Nghiên cứu quy trình tách chiết tế bào phôi thai trong máu ngoại vi của mẹ, ứng dụng chẩn đoán trước sinh bệnh di truyền

Nội dung text: Nghiên cứu quy trình tách chiết tế bào phôi thai trong máu ngoại vi của mẹ, ứng dụng chẩn đoán trước sinh bệnh di truyền

1. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 7-2012 NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT TẾ BÀO PHÔI THAI TRONG MÁU NGOẠI VI CỦA MẸ, ỨNG DỤNG CHẨN ĐOÁN TRƢỚC SINH BỆNH DI TRUYỀN Triệu Tiến Sang*; Trần Văn Khoa* TÓM TẮT Trong máu mẹ tồn tại rất ít tế bào hồng cầu có nhân lưu hành tự do. Dựa vào tách chiết vật liệu di truyền của các tế bào này để chẩn đoán dị tật di truyền trước sinh bằng biện pháp không can thiệp. Để xác định sự tồn tại của các tế bào phôi thai tự do trong máu mẹ, chúng tôi nghiên cứu 35 bà mẹ mang thai ở tuần thứ 8 đến tuần thứ 12 của thai kỳ. Trong đó, 30 phụ nữ mang thai trai và 5 phụ nữ mang thai gái. Kết quả xác định chính xác 30 phụ nữ mang thai trai và 5 phụ nữ mang thai gái. Sử dụng kháng thể đơn dòng CD71 để tách tế bào phôi. Khuếch đại ADN của tế bào bằng phản ứng PCR trên nhiễm sắc thể (NST) Y. Việc bắt được các gen trên NST Y là bằng chứng chứng tỏ quá trình tách chiết tế bào phôi thành công. Bước đầu ứng dụng chẩn đoán bất đồng nhóm máu giữa mẹ và thai nhi cho 10 ca. * Từ khóa: Tế bào phôi thai; Máu ngoại vi; Tách chiết; Chẩn đoán trước sinh; Bệnh di truyền. PROCESS OF ISOLATION OF FETAL CELLS FROM ERYTHROCYTES IN MATERNAL PERIPHERAL BLOOD AND ITS APPLICATION IN PRENATAL DNA DIAGNOSIS Summary Nucleated fetal cells circulate in maternal blood was rare. Noninvasive prenatal diagnosis was done by isolation and genetic analysis of these cells. A study on 35 pregnant women from 8th to 12th week gestation was carried out to identify circulation of fetal cells in maternal blood. The results showed that 30 pregnant women had male fetus and 5 pregnant women had female fetus. Mononuclear cells were sorted by flow cytometry using antibodies to CD antigens 71. DNA within sorted cells, amplified by PCR for Y chromosome sequences, was considered predictive of a male fetus or evidence of persistent male fetal cells. We diagnosed 10 cases of disagreement blood between mother and fetus. * Key words: Fetal cells; Peripheral blood; Isolation; Prenatal diagnosis; Genetic disease. ĐẶT VẤN ĐỀ đoán trước sinh, mang lại hiệu quả cao trong công tác nghiên cứu và chẩn đoán dị tật bẩm Hiện nay, siêu âm, test bộ ba, chọc dò sinh. Tuy vậy, khoa học vẫn đang hướng tới dịch ối hay sinh thiết gai rau là những phương pháp đang được sử dụng rộng rãi để chẩn * Học viện Quân y Chịu trách nhiệm nội dung khoa học: GS. TS. Hoàng Văn Lương PGS. TS. Quản Hoàng Lâm 34
2. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 7-2012 những phương pháp có thể chẩn đoán sớm, Máy lắc ổn nhiệt (Eppendorf-Đức); bộ điện ít can thiệp với độ chính xác cao hơn. Việc di (Biorad, Mỹ); máy PCR ABI 9700 (Applied phát hiện sự tồn tại của tế bào phôi thai Biosystem); máy định lượng ADN (Nano Drop, trong máu ngoại vi của mẹ đã mở ra một Mỹ); đèn soi UV (Biorad, Mỹ ; máy li tâm cao hướng đi mới cho việc chẩn đoán sớm các tốc (Hettich, Đức ; giá từ tính (Eppendorf, dị tật bẩm sinh bằng phương pháp không Đức); tủ hốt hoá chất (Hàn Quốc); buồng can thiệp. Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài thao tác PCR (Mỹ) này nhằm: 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. - Xây dựng quy trình tách chiết tế bào phôi thai trong máu ngoại vi của mẹ từ tuần * Nguyên tắc tách hồng cầu nhân bằng thứ 8 của thai kỳ. hạt từ tính gắn streptavidin: - Sử dụng ADN từ tế bào phôi thai để - Kháng thể CD71 được biotyn hóa sẽ sàng lọc và chẩn đoán sớm bệnh di truyền. tạo phức hợp với hạt từ đã gắn streptavidin. Sau đó, phức hợp này bắt cặp với hồng cầu ĐỐI TƢỢNG, HOÁ CHẤT VÀ nhân theo nguyên tắc miễn dịch. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - Dưới tác dụng của lực từ trường, phức 1. Đối tƣợng nghiên cứu. hợp hồng cầu nhân-hạt từ bị hút về 1 cực 35 mẫu máu lấy từ tĩnh mạch ngoại vi của nam châm. của 35 phụ nữ mang thai từ tuần thứ 8 đến - Rửa nhiều lần để thu phức hồng cầu tuần thứ 12, đến khám trước sinh tại Trung nhân-hạt từ. tâm Sinh Y Dược học Quân sự, Học viện - Dùng hóa chất, nhiệt độ để tách ADN Quân y. Trong đó: 30 mẫu được xác định ra từ hồng cầu nhân. thai mang bộ NST 46, XY; 5 mẫu xác định thai mang bộ NST 46, XX theo phương * Tách chiết ADN tế bào phôi thai qua pháp xét nghiệm ADN tự do và siêu âm các công đoạn: hình thái thai vào tháng thứ 4 của thai kỳ. - Lấy mẫu máu. 2. Hoá chất và thiết bị máy móc. - Tạo phức hợp hạt từ - hồng cầu nhân. Bảng 1: Hóa chất dùng cho nghiên cứu. - Tách phức hợp hạt từ - hồng cầu nhân. HOÁ CHẤT HÓA CHẤT HÓA CHẤT HÓA CHẤT - Tách ADN từ hồng cầu nhân. TÁCH CHIẾT DÙNG CHO DÙNG CHO DÙNG CHO ADN PCR ĐIỆN DI NHUỘM - Kiểm tra kết quả thu được. - Hạt từ tính đã - PCR - Agarose 2% - Nhuộm gel Sau khi tách chiết ADN phôi thai bằng gắn streptavidin Reaction Mix Đệm dùng agarose: - Kháng thể CD71 - DNA cho điện di ethidium hạt từ tính, tiến hành kiểm tra kết quả thông đã biotyn hóa Polymerase 0,5X TBE: bromide 10 mg/ml qua đo nồng độ, độ tinh sạch trên máy - Buffer AL - Reverse tris-base - PBS 1x primer - Axit boric quang phổ Nanodrop, nhân đoạn gen bằng - Ethanol 70%, - Forward - EDTA 0,5 M kỹ thuật PCR, điện di trên gel, đồng thời primer Ethanol 100% kiểm chứng bằng các phương pháp khác - Proteinase K - Nước cất khử ion và vô trùng - Nước cất như siêu âm thai tháng thứ tư và tách chiết * Thiết bị máy móc: ADN tự do. 37
3. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 7-2012 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1. Kết quả kiểm tra chất lƣợng bằng máy quang phổ. Sau khi tách chiết thành công ADN từ hạt từ tính, xác định nồng độ của dung dịch axít nucleic bằng cách đo độ hấp thụ tại bước sóng 260 nm (A260), tương đương với nồng độ 50 µg/ml của ADN. Nếu giá trị hấp thụ bước sóng 280 nm (A280 được xác định là bước sóng ở đó có protein có mức hấp thụ cao nhất, tỷ số A260/A280 là chỉ số cho thấy độ nhiễm của các chất như phenol hoặc protein. Tỷ lệ A260/A280: 1,8 - 2,0; nghĩa là ADN đạt độ tinh khiết theo tiêu chuẩn quốc tế (Lê Đình Lương, 2004 . Bảng 2: Kết quả đo nồng độ và độ tinh sạch. MẪU NỒNG ĐỘ ADN (µg/µl A260/A280 MẪU NỒNG ĐỘ ADN (µg/µl A260/A280 1 1,89 1,67 19 3,05 2,17 2 2,66 1,45 20 1,50 1,72 3 3,42 2,23 21 4,15 1,91 4 2,33 1,89 22 1,09 1,33 5 4,09 1,78 23 2,68 2,17 6 3,66 1,72 24 4,44 1,85 7 4,75 1,83 25 2,56 1,77 8 4,45 2,08 26 1,24 2,18 9 2,22 1,99 27 3,80 1,61 10 3,78 1,70 28 4,20 1,65 11 5,02 1,54 29 3,75 1,86 12 1,99 1,88 30 3,45 2,13 13 4,53 2,16 31 5,05 2,07 14 3,37 1,40 32 4,13 1,47 15 3,03 1,65 33 3,67 1,67 16 4,56 1,70 34 3,03 2,45 17 3,95 1,95 35 3,77 1,78 18 4,55 1,90 Kết quả kiểm tra độ tinh sạch ADN tách bằng lysis buffer có tỷ lệ A260/A280 trung bình: 1,84. 2. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen SRY. 37
4. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 7-2012 Ngoài phương pháp đo quang phổ, xác * Kết quả xác định giới tính: định nồng độ ADN thông qua độ phát sáng Phương pháp tách ADN tự do luôn xác huỳnh quang khi ADN liên kết với ethidium định được sự tồn tại của ADN thai nhi trong máu mẹ. bromid (Lê Đình Lương, 2004 . Phương pháp tách chiết tế bào phôi trong Kết quả điện di trên gel kiểm chứng ADN 30 trường hợp chứng dương, 5 trường hợp phôi thai: âm tính do không tách chiết được tế bào phôi thai, do vậy, bằng kỹ thuật nhân gen SRY không phát hiện được tế bào phôi tồn tại trong dịch tách chiết. Tần số thành công của phương pháp tách chiết tế bào phôi là 25/30. 