Nghiên cứu phân lâp vi khuẩn và tách chiết enzym urease từ môi trường nuôi cấy helicobacter pylori

Nội dung text: Nghiên cứu phân lâp vi khuẩn và tách chiết enzym urease từ môi trường nuôi cấy helicobacter pylori

1. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 NGHIÊN CỨU PHÂN LÂP VI KHUẨN VÀ TÁCH CHIẾT ENZYM UREASE TỪ MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY HELICOBACTER PYLORI Đỗ Hoàng Long*; Đỗ Minh Trung* Lê Thu Hồng**; Lê Văn Đông* TÓM TẮT Ức chế enzym urease bằng kháng thể đặc hiệu theo đường uống là một hướng nghiên cứu mới trong điều trị nhiễm Helicobacter pylori, nhằm đối phó với tình trạng vi khuẩn (VK) kháng kháng sinh. Nghiên cứu này được tiến hành nhằm phân lập VK từ mô sinh thiết ổ loét dạ dày tá tràng (DD-TT); nuôi cấy tăng sinh và tách chiết urease từ môi trường nuôi cấy VK làm nguyên liệu chế tạo kháng thể kháng urease. Kết quả: đã phân lập được 17 chủng H. pylori từ 18 mẫu bệnh phẩm sinh thiết, đạt tỷ lệ thành công 94,5%. Ba chủng H. pylori có hoạt độ urease cao được chọn và tăng sinh trong môi trường Brucella broth. Tách chiết urease từ dịch nuôi cấy bằng kỹ thuật kết tủa phân đoạn với ammonium sulfate 50% bão hòa. Sản phẩm thu được có hoạt tính urease và tương đối tinh khiết. Kết quả điện di SDS-PAGE trong điều kiện biến tính cho một băng đậm, tương ứng với tiểu đơn vị có trọng lượng phân tử khoảng 60,3 kDa của urease. * Từ khóa: Urease; Helicobacter pylori; Tách chiết enzym. HELICOBACTER PYLORI ISOLATION AND UREASE EXTRACTION FROM CULTURE BROTH SUPERNATANT SUMMARY Urease inhibition with oral specific antibody is a new approach in treatment of Helicobacter pylori infection, coping with antibiotic resistance of this bacterium. This research aims to isolate H. pylori from gastric-peptic ulcer biopsies and extract urease from bacterial culture broth to be used as material for the development of antibody to urease. 17 H. pylori strains were obtained from 18 biopsy samples (94.5%). Among them, three strains which showed highest urease activity were then sub-cultured in Brucella broth. Urease was extracted from culture supernatant by precipitation with ammonium sulfate 50% saturation. The obtained product maintained urease activity and relatively pure. SDS-PAGE analysis in denature condition showed that, the urease contained product express as a single band, corresponding with subunit B of urease with molecular masses of approximately 60.3 kDa. * Key words: Urease; Helicobacter pylori; Enzyme extraction. * Học viện Quân y ** Bệnh viện 103 Người phản hồi (Corresponding): Lê Văn Đông (levandong@yahoo.com) Ngày nhận bài: 28/11/2013; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 8/12/2013 Ngày bài báo được đăng: 18/12/2013 11
2. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 ĐẶT VẤN ĐỀ bào thai bê (FBS - Fetal bovine serum) Viêm loét DD-TT là bệnh lý thường gặp (Gibco, Mỹ), Pylori agar (BioMérieux, Pháp) ở Việt Nam cũng như trên thế giới. Tỷ lệ và túi ủ GENbag microear (BioMérieux, Pháp). mắc bệnh này khá cao, 60 - 70% ở Việt Nam, 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. còn ở các nước khác dao động từ 50 - 90%. * Phân lập và định danh H. pylori từ bệnh Có nhiều nguyên nhân gây viêm loét DD- phẩm: TT, trong đó, nguyên nhân thường nhắc Bệnh phẩm sinh thiết qua nội soi được đến hiện nay là do nhiễm VK Helicobacter bảo quản trong ống nghiệm chứa BHI broth pylori, chiếm 75 - 95% [3, 5, 10]. Việc điều vô trùng và vận chuyển về phòng thí nghiệm trị viêm loét DD-TT do nhiễm H. pylori rất tại Bộ môn Khoa Vi sinh, Bệnh viện 103. Tại phức tạp, vì phải sử dụng phác đồ phối hợp đây, nghiền nát bệnh phẩm bằng dụng cụ các thuốc kháng sinh với thuốc giảm toan, vô trùng và nuôi cấy phân lập chọn lọc giảm tiết đúng, đủ liều, đủ thời gian và đúng trong đĩa petri chứa môi trường Pylori agar quy cách. Tuy