) Chứng 5,38 ± 4,83 ± 279,33 ± 127,80 ± 4,53 ± 51,50 ± 60,4 ± 60,42 ± 1,06 1,53 66,98 12,53 1,91 12,78 22,04 24,16 CKLD liều 1 5,70 ± 5,06 ± 259,92 ± 132,12 ± 3,99 ± 61,25 ± 52,79 ± 53,17 ± 1,36 1,83 66,49 18,06 1,97 20,80 20,51 18,84 CKLD liều 2 6,00 ± 5,48 ± 310,04 ± 123,4 ± 4,40 ± 57,58 ± 56,26 ± 58,17 ± 1,02 1,89 94,60 11,17 1,84 22,17 21,95 17,64 So với lô chứng, chỉ số huyết học, sinh hóa máu chức năng gan, thận thỏ sau 42 ngày điều trị với mức liều khác nhau, không thay đổi có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Cuối thí nghiệm, mổ lấy gan, lách, cố định trong formol 10%, làm xét nghiệm mô bệnh học tại Khoa Giải phẫu bệnh, Bệnh viện Quân y 103. Kết quả phân tích mô bệnh học cho thấy: ở các cơ quan gan, thận lách của nhóm thỏ uống CKLD không thấy xuất hiện hình ảnh bất thường so với nhóm chứng. 31
6. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014 KẾT LUẬN 3. Abrham WB. Techniques of animal and Từ các kết quả nghiên cứu, chúng tôi clinical toxicology, Med. Pub. Chicago, pp.55-68. rút ra một số kết luận sau: 4. Kimura T, Nagakawa K, Kubota H, - Trên mô hình thỏ trắng tăng đường Kojima Y, Goto Y. Food grade mulberry powder huyết do streptozocin, CKLD ở liều 300 enriched with 1-deoxynojirimycin suppresses mg/kg/24 giờ sau 14 và 42 ngày có tác the elevation of postprandial blood glucose in dụng giảm khoảng 25% và 43% đường humans. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2007. huyết có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) và có 5. Lin-Ling Wang, Ze-yang Zhou. Effect of hiệu quả hạ đường huyết tốt hơn gliclazide extracts of mulberry leaves processed differently liều 15 mg/kg. on the activity of anpha-glucosidase. Journal - LD50 của CKLD đường uống là 7.550 of Food, Agriculture & Environment. 6 (3&4), mg/kg thể trọng/24 giờ. pp.86-89. - Khi sử dụng dài ngày, CKLD với liều 6. Oh H, Ko EK, Jun JY, Oh MH, Park SU, 1.500 mg /kg thể trọng/24 giờ không ảnh Kang KH, Lee HS, Kim YC. Hepatoprotective hưởng đến các chỉ số huyết học (số lượng and free radical scavenging activities of prenylflavonoids, coumarin, and stilbene from hồng cầu, hemoglobin, bạch cầu và tiểu Morus alba. Planta Med. 2002, 68, pp.932-934. cầu) và hóa sinh gan thận A T, ALT, ure và 7. Turner A. Screening methods in creatinin. pharmacology. Academic Press, New York TÀI LIỆU THAM KHẢO and London. 1965, pp.60-68. 8. WHO. Research guidelines for evaluating 1. Bộ Y tế. Quy định về nghiên cứu dược the safety and efficacy of herbal medicines. lý các thuốc y học cổ truyền dân tộc. Quyết Manila, Philipine. 1993, pp.35-41. định 371/QĐ-BYT. 1996. 2. Thái Hồng Quang. Bệnh nội tiết. Nhà xuất bản Y học. 2002. 32
7. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014 33