4. Ứng dụng xác định nhóm máu Rh. * Kết quả điện di xác định nhóm máu Rh của thai nhi: M (-) (+) 1 2 3 4 5 6 M (-) (+) 1 2 3 4 5 6 Hình 2: Hình ảnh kết quả điện di tren gel sản phẩm PCR xác định nhóm máu Rh. M: Thang chuẩn; (-): chứng âm; (+): chứng dương; 1-6: Ký hiệu các mẫu. M (-) (+) 7 8 9 10 11 12 13 14 * Kết quả kiểm tra nhóm máu Rh bằng những phương pháp khác: Hình 1: Hình ảnh kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 2%. Sau khi tách chiết tế bào phôi và ứng dụng để chẩn đoán bất đồng nhóm máu (Chú thích: M: Thang ADN chuẩn. (-): chứng giữa mẹ và thai nhi. âm; (+ Chứng dương; 1→14: ADN của các Ứng dụng chẩn đoán trên 10 trường hợp mẫu ký hiệu 1 - 14). nhằm xác định bất đồng nhóm máu giữa 3. Kết quả kiểm chứng bằng những mẹ và con, kết quả cho thấy 1 trường hợp phƣơng pháp khác. không thấy xuất hiện bất đồng nhóm máu 39
5. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 7-2012 giữa mẹ và con. 9 trường hợp còn lại cho 4. Ikeya Miki, Shinya Masaru, Kitagawa kết quả dương tính, nghĩa là có sự bất đồng Michihiro. Basic investigation of the lectin method nhóm máu giữa mẹ và thai nhi. for separation and recovery of nucleated red blood cells in maternal blood, and a study into KẾT LUẬN the frequency of nucleated red blood cells in fetomaternal disorers. Congenital Anomalies. 2005. Qua nghiên cứu phương pháp tách chiết tế bào phôi từ 35 mẫu máu ngoại vi của 35 5. J.Buschm P. Huber, E. Pluger, ST. Milteny, phụ nữ mang thai từ tuần thứ 8 đến tuần J. Holtz, A.Radbruch. Enrichment of fetal cells thứ 12, kiểm tra và phân tích, so sánh kết from maternal blood by high gradient magnetic quả, chúng tôi đã hoàn thiện và áp dụng cell sorting (double MACS) for PCR-based genetic thành công quy trình tách chiết ADN tế bào analysis. 1994. phôi thai từ máu ngoại vi sử dụng hạt từ 6. M.C Hermansen. Nucleated red blood cells tính. Quy trình tách chiết đơn giản, thời gian in the fetus and newborn. tách chiết nhanh, có thể áp dụng vào thực 7. Mavrou A, Kouvidi E, Antsaklis A et al. tiễn. Kết quả thu được có nồng độ và độ tinh sạch cao, đảm bảo cho những nghiên Identification of nucleated red blood cells in cứu tiếp theo nhằm xác định bệnh tật di maternal circulation: A second step in screening truyền từ giai đoạn sớm của thai kỳ, góp for fetal aneuploides and pregnancy complications. phần giảm bớt gánh nặng cho gia đình và Prenatal Diagnosis. 2006. xã hội. Bước đầu ứng dụng chẩn đoán bất 8. Robbert J.P.Rijnders, MD.Godelive C.M.I. đồng nhóm máu giữa mẹ và thai nhi. Christiaens. MD. PhD, Bernadette Bosers. Clinical applications of cell-free fetal DNA from TÀI LIỆU THAM KHẢO maternal plasma. 9. Sekizawa Akihiko, Purwosunu Yuditiya, 1. Aali Bibi Shahnaz, Malepour Reza, Sedig Matsuoka Ryu et al. Recent advances in non- Fatemeh et al. Comparison of maternal and cord invasive prenatal DNA diagnosis through analysis blood nucleated red blood cell count between of maternal blood. The Journal of Obstetrics and pre-eclamptic and healthy women. Journal of Gynecology Research. 2007. Obstetrics an Gynecology Research. 2007. 10. Young Ho Yang, Sung Hoon Kim, Eun 2. Diana W. Bianchi. Isolation of fetal DNA from Suk Yang, Sei Kwang Kim, In Kyu Kim, Yong nucleated erythrocytes in maternal blood. 1990. Won Park, Jae Sung Cho, Yoon Holee. Prenatal 3. Dr Maitreyee. Use of fetal nucleated red diagnosis of fetal trisomy 21 from maternal blood cells in maternal circulation, for noninvasive peripheral blood. 2003. prenatal diagnosis of chromosomal and single gene disorders. Ngày nhận bài: 16/5/2012 Ngày giao phản biện: 26/7/2012 Ngày giao bản thảo in: 31/8/2012 40
6. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 7-2012 41