Nghiên cứu quy trình chiết xuất, tinh chế 10 - deacetyl baccatin III, taxol và các taxoid khác từ thông đỏ lá dài (taxus wallichiana zucc) trồng ở Đà Lạt trên quy mô pilot

Nội dung text: Nghiên cứu quy trình chiết xuất, tinh chế 10 - deacetyl baccatin III, taxol và các taxoid khác từ thông đỏ lá dài (taxus wallichiana zucc) trồng ở Đà Lạt trên quy mô pilot

1. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2014 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CHƢƠNG TRÌNH KHCN KC.10/11-15 NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT, TINH CHẾ 10-DEACETYL BACCATIN III, TAXOL VÀ CÁC TAXOID KHÁC TỪ THÔNG ĐỎ LÁ DÀI (TAXUS WALLICHIANA ZUCC) TRỒNG Ở ĐÀ LẠT TRÊN QUY MÔ PILOT Trần Công Luận*; Bùi Thế Vinh*; Vương Chí Hùng**; Nguyễn Tiến Hùng** TÓM TẮT X©y dùng quy trình chiết xuất, tinh chế các taxoid từ lá Thông đỏ bằng các kỹ thuật chiết ngấm kiệt, sắc ký trao đổi diaion HP-20, sắc ký cột silica gel pha thường. Phương pháp đơn giản, hiệu quả. 10-deacetyl baccatin III (10-DAB) và các taxoid khác thu được có độ tinh sạch cao, hiệu suất thu nhận đáng kể (10-DAB là 0,072% và taxol là 0,0014%). Quy trình này có thể áp dụng ở quy mô lớn (25 kg nguyên liệu/mẻ) để sản xuất 10-DAB, taxol và các taxoid khác từ nguyên liệu lá Thông đỏ trồng ở Lâm Đồng. * Từ khoá: 10-deacetyl baccatin III; Taxol; Taxoid; Thông đỏ lá dài. PROCESS OF extraction AND PURIFICATION OF 10-DEACETYL BACCATIN III AND TAXOL OF TAXUS WALLICHIANA CULTIVATED IN LAMDONG PROVINCE SUMMARY The process for isolation of taxoids from Taxus wallichiana Zucc was developed by the effective and simple technique as diaion HP-20 ion exchange and silica gel normal phase chromatography. By using general extraction and chromatography method, 10-deacetyl baccatin III (10-DAB) and related taxoid were isolated with the high purity and remarkable yield (0,072 % for 10-DAB and 0,0014 % for taxol). This process can be applied for large-scale to produce 10-deacetyl baccatin III and tatxol as well as the other derivatives from the leaf of Taxus wallichiana cultivated in Lamdong province. * Key words: Taxus wallichiana; Taxol; Taxuspine F; Baccatin III; Baccatin III derivatives . ĐẶT VẤN ĐỀ Nhật, Pháp để điều trị ung thư buồng trứng, Paclitaxel (taxol), một loại thuốc chữa ung thư vú, ung thư phổi. Cục Quản lý Dược ung thư đang hiện hành, được phân lập và Thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) cấp phép sử đầu tiên từ cây Thông đỏ Thái Bình Dương dụng từ năm 1992. Hãng Bristol-Myers Squibb (Taxus brevifolia Nutt). Năm 1969, Wani và (BMS) đã sớm có hợp tác với Viện Ung thư CS đã xác định cấu trúc lập thể (1971) và Quốc gia (National Cancer Institute-NCI) để được ứng dụng trong lâm sàng tại Mỹ, phát triển và thương mại hóa taxol. * Công ty Dược Vimedimec ** Đại học Y-Dược TP. HCM Ng•êi ph¶n håi: (Corresponding): Trần Công Luận (congluan53@gmail.com) Ngµy nhËn bµi: 25/12/2013; Ngµy ph¶n biÖn ®¸nh gi¸ bµi b¸o: 14/1/2014 Ngµy bµi b¸o ®•îc ®¨ng: 17/1/2014 16
2. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2014 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CHƢƠNG TRÌNH KHCN KC.10/11-15 Mỹ và một số nước châu Âu đã thành công (tỷ lệ 1:6), thu được dịch chiết. Cô giảm áp trong việc sản xuất taxol (hợp chất trị bệnh dịch chiết đến dạng cao sệt, thu được cao ung thư), nhưng lại chiết từ vỏ cây Thông MeOH thô. Dùng cao MeOH thô hòa với đỏ. Công nghệ này làm cây nhanh lão hóa nước, lắc với dichloromethan, sau khi cô và gây cạn kiệt nguồn cung cấp. Do đó, xu giảm áp dịch dichloromethan thu được cao hướng hiện nay là chiết tách taxol, đồng CH2Cl2. Nạp cao CH2Cl2 vào cột diaion HP- thời tận dụng các taxoid khác để bán tổng 20 (15 cm x 110 cm), rửa giải lần lượt với hợp taxol ở cành, lá của các loài Thông đỏ. các dung môi: nước, MeOH 10%, MeOH Ở nước ta, loài Thông đỏ lá dài (Taxus 60%, MeOH 80%, MeOH 100%. wallichiana Zucc.) được xem là nguồn - Phân lập các hợp chất: nguyên liệu tiềm năng nhất để sản xuất + Phân đoạn cột diaion HP-20 MeOH thuốc trị bệnh ung thư, vì các taxoid chính 60%: s¾c ký cét (SKC) silica gel phân đoạn có trong lá Thông đỏ có hàm lượng cao [2, MeOH 60% với hệ dung môi giải ly ete dầu 4, 7]. Hiện trong nước vẫn chưa có nghiên hỏa-aceton có độ phân cực tăng dần, thu cứu nµo công bố về quy trình pilot thu nhận được 3 phân đoạn (III ) và một chất kết taxoid từ Thông đỏ lá dài. Báo cáo này 1 → 3 tinh T SKC silica gel phân đoạn III với hệ thông báo quy trình chiết tách, tinh chế các 1. 2 dung môi CHCl -MeOH có độ phân cực taxoid trong Thông đỏ lá dài ở quy mô pilot 3 tăng dần (100% CHCl → CHCl -MeOH 100:5), với mục tiêu cung cấp nguyên liệu taxol và 3 3 thu được ba phân đoạn III , III , III . các tiền chất bán tổng hợp taxol cho sản 2-1 2-2 2-3 xuất thuốc điều trị ung thư. Đây cũng là mét Phân đoạn III2-2 có hai vết chính, tiếp tục phÇn kết quả của đề tài “Nghiên cứu quy tiến hành SKC silica gel pha đảo với hệ trình công nghệ chiết tách hoạt chất sinh dung môi MeOH-H2O (40:60), phân lập được học từ lá của cây Thông đỏ và cây Dừa cạn hai chất tinh sạch, ký hiệu là T2, T3. Việt Nam phục vụ sản xuất thuốc chống ung SKC silica gel phân đoạn III3 với hệ dung thư và xuất khẩu. Thuộc Chương trình Khoa môi CHCl3-MeOH có độ phân cực tăng dần học Công nghệ trọng điểm cấp Nhà nước. (100% CHCl3 → CHCl3-MeOH 95:5), thu được phân đoạn III3-1 (100% CHCl3), III3-2 và kết tinh màu trắng, ký hiệu T4. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP Phân đoạn III tiếp tục qua SKC silica NGHIÊN CỨU 3-1 gel với hệ dung môi giải ly ete dầu hỏa- 1. Nguyên liệu. aceton có độ phân cực tăng dần thu được Nguyên liệu: lá và cành của cây Thông mét kết tinh trắng tinh sạch, ký hiệu T5. đỏ lá dài được trồng ở Lâm Đồng do Trung + Phân đoạn cột diaion HP-20 MeOH tâm Trồng và Chế biến cây thuốc Đà Lạt 60%: SKC silica gel phân đoạn MeOH 100% cung cấp. Nguyên liệu sau khi thu hái, rửa với hệ dung môi giải ly ete dầu hỏa-aceton sạch, phơi khô, xay thành bột và bảo quản có độ phân cực tăng dần thu được kết tinh ở nhiệt độ phòng đến khi chiết xuất. hình kim trắng, ký hiệu T6. 2. Phƣơng pháp nghiªn cøu. - Phương pháp phân tích: phổ IR đo trên máy IR FTIR 8201 (Shimadzu). Phổ 1H, 13C - Chiết xuất: làm ẩm bột nguyên liệu và NMR được đo trên máy Bruker AM500 ngâm 24 giờ, chiết ngấm kiệt bằng MeOH FT-NMR và JEOL JNM GX-400, đo trong 18
3. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2014 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CHƢƠNG TRÌNH KHCN KC.10/11-15 CDCl3 vµ MeOD với tetramethyl silan (TMS) NMR 1 chiều và 2 chiều, đối chiếu tài liệu làm chất chuẩn nội. Sắc ký lớp mỏng được tham khảo [9] nhận định T1 là taxuspine F. thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica + Phổ 1H NMR cho các tín hiệu cộng gel 60F254 (Merck). Hệ khai triển CHCl3- hưởng H [1,74 (3H, s, 16-Me); 1,12 (3H, s, MeOH. Diaion HP-20 (Misubishi) và silica 17-Me); 2,31 (3H, s, 18-Me) và 0,97 (3H, s, gel 60 F254 (0,063-0,200 mm) (Merck) được 19-Me)]; H [2,05 (3H, s, 2-OAc), 2,05 (3H, s, dùng trong SKC. 7-OAc), 2,06 (3H, s, 9-OAc) và 2,01 (3H, s, KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 10-OAc)], proton oxymetin H [5,60 (1H, m, 1. KÕt qu¶ chiÕt xuÊt vµ ph©n lËp. H-2); 4,20 (1H, m, H-5), 5,53 (1H, m, H-7), Chiết ngấm kiệt 25 kg bột nguyên liệu 5,91 (1H, d, H-9) và 6,26 (1H, d, H-10)], Thông đỏ bằng MeOH (1:6), thu được khoảng proton metylen H [1,63, m; 1,94, m, (H-6a 150 lít dịch chiết. Sau khi cô giảm áp, thu được và H-6b); 2,31, m; 2,78, dd, (H-14a và H-14b) 8 kg cao MeOH. proton metylen gắn trên carbon olefin H [4,81 (1H, s, H-20a) và 5,21 (1H, s, H-20b)], Hòa 1 lít nước vào 1 kg cao MeOH, proton metin H [2,19 (1H, dd, H-1)] và H lắc phân đoạn với khoảng 12 lít CH2Cl2, cô giảm áp dịch trích ly thu được 200 g cao [3,53 (1H, d, H-3)]. 13 CH2Cl2. + Phổ C NMR cho các tín hiệu của 28 C gồm: 8 carbon methyl, 2 carbon methylen Nạp 200 g cao CH2Cl2 vào cột diaion HP-20, rửa giải lần lượt bằng các dung môi và 1 carbon tứ cấp [C 37,7 (C-15)] vùng nước (30 lít), MeOH 10% (60 lít), MeOH trường cao, 1 carbon carbonyl [C 199,4 (C-9)], 60% (150 lít), MeOH 80% (60 lít), MeOH 4 carbon carbonyl ester [C 169,7 (10-OAc), 100% (60 lít). 