Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng của quy trình nhuộm rửa và cố định mẫu bệnh phẩm đến việc hoàn thiện xét nghiệm xếp loại miễn dịch bằng kỹ thuật phân tích tế bào dõng chảy

Nội dung text: Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng của quy trình nhuộm rửa và cố định mẫu bệnh phẩm đến việc hoàn thiện xét nghiệm xếp loại miễn dịch bằng kỹ thuật phân tích tế bào dõng chảy

1. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2016 NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG CỦA QUY TRÌNH NHUỘM RỬA VÀ CỐ ĐỊNH MẪU BỆNH PHẨM ĐẾN VIỆC HOÀN THIỆN XÉT NGHIỆM XẾP LOẠI MIỄN DỊCH BẰNG KỸ THUẬT PHÂN TÍCH TẾ BÀO DÕNG CHẢY Lê Xuân Hải*; Nguyễn Triệu Vân* TÓM TẮT Mục tiêu: tối ưu hóa quy trình nhuộm rửa và cố định mẫu bệnh phẩm làm xét nghiệm xếp loại miễn dịch bằng kỹ thu t phân tích tế bào (TB) dòng chảy. Phương pháp: thử nghiệm các quy trình xếp loại theo kiểu hình miễn dịch của các labo khác nhau, phát hiện các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình xử lý mẫu bệnh phẩm, cải tiến bước xử lý phù hợp. Sau đó hoàn thiện và thử nghiệm quy trình hoàn chỉnh. Kết quả: đã tìm ra các bước cần cải tiến quy trình xử lý mẫu bệnh phẩm để cải thiện chất lượng xét nghiệm như: phá hồng cầu trước khi ủ kháng thể; rửa bỏ kháng thể thừa trước khi phân tích; sử d ng dung dịch cố định và bảo quản TB. Kết luận: để tăng cường chất lượng xét nghiệm xếp loại miễn dịch bằng phương pháp TB dòng chảy cần áp d ng một số thay đổi trong quy trình nhuộm rửa, cố định và bảo quản mẫu. * Từ khóa: Bệnh bạch cầu; Xếp loại kiểu hình miễn dịch; Đếm tế bào dòng chảy. Study on Affecting Factors of Staining, Washing and Fixing of Blood Samples to Complete Immmunophenotyping by Flow Cytometry Technic Summary Objectives: To optimize the process of staining, washing and fixing of samples that are used in immunophenotyping by flow cytometry. Methods: To perform the procedure of immunophenotyping in various samples to identify factors affecting the procedure of handling samples and the completed procedure is developed and tested afterward. Results: some improvements in the procedure help enhance the test quality including lysing erythrocytes before incubating, washing off excess antibodies before testing, fixing and preserving procedure. Conclusion: It is needed to apply some improvement in staining, washing, fixing and preserving sample procedure for ensuring a good sample quality of immunophenotyping. * Key words: Leukemia; Immunophenotyping; Flow cytometry. ĐẶT VẤN ĐỀ gặp trong chuyên khoa huyết học. TB ung thư có thể phát triển từ các TB gốc tạo Bệnh bạch cầu cấp (BCC) (Lơ-xê-mi máu chưa biệt hóa hoặc các TB đã biệt cấp) là một bệnh ung thư máu thường hóa thành dòng tủy hoặc dòng lympho. * Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương Người phản hồi (Corresponding): Lê Xuân Hai (hailexuan@yahoo.com) Ngày nhận bài: 20/12/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 16/03/2016 Ngày bài báo được đăng: 23/03/2016 84
2. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2016 Việc xác định chính xác dòng TB, giai 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. đoạn phát triển của TB có giá trị trong chẩn * Thiết lập quy tr nh xếp loại miễn dịch đoán, theo dõi, tiên lượng, xếp loại và lựa sơ bộ cho bệnh BCC: chọn phác đồ đi u trị phù hợp. Trước năm 1976, việc chẩn đoán và xếp loại bệnh Dựa trên tài liệu của các nhóm nghiên BCC hoàn toàn dựa vào hình thái học và cứu khác nhau v xếp loại miễn dịch trong hóa học TB theo tiêu chuẩn của FAB. Cuối bệnh BCC và dựa trên các panel xếp loại th p kỷ 1990, WHO đã công nh n dấu ấn BCC tham khảo từ các Hội nghị Quốc tế, miễn dịch TB là một tiêu chuẩn chẩn đoán đồng nghiệp trong và ngoài nước, chúng tôi bắt buộc, h trợ xếp loại chính xác các tiến hành xây dựng quy trình xét nghiệm bệnh lý tăng sinh ác tính có liên quan đến xếp loại miễn dịch sơ bộ. TB tạo máu. Ngày nay, trên thế giới, việc nh n biết các dấu ấn miễn dịch TB bằng kỹ * Áp dụng sơ bộ quy tr nh xếp loại miễn thu t TB dòng chảy đã trở thành xét dịch trên xét nghiệm thực tế: nghiệm thường quy nhằm h trợ xác định Dựa trên quy trình xét nghiệm đã thiết chính xác dòng TB ác tính và xếp loại dưới l p, tiến hành áp d ng trên thực tế. Tổng nhóm của bệnh, góp phần định hướng đi u kết các mặt ưu điểm và hạn chế của kết trị và tiên lượng bệnh trước đi u trị. Việc áp quả thu được. d ng kỹ thu t này ở Việt Nam đã được tiến hành một vài năm, tuy nhiên đây là một kỹ * Hoàn thiện quy tr nh xét nghiệm xếp thu t xét nghiệm có độ đặc hiệu và đòi hỏi loại miễn dịch: độ chính xác cao, dễ dẫn tới dương tính giả Dựa trên kết quả thu được sau khi áp hoặc âm tính giả nếu các thao tác không d ng, tiến hành một số đi u chỉnh trong phù hợp. Vì v y, một khía cạnh quan trọng quy trình, có so sánh trước và sau khi của kỹ thu t TB dòng chảy là tìm ra một thay đổi để đưa ra nh n định: quy trình xét nghiệm ổn định nhất, phù hợp nhất đối với đi u kiện c thể của m i phòng - So sánh giữa ly giải hồng cầu trước xét nghiệm. Chúng tôi thực hiện nghiên khi ủ kháng thể với ly giải hồng cầu sau cứu này với m c tiêu: Phát hiện một số yếu khi ủ kháng thể. tố ảnh hưởng của quy tr nh nhuộm, r a và - Rửa mẫu so với không rửa mẫu sau cố định mẫu bệnh phẩm nhằm cải tiến và khi ủ với kháng thể. hoàn thiện xét nghiệm xếp loại theo kiểu h nh miễn dịch BCC bằng phương pháp - So sánh giữa sử d ng dung dịch cố phân tích TB dòng chảy. định TB để bảo quản TB với không sử d ng dung dịch bảo quản TB. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU * Thu thập kết quả, so sánh và đánh giá 1. Đối tƣ ng nghiên cứu. các kết quả thu được: Các quy trình xử lý bệnh phẩm làm xét - Thu th p kết quả có được khi xếp loại nghiệm xếp loại miễn dịch đã công bố trên miễn dịch theo quy trình ban đầu và quy thế giới. trình có sửa đổi. 85
3. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2016 - Đánh giá, so sánh kết quả khi thực - Ly tâm ở tốc độ 500 g/5 phút để thu hiện quy trình ban đầu với kết quả khi cặn và loại bỏ dịch nổi chứa các kháng thực hiện với quy trình có thay đổi ở một thể thừa. bước nhất định. Với các dữ kiện như trên, chúng tôi xây - Thống nhất áp d ng một số thay đổi dựng quy trình sơ bộ dùng cho xử lý mẫu có hiệu quả để có một quy trình tối ưu và xét nghiệm xếp loại kiểu hình miễn dịch nhất. như sau: * Vật liệu nghiên cứu: Bước 1: chuẩn bị bệnh phẩm (tủy xương hoặc máu toàn phần), kháng thể - Bệnh phẩm nghiên cứu: 10 mẫu máu pha sẵn, dung dịch PBS 1X, dung dịch ngoại vi chống đông EDTA của 10 người lysing, ống xét nghiệm, pipet, đầu côn, khỏe mạnh (m i mẫu 2 ml). máy Vortex. - Hóa chất, sinh phẩm: dung dịch PBS, Bước 2: thêm 10 μl m i kháng thể dung dịch phá hồng cầu NH4Cl, dung dịch tương ứng vào ống nghiệm. formaldehyde 40%, sodium azide dạng Bước 3: hút 100 μl bệnh phẩm vào ống bột, huyết thanh bào thai bê, bộ kháng xét nghiệm, trộn đ u bằng máy Vortex. thể gắn chất màu hu nh quang. Bước 4: ủ h n hợp trên trong đi u kiện - Thực hiện trên máy đếm TB dòng chảy 0 tối, 4 C trong 30 phút. Navious (Hãng Beckmann Coulter). Bước 5: thêm 1 ml dung dịch ly giải hồng cầu vào ống nghiệm. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Bước 6: tiếp t c ủ trong 10 phút. 1. Xây dựng quy trình sơ b cho xét Bước 7: trộn đ u ống nghiệm bằng máy Vortex, đưa ống nghiệm vào máy nghiệm xếp loại miễn dịch BCC. đọc kết quả. Qua tham khảo các quy trình xử lý mẫu và xét nghiệm xếp loại miễn dịch của 2. Áp dụng thử nghiệm quy trình xét tài liệu khác nhau trên thế giới [2, 3, 4, 5], nghiệm xếp loại iểu hình miễn dịch. chúng tôi nh n thấy một số điểm chung Với quy trình xét nghiệm sơ bộ trên, như sau: chúng tôi áp d ng trên hệ thống máy - Mẫu sử d ng xếp loại miễn dịch là Navious-Beckman Coulter với 10 bệnh máu hoặc dịch hút tủy xương chống đông phẩm của người bình thường, các dấu ấn bằng EDTA. miễn dịch được phối hợp như sau: HLA-DRFITC - CD34PE - CD45ECD - Dung dịch phá hồng cầu NH4Cl. - Dung dịch pha loãng bệnh phẩm PBS. CD13FITC - CD33PE - CD45ECD - Bệnh phẩm cần được ủ với kháng CD3FITC - CD19PE - CD45ECD - CD2PC5 thể trong đi u kiện tối, nhiệt độ 40C trong CD15FITC - CD117PE - CD45ECD 30 phút để đảm bảo gắn kết hoàn toàn. CD20FITC - CD22PE - CD45ECD 86
4. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2016 Phân tích kết quả thu được khi nhuộm 3. Hoàn thiện quy trình xếp loại iểu các dấu ấn trên với bệnh phẩm dựa trên hình miễn dịch. quần thể TB đã khẳng định tính chính * Ly giải hồng cầu: xác của kháng nguyên biểu hiện, quần thể dòng hạt dương tính mạnh với CD15, Qua áp d ng sơ bộ quy trình ban đầu, CD13, CD33; quần thể lympho dương chúng tôi nh n thấy việc ly giải hồng cầu ở tính với CD2, CD3, CD19, HLA-DR, CD20, cuối quy trình không đảm bảo chất lượng CD22; quần thể mono dương tính với xét nghiệm. Với cách ly giải hồng cầu này, HLA-DR, CD33; các dấu ấn đặc trưng của các ống mẫu tồn dư nhi u cặn xơ, hạt mỡ, m i dòng thì âm tính trên các dòng còn cửa sổ phân tích lẫn nhi u quần thể rác lại (ví d : CD19 âm tính trên dòng hạt, hoặc hồng cầu chưa tan hoàn toàn lẫn vào CD15 âm tính trên dòng lympho). Kết quả bước đầu như sau: TB có nhân, dễ dẫn đến sai lệch kết quả. Dương tính giả: 3/10 mẫu (30%); âm Một số phòng xét nghiệm trên thế giới áp tính giả: 0 mẫu (0%). d ng phương pháp ly giải hồng cầu, thu Quy trình xét nghiệm trên đã cơ bản cặn bạch cầu trước khi ủ kháng thể. đảm bảo khả năng gắn các kháng thể lên Phương pháp này có thể giúp tránh được b mặt TB với tỷ lệ âm tính giả 0%. Tuy ảnh hưởng của hóa chất ly giải hồng cầu nhiên, tỷ lệ dương tính giả của các dấu đối với kháng thể sau ủ. Chúng tôi cải tiến ấn khá cao, tới 30%, do kháng thể thừa quy trình trên bằng cách chuyển bước ly bám không đặc hiệu trên b mặt TB. Bên giải hồng cầu vào trước khi thu được cặn cạnh đó, còn một số vấn đ liên quan đến bạch cầu để ủ với kháng thể. xử lý mẫu như hiện tượng cặn xơ, hạt mỡ, hồng cầu tồn đọng gây tắc kim và So sánh hiệu quả của quy trình này với gây nhiễu trong quá trình phân tích. quy trình nêu trước đó, kết quả như sau: Bảng 1: So sánh kết quả giữa 2 quy trình ly giải