nhiên, khả năng thất bại trong đặt trong túi vi hiếu khí GENbag microear điều trị rất lớn, do tình trạng VK kháng kháng (5% O2, 10% CO2, 85% N2 và độ ẩm cao) ở sinh [1, 6]. Xuất phát từ thực tế lâm sàng, 37oC. VK được phân lập sau 5 ngày nuôi nhu cầu tìm ra các thuốc mới có tác dụng cấy và định danh bằng nhuộm Gram, các ức chế hoặc ngăn ngừa nhiễm H. pylori ph ản ứng sinh hóa như oxidase, catalase mà không lo ngại tình trạng kháng thuốc, và urease [3, 5]. trong đó có phương pháp miễn dịch trị liệu * Nuôi cấy tăng sinh H. pylori và tách thụ động sử dụng kháng thể kháng trực tiếp chiết urease từ dịch nuôi cấy: H. pylori hoặc kháng enzym urease của Nuôi cấy các chủng H. pylori có hoạt tính H. pylori, thành phần quan trọng trong quá urease mạnh nhất tăng sinh trong môi trình sinh bệnh của H. pylori, giúp chúng né trường Brucella broth trong tủ ấm 37oC có tránh, tồn tại và phát triển được trong môi lắc liên tục trong 72 giờ. Urease được tách trường axít của dịch dạ dày, là một việc làm chiết từ dịch nuôi cấy bằng kỹ thuật kết tủa triển vọng [8]. Từ đó, nghiên cứu này được phân đoạn với ammonium sulfate 50% độ tiến hành nhằm mục tiêu: Phân lập VK và bão hòa. Sản phẩm kết tủa được thẩm tích tách chiết urease từ H. pylori làm nguyên liệu loại muối, xác định hoạt tính urease, xác chế tạo kháng thể đặc hiệu kháng urease. định độ tinh sạch và kích thước. Xác định VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP hoạt tính urease trong dịch nuôi cấy và sản NGHIÊN CỨU phẩm sau mỗi bước tách chiết nhờ test 1. Vật liệu nghiên cứu. urease theo nguyên lý urease thủy phân ure thành ammonia, tạo môi trường kiềm và 18 mẫu bệnh phẩm sinh thiết ổ loét DD- chuyển chỉ thị màu đỏ phenol trong môi TT qua nội soi của 18 bệnh nhân bị loét trường phản ứng thành màu hồng cánh sen DD-TT đến khám tại phòng khám nội soi có độ hấp phụ quang mạnh nhất ở bước tiêu hóa, Bệnh viện 103 từ tháng 12 - 2011 sóng 340 nm. Xác định nồng độ protein và tháng 3 - 2012. enzym thu được bằng kỹ thuật Bradford. Các hóa chất sinh phẩm: BHI (Brain- Xác định độ tinh sạch và kích thước của heart infusion broth) (BioRad, Mỹ), Brucella broth (Neogen Corporation, Mỹ), huyết thanh 13
3. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 sản phẩm bằng phương pháp điện di SDS- 04 + + + + + PAGE 10% trong điều kiện biến tính. 05 + + + + + 06 + + + + + KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ 07 + + + + + BÀN LUẬN 08 + + + + + 09 + + + + + 1. Phân lập VK. 10 - Sau 5 ngày nuôi cấy, 17/18 mẫu phân 11 + + + + + 12 + + + + + lập (94,5%) (trừ mẫu số 10) có VK mọc với 13 + + + + + hình ảnh khuẩn lạc tròn, bóng, màu xám 14 + + + + + trong, đường kính 0,5 - 1 mm. 15 + + + + + 16 + + + + + 17 + + + + + 18 + + + + + H. pylori là một trong những VK rất khó phân lập và chỉ mọc ở những môi trường chuyên biệt với điều kiện thích hợp. Pylori agar và túi ủ GENbag microear (5% O2, o 10% CO2, 85% N2 và độ ẩm cao) ở 37 C được xác định là thích hợp cho chúng tăng sinh theo khuyến cáo của nhiều tác giả [5]. Hình 1: Khuẩn lạc thu được khi nuôi cấy Đó có thể là lý do giải thích tại sao tỷ lệ trong môi trường vi hiếu khí. phân lập H. pylori của chúng tôi đạt được 94,5%, cao hơn các tác giả khác trong nước Kết quả nhuộm Gram và các phản ứng (47 - 56,4%) [1]. sinh hóa cho thấy cả 17 chủng phân lập đều 2. Tách chiết urease. cho kết quả nhuộm Gram (-) và hình thể đa 0.7 số là hình cong, mức độ xoắn nhẹ, không điển hình. Kết quả các phản ứng sinh hóa 0.6 để định danh H. pylori gồm urease, oxydase 0.5 và catalase đều cho kết quả dương tính. 0.4 OD (340 nm) (340 OD 0.3 Bảng 1: Kết quả nuôi cấy phân lập và định 0.2 danh VK. 0.1 PHẢN ỨNG SINH HÓA MÃ SỐ 0.0 NUÔI NHUỘM NGHIÊN CẤY GRAM Urease Oxydase Catalase 01 02 03 04 05 06 07 08 09 11 12 13 14 15 16 17 18 CỨU 01 + + + + + Chñng vi khuÈn Helicobacter pylori 02 + + + + + 03 + + + + + Hình 2: Kết quả phản ứng urease của các chủng H.pylori thu được. 14
4. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 Kết quả phân tích hoạt tính urease trong tiểu đơn vị. Tuy nhiên, kết quả thu được chỉ dịch nổi của 17 chủng VK nghiên cứu nhận gần giống nhau chứ không trùng khớp với thấy 3 chủng H. pylori (HP13, HP16 và nhau hoàn toàn, mặc dù cùng chung một HP18) có hoạt tính cao hơn và hoạt tính phương pháp xác định. Điều này chứng này còn cao hơn nữa sau khi cho tăng sinh tỏ urease từ các chủng khác nhau của lần 1 (sau 24 giờ), lần 2 (qua đêm) và lần 3 H. pylori có một số khác biệt về phân tử (sau 48 giờ) của cả 3 chủng H. pylori này lượng từng chuỗi tiểu đơn vị. Trong nghiên [4, 8]. Ba chủng HP13, HP16 và HP18 cứu này, trên băng điện di của ba chủng VK được lựa chọn để nuôi cấy tăng sinh và H. pylori cũng chỉ có một vạch sáng nhất, phân lập urease tương đương nhau và tương ứng về lý thuyết với kích thước của tiểu đơn vị B trong phân tử urease. Tại Việt Nam, mới chỉ có nghiên cứu tách chiết, tinh sạch urease từ thực vật và hoàn toàn chưa có tác giả nào nghiên cứu về urease của VK H. pylori [2]. KẾT LUẬN Đã phân lập được 17 chủng H. pylori từ 18 mẫu sinh thiết ổ loét DD-TT. Đã tách chiết được enzym urease từ dịch nuôi cấy của 3 chủng sinh urease với hoạt tính cao nhất; sản phẩm thu được còn giữ được Hình 3: Điện di SDS-PAGE 10%. M: protein chuẩn; HP13, PH16, HP18 là sản phẩm kết hoạt tính urease đặc trưng, tương đối tinh tủa của các chủng tương ứng. khiết, có thể sử dụng làm nguyên liệu gây miễn dịch tạo kháng thể kháng urease. Bằng phương pháp kết tủa phân đoạn dịch nuôi cấy các chủng HP13, HP16 và TÀI LIỆU THAM KHẢO HP18 với ammonium sulfate 50% thu được lượng protein có hoạt tính urease lần lượt 1. Lê Đình Minh Nhân, Võ Thị Chi Mai. Tính đề kháng kháng sinh của Helicobacter pylori là 1,78 mg/ml, 1,95 mg/ml và 1,71 mg/ml. trong bệnh viêm loét DD-TT. Y học Thành phố Kết quả điện di cho thấy sản phẩm thu Hồ Chí Minh. 2006, 10 (1), tr.73-75. được sau kết tủa và thẩm tích tương đối thuần nhất, trong đó, băng đậm nhất có 2. Lê Thị Phú & Nguyễn Thị Cẩm Vi. Xác kích thước khoảng 60,3 kDa. định phân tử lượng và các thông số động học Trên thế giới, đã có một số nghiên cứu của urease từ đậu nành hạt vàng Việt Nam. Tạp chí Phát triển KH & CN. 2007, 10 (5), tr.41-50. về enzym urease của H. pylori và các đặc tính của chúng về phân tử lượng của chuỗi 15
5. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 3. Phùng Đắc Cam, Nguyễn Thái Sơn. 7. Mobley HLT, Island MD & Hausinger RP. Helicobacter pylori và bệnh viêm, loét DD-TT. Molecular biology of microbial ureases. Microbiol Nhà xuất bản Y học. Hà Nội. 2003, tr.7-104. Rev. 1995, 59 (3), pp.451-480. 8. Suzuki H, Nomura S, Masaoka T, Goshima H, 4. Icatlo FC, Kuroki M, Kobayashi C, Yokoyama H, Ikemori Y, Hashi T et al. Affinity Kamata N, Kodama Y, et al. Effect of dietary purification of Helicobacter pylori urease. J Biol anti-Helicobacter pylori-urease immunoglobulin Chem. 1998, 273 (29), pp.18130-18138. Y on Helicobacter pylori infection. Aliment Pharmacol Ther. 2004, 20 (1), pp.185-192. 5. Kusters JG, van Vliet AHM & Kuipers EJ. Pathogenesis of Helicobacter pylori infection. 9. Turbett GR, Høj PB, Horne R & Mee BJ. Clin Microbiol Rev. 2006, 19 (3), pp.449-490. Purification and characterization of the urease 6. Malfertheiner P, Megraud F, O'Morain CA, enzymes of Helicobacter species from humans Atherton J, Axon AT, Bazzoli F et al. Management and animals. Infect Immun. 1992, 60 (12), of Helicobacter pylori infection--the Maastricht pp.5259-5266. IV/Florence Consensus Report. Gut. 2012, 61 (5), pp.646-664. 10. Versalovic J. Helicobacter pylori: pathology and diagnostic strategies. Am J Clin Pathol. 2003, 119, pp.403-412. 16
6. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014 17