169,3 (2-OAc), 169,1 (7-OAc) và 169,1 Phân đoạn cột diaion HP-20 MeOH 60% (9-OAc)], 3 carbon olefin bậc bốn [C 144,7 (42 g) thực hiện SKC hấp phụ trên silica gel (C-4); 149,8 (C-11) và 139,1 (C-12)], 1 carbon pha thường và pha đảo với nhiều hệ dung olefin bậc hai [C 115,4 (C-20)], 5 carbon môi giải ly có độ phân cực khác nhau, chúng bậc ba mang oxygen [C 68,9 (C-2), 74,5 (C-5), 69,5 (C-7), 75,1 (C-9) và 72,7 (C-10)], tôi đã phân lập được 4 chất, ký hiệu: chất T1 (500 mg; 0,012%), T2 (160 mg; 0,0038%), 2 carbon bậc ba [C 48,8 (C-1) và 39,7 T3 (50 mg; 0,0012%), T4 (3 g; 0,072%) và T5 (C-3)] và carbon bậc bốn [C 144,7 (C-4)]. (93 mg; 0,0022%). Phân đoạn cột diaion HP-20 MeOH 100% (45 g), thực hiện SKC hấp phụ trên silica gel pha thường thu được T6 (60 mg; 0,0014%). 2. Kết quả xác định cấu trúc hóa học các chất chiết đƣợc. - Chất T1. + Được phân lập dưới dạng bột màu trắng, kém tan trong MeOH, tan trong hệ dung môi CHCl3-MeOH, sắc ký lớp mỏng bằng hệ dung môi CHCl3-MeOH (9:1) cho vết tắt quang ở bước sóng UV 254 nm. Hiện hình bằng H2SO4 10%/EtOH, xuất Hình 1: Cấu trúc hóa học của taxuspin F (T1). hiện vết tròn màu hồng nhạt với Rf = 0,48. Hiệu suất thu nhận là 0,012%. Dựa vào phổ 19
4. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2014 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CHƢƠNG TRÌNH KHCN KC.10/11-15 - Chất T2: quang ở bước sóng 254 nm. Hiện hình + Được phân lập dưới dạng bột màu bằng H2SO4 10%/EtOH, xuất hiện vết tròn trắng, kém tan trong MeOH, tan trong hệ màu nâu với Rf = 0,29. Hiệu suất thu nhận dung môi CHCl3-MeOH, sắc ký lớp mỏng là 0,0012%. Dựa vào phổ NMR 1 và 2 chiều, bằng hệ dung môi CHCl3-MeOH (9:1) cho đối chiếu tài liệu tham khảo [3] nhận định T3 vết tắt quang ở bước sóng 254 nm. Hiện là baccatin III. 1 hình bằng H2SO4 10%/EtOH xuất hiện vết + Phổ H- NMR cho các tín hiệu cộng tròn màu nâu với Rf = 0,18. Hiệu suất thu hưởng H [1,07 (3H, s, 16-Me); 1,25 (3H, s, nhận là 0,0038%. Dựa vào phổ NMR 1 và 2 17-Me); 1,99 (3H, s, 18-Me) và 1,57 (3H, s, chiều, đối chiếu tài liệu tham khảo [10] nhận 19-Me)]; H [2,22 (3H, s, 10-OAc) và 2,37 định T2 là 19-hydroxybaccatin III. (3H, s, 4-OAc)], proton oxymetin H [6,26 + Phổ 1H-NMR cho tín hiệu cộng hưởng (1H, d, H-2); 4,99 (1H, d, H-5); 4,45 (1H, dd, H [1,09 (3H; s; 16-Me); 1,29 (3H; s; 17- H-7); 6,86 (1H, s, H-10) và 4,82 (1H, m, H-13)], Me); 1,99 (3H; s; 18-Me)]; H [2,30 (3H; s; 4- proton metylen [H 2,35, 2,41 (H-6a và H-6b) OAc) và H [2,24 (3H; s; 10-OAc)], proton và 2,28 (2H, H-14)], proton metin [H 4,01 (1H, d, H-3)], proton metylen gắn carbon có oxymethin H [6,43 (1H; d; 6,5 Hz; H-2); 5,05 (1H; d; 9,0 Hz; H-5); 4,40 (1H; m; H-7); mang oxygen [H 4,38 (1H, d, H-20a) và 6,43 (1H; s; H-10) và 4,80 (1H; m; H-13)], 4,23 (1H, H-20b)]. + Phổ 13C- NMR cho các tín hiệu của 31 proton methylen H [2,54 (m); 1,78 (m) (H- 6a và H-6b) và 2,14 (m, 2H-14)], proton carbon với tín hiệu đặc trưng gồm 1 carbon carbonyl [C 205,5 (C-9)], 3 carbon carbonyl methin H [3,89 (1H; d; H-3)], proton ester [C 172,4 (10-OAc), 169,3 (4-OAc) và methylen gắn carbon mang oxygen H [4,35 167,1 (s, 2-OBz)], 6 carbon hương phương (m; H-20)] và proton methylen -CH2-OH H [4,64 (2H; m; H-19)]. [C 129,5 (C-1′), 130,1 (C-2′,6′), 132,1 (C-3′,5′) Phổ 13C-NMR cho các tín hiệu của 31 và 133,6 (C-4′)], 2 carbon olefin bậc bốn [C carbon với tín hiệu đặc trưng gồm: 1 carbon 129,5 (C-11) và 144,2 (C-12)], 1 carbon bậc hai mang oxygen [C 74,8 (C-20)], 5 carbon carbonyl C [204,5 (C-9)], 3 carbon carbonyl bậc ba mang oxygen [C 77,8 (C-2), 82,2 ester C [170,7 (4-OAc); 170,8 (10-OAc); 166,9 (2-OBz)], 6 carbon trong vòng benzen (C-5), 72.3 (C-7), 78,7 (C10), 68,0 (C-13)] và 2 carbon bậc bốn mang oxygen [C 79,2 C [129,2 (C-2′,6′); 128,8 (C-3′,5′); 133,7 (C-4′); (C-1) và 81,5 (C-4)]. 129,9 (C-1′)], 2 carbon olefin bậc bốn C - Chất T : [131,5 (C-11) và 146,5 (C-12)]; 2 carbon 4 Được phân lập dưới dạng bột màu bậc ba mang oxygen  [75,6 (C-2); 84,4 C trắng, kém tan trong MeOH, tan trong hệ (C-5); 71,1 (C-7); 76,7 (C-10); 66,7 (C-13)], dung môi CHCl3-MeOH. Sắc ký lớp mỏng 2 carbon bậc bốn mang oxygen C 78,0 (C-1) bằng hệ dung môi CHCl3-MeOH (9:1), cho và 80,4 (C-4)]. vết tắt quang ở UV 254 nm. Hiện hình bằng - Chất T3: H2SO4 10%/EtOH, xuất hiện vết tròn màu + Phân lập dưới dạng bột màu trắng, nâu với Rf = 0,06. Hiệu suất thu nhận là tan kém trong MeOH, tan trong hệ dung 0,072%. Dựa vào phổ NMR 1 và 2 chiều, môi CHCl3-MeOH, sắc ký lớp mỏng bằng đối chiếu tài liệu tham khảo [2] nhận định T4 hệ dung môi CHCl3-MeOH (9:1) cho vết tắt là 10-deacetyl baccatin III. 20
5. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2014 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CHƢƠNG TRÌNH KHCN KC.10/11-15 1 + Phổ H- NMR cho các tín hiệu cộng R R1 R2 T2 (19- H OAc CH2OH hưởng H [1,06 (3H, s, 16-Me); 1,09 (3H, s, hydroxybaccatin III) 17-Me); 2,05 (3H, s, 18-Me) và 1,72 (3H, s, T3 (baccatin III) H OAc CH3 T4 (10 deacetyl H OH CH3 19-Me)]; H [2,32 (3H, s, 4-OAc)], proton baccatin III) oxymetin H [5,62 (1H, d, H-2); 5,00 (1H, d, T6 (taxol) C6H5-CH(NH-CO- OAc CH3 C6H5-CH(OH) H-5); 4,25 (1H, dd, H-7); 5,28 (1H, s, H-10) Hình 2: Cấu trúc hóa học của T2, T3, T4, T6. và 4,81 (1H, m, H-13)], proton metylen [H - Chất T . 