hồng cầu trước và sau ủ. Ly giải hồng cầu sau hi ủ Ly giải hồng cầu trƣớc hi ủ (n = 10) (n = 10) Hạt mỡ trong ống xét nghiệm 10/10 (100%) 0/10 (0%) Cặn, xơ trong ống xét nghiệm 8/10 (80%) 0/10 (0%) Quần thể mảnh vỡ hồng cầu, cặn bẩn Nhi u Ít phân tích trên máy Hiện tượng tắc kim khi chạy máy 1/10 (10%) 0/10 (0%) Việc phá hồng cầu trước khi ủ bệnh phẩm với kháng thể giúp loại bỏ được cặn bẩn, hạt mỡ trong ống xét nghiệm. Đi u này cải thiện chất lượng bệnh phẩm khi phân tích trên máy, không bị lẫn các mảnh hồng cầu tồn dư hoặc rác với TB có nhân. Ngoài ra, việc phá hồng cầu trước khi ủ cũng cải thiện hiện tượng tắc kim khi chạy máy. 87
5. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2016 * R a bệnh phẩm sau ủ kháng thể: Bước 2: ủ bệnh phẩm với dung dịch ly Một nguyên nhân khác gây nên hiện giải theo tỷ lệ 1/15 trong 10 phút. tượng dương tính giả khi phân tích TB Bước 3: ly tâm 500 g/5 phút, bỏ dịch dòng chảy là do thừa kháng thể trong quá nổi, thu cặn bạch cầu. trình ủ. Khi lượng kháng thể thừa so với Bước 4: tái huy n dịch cặn bằng 2 ml số TB đưa vào, chúng có thể bám không dung dịch PBS 1X. đặc hiệu lên TB với ái lực thấp và cho tín Bước 5: ly tâm 500 g/5 phút, bỏ dịch nổi, hiệu dương tính đối với cảm biến của thu cặn bạch cầu. máy đếm, gây sai lệch kết quả. Để giải - Kỹ thu t ủ kháng thể xếp loại kiểu quyết vấn đ này, chúng tôi bổ sung hình miễn dịch: bước rửa bệnh phẩm sau khi ủ bằng Bước 1: tái huy n dịch cặn bằng dung cách: thêm 2 ml PBS vào h n hợp sau ủ, dịch PBS 1X, pha loãng đảm bảo nồng độ ly tâm 500 g/5 phút, hút dịch nổi và tái 106 bạch cầu/μl dung dịch (theo số đếm huy n dịch lại bằng 1 ml PBS. bạch cầu). Bảng 2: So sánh kết quả giữa 2 quy Bước 2: thêm 10 μl m i kháng thể trình có rửa và không rửa kháng thể. tương ứng vào ống nghiệm. Kh ng rửa Có rửa Bước 3: hút 100 μl dung dịch bạch cầu háng thể háng thể đã chuẩn bị vào ống xét nghiệm, trộn đ u Tỷ lệ dương tính giả 4/10 (40%*) 0/10 (0%) bằng máy Vortex. Mức độ t p trung của Bước 4: ủ h n hợp trên trong đi u kiện Phân tán T p trung tín hiệu phân tích tối, 40C trong 30 phút. (* Các dấu ấn thường có hiện tượng Bước 5: thêm 2 ml PBS vào h n hợp dương tính giả gồm CD22, CD20, CD15). sau ủ, ly tâm 500 g/5 phút, bỏ dịch nổi, thu cặn bạch cầu đã gắn kháng thể. Việc rửa kháng thể thừa sau khi ủ với Bước 6: thêm 1 ml dung dịch PBS 1X bệnh phẩm là bước quan trọng, giúp tối vào ống nghiệm, trộn đ u bằng máy Vortex, ưu hóa kết quả phân tích trên máy đếm đọc kết quả sau khi chạy máy. TB dòng chảy. * Bảo quản bệnh phẩm bằng dung dịch Qua 2 bước cải tiến trên, chúng tôi cố định TB: đưa ra quy trình xử lý mẫu bệnh phẩm xếp loại kiểu hình miễn dịch hoàn thiện Một vấn đ khó khăn là bệnh phẩm chỉ như sau: có thể lưu giữ trong vòng 48 giờ. Sau thời gian này, TB có xu hướng thoái hóa, vón - Kỹ thu t xử lý mẫu trước khi xếp loại t lại và không còn đảm bảo tính chính kiểu hình miễn dịch: xác khi phân tích. Vì v y, chúng tôi áp Bước 1: chuẩn bị bệnh phẩm (tủy xương d ng phương pháp bảo quản bệnh phẩm hoặc máu toàn phần), kháng thể pha sẵn, bằng cách sử d ng dung dịch cố định TB dung dịch PBS 1X, dung dịch ly giải hồng và dung dịch bảo quản TB pha chế theo cầu, ống xét nghiệm, pipet, đầu côn, máy công thức tham khảo từ nhi u tài liệu Vortex. nghiên cứu. 88
6. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2016 Dung dịch cố định TB: thành phần gồm Bước 3: thêm 2 ml dung dịch bảo quản, có formaldehyde 1% pha trong dung dịch ly tâm tốc độ 500 g/5 phút, hút dịch nổi, PBS. giữ lại cặn. Dung dịch bảo quản TB: thành phần Bước 4: thêm 2 ml dung dịch cố định, gồm có sodium azide 1%, huyết thanh ủ trong 15 - 30 phút, 4oC. bào thai bê 10% pha trong dung dịch PBS. Bước 5: ly tâm tốc độ 500 g/5 phút, hút * Kỹ thuật cố định và bảo quản bệnh dịch nổi, giữ lại cặn. phẩm: Bước 6: thêm 2 ml dung dịch bảo quản, Bước 1: chuẩn bị ống nghiệm chứa ly tâm tốc độ 500 g/5 phút, hút dịch nổi, 107 bạch cầu đã xử lý phá hồng cầu, giữ lại cặn. dung dịch cố định, dung dịch bảo quản. Bước 7: tái huy n dịch trong 2 ml dung Bước 2: ly tâm ống có bệnh phẩm, tốc dịch bảo quản, lưu ở nhiệt độ 4oC, đi u độ 500 g/5 phút, hút dịch nổi, giữ lại cặn. kiện tối. Bảng 3: So sánh chất lượng mẫu xếp loại kiểu hình miễn dịch giữa có bảo quản và không bảo quản. Kh ng xử lý bảo quản Có xử lý bảo quản Thời gian lưu giữ tối đa 24 giờ 7 ngày TB phân tán đ u trong Tình trạng TB trong ống chứa mẫu sau 48 giờ Đông vón (10/10) huy n dịch (10/10) M t độ TB Nghèo TB (9/10) Giàu TB (10/10) Phân tách các Không phân tách 48 giờ Phân tách tốt (10/10) quần thể được (4/10) Tín hiệu các Hầu hết âm tính Kết quả âm tính và dương dấu ấn (4/10) tính chính xác (10/10) M t độ TB Nghèo TB Giàu TB Phân tích xếp loại Phân tách các Không phân tách Phân tách tổt kiểu hình miễn dịch 96 giờ quần thể được (10/10) Tín hiệu các Kết quả âm tính và dương Âm tính (9/10) dấu ấn tính chính xác (10/10) M t độ TB Nghèo TB (10/10) Giàu TB (9/10) Phân tách các Không phân tách Phân tách tốt (10/10) 7 ngày quần thể được (10/10) Tín hiệu các Kết quả âm tính và dương Âm tính (10/10) dấu ấn tính chính xác (10/10) Như v y, việc áp d ng quy trình bảo quản TB đã giúp lưu giữ được bệnh phẩm trong thời gian dài mà vẫn đảm bảo chất lượng. Đây là yếu tố hết sức quan trọng vì nhi u trường hợp bệnh nhân cần lưu bệnh phẩm để phân tích vòng 2 với các dấu ấn đặc hiệu, quy trình bảo quản TB đã giúp giải quyết tốt vấn đ trên. 89
7. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2016 * Quy tr nh xếp loại miễn dịch hoàn chỉnh: - Các cải tiến then chốt trong quy trình Qua các bước hoàn thiện trên, chúng gồm: ly giải hồng cầu trước khi ủ kháng tôi thiết l p được quy trình phân loại miễn thể, rửa bỏ kháng thể thừa trước khi phân dịch hoàn chỉnh bao gồm các bước cơ tích trên máy TB dòng chảy, áp d ng dung bản sau: dịch cố định và bảo quản TB. - Bước xử lý mẫu bệnh phẩm bằng ly giải hồng cầu. TÀI LIỆU THAM KHẢO - Bước ủ và rửa kháng thể trước khi 1. Polysciences, Inc. Flow-Fix, 1% Flow Fix phân loại miễn dịch. paraformaldehyde Fixative Kit. Technical data Sheet. 2011, 810, pp.1-4. - Bước cố định và bảo quản bệnh phẩm. 2. Santa Cruz Biotechnology, Inc. Flow KẾT LUẬN cytometry protocol. 2012, pp.1-3. 3. eBioscience. Cell preparation for flow Thông qua các thử nghiệm, hoàn thiện cytometry. Flow Cytometry - Best protocols. và kết quả thu được khi ứng d ng quy 2013, pp.1-3. trình xếp loại kiểu hình miễn dịch, chúng 4. eBioscience. Staining cell surface antigen tôi rút ra kết lu n: for flow cytometry. Flow Cytometry - Best - Đã xây dựng thành công quy trình xử protocols. 2013, pp.1-5 lý mẫu bệnh phẩm dùng cho xét nghiệm 5. eBioscience. RBC lysis. Flow Cytometry - xếp loại kiểu hình miễn dịch. Best protocols. 2013, pp.1-4. 90