1,86; 2,52 (H-6a và H-6b) và 2,21; 2,29 (2H, 5 Được phân lập dưới dạng kết tinh hình H-14)], proton metin [ 3,98 (1H, d, H-3)], H kim, kém tan trong MeOH, tan trong hệ proton metylen gắn carbon có mang oxygen dung môi CHCl3-MeOH. Sắc ký lớp mỏng [H 4,31 (1H, d, H-20a) và 4,21 (1H, H-20b)]. bằng hệ dung môi PE-Ac2O (6:4) và hiện + Phổ 13C- NMR cho các tín hiệu của 29 hình bằng H2SO4 10%/EtOH, xuất hiện vết carbon với tín hiệu đặc trưng gồm: 1 carbon tròn màu nâu xám với Rf = 0,56. Hiệu suất carbonyl [C 211,6 (C-9)], 2 carbon carbonyl thu nhận là 0,0022%. Dựa vào phổ NMR 1 ester [C 171,2 (4-OAc) và 167,2 ( 2-OBz)], và 2 chiều, đối chiếu tài liệu tham khảo [5] 6 carbon hương phương [ 129,9 (C-1′), C nhận định T4 là taxchin A. 130,2 (C-2′,6′), 128,8 (C-3′,5′) và 133,7 (C-4′)], + Phổ 1H-NMR cho các tín hiệu cộng 2 carbon olefin bậc bốn [C 134,2 (C-11) hưởng H [1,68 (3H, s, 16-Me); 1,16 (3H, s, và 144,0 (C-12)], 1 carbon bậc hai mang 17-Me); 2,21 (3H, s, 18-Me) và 0,95 (3H, s, oxygen [C 76,9 (C-20)], 5 carbon bậc ba 19-Me)]. 6 nhóm -OAc H [1,96 (3H, s, 5-OAc); mang oxygen [C 75,1 (C-2), 84,9 (C-5), 2,02 (3H, s, 7-OAc); 2,05 (3H, s, 9-OAc); 71.7 (C-7), 75,3 (C10) và 67,2 (C-13)], 2 2,05 (3H, s, 10-OAc); 2,11 ( 3H, s, 13-OAc); carbon bậc bốn mang oxygen [C 78,8 (C-1) 2,23 (3H, s, 20-OAc)]. Proton oxymethin H và 81,0 (C-4)]. [4,24 (1H, m, H-2)], proton methylen H [1,9 (H-6a; H-6b); 1,47 và 2,63 (H-14a, H-14b); 3,94 và 4,53 (H-20a, H-20b)]. Proton methin H [2,62 (1H,H-3); 2,21 (1H, H-4); 5,01 (1H, H-5); 5,39 (1H, H-7); 5,77 (1H, H-9); 6.15 (1H, H-10); 5.95 (1H, H-13)]. + Phổ 13C-NMR cho các tín hiệu của 32 carbon, trong đó có tín hiệu đặc trưng gồm 6 carbon carbonyl ester C [171,4 (5-OAc); 170,4 (7-OAc); 170,4 (9-OAc); 170,1 (10-OAc); 169,8 (13-OAc); 169,1 (20-OAc)]. 2 carbon olefin bậc bốn C [133,6 (C-11) và 137,8 (C-12)]; 1 cacbon bậc ba mang oxygen C [68,74 (C-2)]. 21
6. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2014 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CHƢƠNG TRÌNH KHCN KC.10/11-15 (C-2-OBz)], 18 tín hiệu carbon hưíng phương vùng trường thấp 120-140 ppm, hai carbon olefin bậc bốn [C 134,0 (C-11) và 142,1 (C-12)], 1 carbon bậc hai mang oxygen [C 76,8 (C-20)], 5 carbon bậc ba mang oxygen [C 75,9 (C-2); 85,0 (C-5), 72,4 (C-7); 76,2 (C10) và 71,9 (C-13)] và 2 carbon bậc bốn mang oxygen [C 78,8 (C-1) và 81,7 (C-4)]. Có nhiều quy trình công bố về chiết tách, thu nhận 10-DAB và taxoid khác trong Hình 3: Cấu trúc hóa học của taxchin A (T5). Thông đỏ. Các giai đoạn của quy trình tóm tắt như sau: (1) sử dụng dung môi để chiết hoạt chất khỏi nguyên liệu ban đầu, (2) loại - Chất T6. các tạp chất còn trong dịch chiết bằng Được phân lập dưới dạng kết tinh hình phương pháp hóa học (lắc phân đoạn, dùng kim, kém tan trong MeOH, tan trong hệ tác nhân loại màu, chất nhày... (3) dùng phương pháp sắc ký cột với nguyên liệu dung môi CHCl3-MeOH. Sắc ký lớp mỏng silica gel pha thuận hay pha đảo để thu bằng hệ dung môi CHCl -MeOH (9:1) và 3 nhận taxoid tinh khiết. Trong đó, quy trình hiện hình bằng H SO 10%/EtOH xuất hiện 2 4 của KV Rao (1995, Mỹ) [5] đề cập đến việc vết tròn màu nâu xám với Rf = 0,70. Hiệu thu nhận các taxoid chính: taxol, 10-DAB, suất thu nhận là 0,0014%. Dựa vào phổ baccatin III, cephalomannin ở quy mô công NMR 1 và 2 chiều, đối chiếu tài liệu tham nghiệp. Sử dụng phương pháp chiết hoàn khảo [5] nhận định T6 là taxol. lưu liên tục bằng MeOH, chiết phân đoạn + Phổ 1H- NMR cho tín hiệu cộng hưởng lỏng, áp dụng phương pháp sắc ký cột áp suất trung bình pha đảo và pha thuận. Kết H [1,20 (3H, s, 16-Me); 1,22 (3H, s, 17-Me); 1,80 (3H, s, 18-Me) và 1,65 (3H, s, 19-Me)]; quả thu được taxol (0,04%, tính trên khối lượng nguyên liệu vỏ), 10-DAB (0,02%) và  [2,15 (3H, s, 10-OAc) và 2,42 (3H, s, H các taxoid khác. 4-OAc)], proton oxymetin  [5,68 (1H, d, H Việc thu nhận taxoid từ lá Thông đỏ lá H-2); 4,49 (1H, d, H-5); 4,40 (1H, dd, H-7); dài sử dụng vật liệu sắc ký là nhựa diaion 6,39 (1H, s, H-10) và 6,19 (1H, m, H-13)], HP-20 và hạt silica gel pha thường khá proton metylen [H 1,79 và 2,46 (H-6a và H- đơn giản, có giá thành rẻ. Với pha tĩnh 6b); 2,20 và 2,38 (2H, H-14)], proton metin diaion HP-20, pha động là hệ dung môi [H 3,83 (1H, d, H-3)], proton metylen gắn MeOH:H2O, có thể thu hồi dung môi, tái sử dụng cả pha tĩnh và pha động, điều này có carbon có mang oxygen [H 4,16 (1H, d, H-20a) và 4,23 (1H, H-20b)] cùng với các ý nghĩa lớn về mặt sản xuất. Mặt khác, cột sử dụng là thép không gỉ, dễ thiết kế, áp tín hiệu proton của ba nhân thơm ở vùng dụng ở quy mô lớn. Quy trình này có nhiều trường thấp 7 - 8 ppm. 13 ưu điểm hơn quy trình đã nghiên cứu của + Phổ C- NMR cho các tín hiệu của 47 KV Rao và CS (sử dụng cột sắc ký pha carbon với tín hiệu đặc trưng gồm 1 carbon đảo có áp suất, thiết bị tốn kém, pha tĩnh carbonyl [C 203,7 (C-9)], 5 carbon carbonyl sau khi sử dụng phải rửa nhiều lần trước ester [C 171,1 (10-OAc); 170,6 (4-OAc); khi tái sử dụng ). 173,6 (C-1’); 166,6 (C-2’’-OBz) và 167,6 22
7. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2014 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CHƢƠNG TRÌNH KHCN KC.10/11-15 KẾT LUẬN Quy trình thu nhận các taxoid từ lá cây 5. Gwendolyn N Chmurny, Bruce D Hilton, Thông đỏ lá dài Taxus wallichiana Zucc. Susan Brobst, Sally A Look, Keith M Witherup, đã được khảo sát ở quy mô pilot (tương John A Beutler. 1H- and 13C-NMR assignments đương 3 kg lá khô/mẻ) với thiết bị và for taxol, 7-epi-taxol and cephalomannine. Journal nguyên liệu sắc ký giá thành rẻ, đơn giản of natural products. 1992, 55 (4), pp.414-423. và dễ dàng nâng cấp trªn quy mô công 6. Koppaka V Rao, Jampani B Hanuman, nghiệp. Hiệu suất thu nhận các taxoid Claudio Alvarez, Mark Stoy, John Juchum, Richard tương đối cao (0,072% 10-DAB; 0,0014% M Davids, Ronald Baxley. A new large-scale process for taxol and related taxanes from Taxus taxol) so với hàm lượng có trong nguyên brevifolia. Pharmaceutical Research. 1995, 12 (7). liệu (0,1 - 0,2% 10-DAB và 0,004% taxol) [3]. 7. Mroczek T, Glowniak K. Solid-phase extraction TÀI LIỆU THAM KHẢO and simplified high-performance liquid chromatographic determination of 10-deacetylbaccatin III and related 1. Trần Công Luận, Ngô Thiện Tú Khanh, taxoids in yew species. Journal of Pharmaceutical Phan Văn Đệ, Vương Chí Hùng. Nghiên cứu and Biomedical Analysis. 2001, 26, pp.89-102. đặc điểm vi học và thành phần hóa học của lá 8. Horiguchi T, Cheng Q, Oritani T. Two Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.), trồng ở novel taxane diterpenoids from the needles of Lâm Đồng. Tạp chí Y học TP. HCM. 2008, 12 Japanese Yew, Taxus cuspidate. Bioscience, (4), tr.98-104. Biotechnology and Biochemistry. 2000, 64 (4), 2. Nguyễn Thị Thanh Tâm, Nguyễn Trung Nhân. pp.894-898. Nghiên cứu thành phần hóa học của lá cây 9. Naotoshi Y, Sasaki T, Kobayashi J, Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc), họ Thông Inubushi A, Hosoyama I. and Shigemori H. đỏ (Taxaceae). Tạp chí Phát triển KH&CN. 2009, Taxuspines E ~ H and J, New Taxoids from the 12 (10), tr.57-63. Japanese Yew Taxus cuspidate. Tetrahedron. 3. Nguyễn Ngọc Song Trâm, Bùi Thế Vinh, 1995, 51 (21), pp.5971-5978. Nguyễn Hoàng Quỳnh Hương, Trần Công Luận. 10. Mclaughlin JL, Miller RW, Powell RG, Xây dựng quy trình định lượng 10-DAB và taxol Smith CR. 19-hydroxybaccatin III, 10- trong lá Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.). deacetylcephalomannine, and 10-deacetyltaxol: Tạp chí Y học TP. HCM. 2008, tập 12, phụ bản new antitumor taxanes from Taxus wallichiana. của số 4, tr.105-111. Journal of Natural Products. 1981, 44 (3), pp.312-319. 4. Nguyen Huu Toan Phan, Nguyen Thi Dieu Thuan, Chau Van Minh, Nguyen Cong Hao. Constituents of Taxus wallichiana Zucc in Vietnam. Proceedings of the fourth Indochina Conference on Pharmaceutical sciences. 2005, 1, pp.186-189. 23
8. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2014 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CHƢƠNG TRÌNH KHCN KC.10/11-15 24