Nghiên cứu lựa chọn cặp kháng thể sử dụng cho chế tạo bộ ét nghiệm sắc ký miễn dịch phát hiện nhanh nọc rắn hổ mang Naja Atra

Nội dung text: Nghiên cứu lựa chọn cặp kháng thể sử dụng cho chế tạo bộ ét nghiệm sắc ký miễn dịch phát hiện nhanh nọc rắn hổ mang Naja Atra

1. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2016 NGHIÊN CỨU LỰA CHỌN CẶP KHÁNG THỂ SỬ DỤNG CHO CHẾ TẠO BỘ ÉT NGHIỆM SẮC KÝ MIỄN DỊCH PHÁT HIỆN NHANH NỌC RẮN HỔ MANG Naja atra Nguyễn Ngọc uấn*; nh hanh Hùng** Nguyễn ung Nguyên***; Nguyễn Đặng Dũng* TÓM TẮT Mục tiêu: lựa chọn cặp kháng thể cho chế tạo bộ xét nghiệm sắc ký miễn dịch phát hiện nhanh nọc rắn Hổ mang Naja atra (N. atra). Đối tượng và phương pháp: từ 3 nguồn kháng thể đặc hiệu kháng nguyên nọc rắn Hổ mang N. atra, tiến hành đánh giá độ đặc hiệu và khả năng phát hiện kháng nguyên khi ghép cặp các kháng thể (bằng kỹ thuật ELISA và phương pháp thử nghiệm trực tiếp trên que nhúng). Kết quả: độ đặc hiệu của từng kháng thể với kháng nguyên nọc rắn N. atra khác nhau; cặp kháng thể đặc hiệu gồm IgG ngựa và IgG thỏ thể hiện khác biệt rõ rệt nhất và khi thử nghiệm trên que nhúng cho tín hiệu màu dương tính rõ nhất, không có hiện tượng dương tính giả. Kết luận: có thể sử dụng cặp kháng thể IgG ngựa và IgG thỏ đặc hiệu với nọc rắn N. atra cho phát triển xét nghiệm sắc ký miễn dịch phát hiện nhanh nọc rắn N. atra. * Từ khóa: Rắn Hổ mang; Naja atra; Sắc ký miễn dịch; Kháng thể. Study in Selecting a Pair of Antibodies for Development of an Immuno-Chromatographic Assay for Naja atra Snake Venom Detection Summary Objectives: To select a pair of antibodies for development of an immuno-chromatographic assay for Naja atra snake venom detection. Materials and methods: Each pair of antibodies (from 3 different antibodies against N. atra venom) was tested (by ELISA, and directly on the testing stick) for their possible combination in development of a rapid immuno-chromatographic assay for N. atra venom detection. Results: There was difference in specificity of the 3 antibodies to N. atra venom antigen. The pair of rabbit and horse IgGs against N .atra venom showed most obvious difference, giving best color signal on testing stick without false positive result. Conclusions: The rabbit and horse IgGs against N. atra venom can be utilized for development of a rapid immuno-chromatographic assay for N. atra venom detection. * Key words: Snake venom; Naja atra; Immunochromatographic assay; Antibody. ĐẶT VẤN ĐỀ giúp chỉ định sử dụng huyết thanh kháng Trong cấp cứu và điều trị nạn nhân rắn nọc rắn đặc hiệu một cách chính xác và độc cắn, việc xác định nhanh loài rắn gây kịp thời. Phương pháp được áp dụng phổ tai nạn rắn độc cắn có ý nghĩa quan trọng, biến nhất hiện nay để xác định nọc rắn độc * Học viện Quân y ** Bộ Khoa học và Công nghệ *** Bệnh viện Bạch Mai Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Ngọc uấn (nguyenngoctuanmd@yhaoo.com) Ngày nhận bài: 29/10/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 17/01/2016 Ngày bài báo được đăng: 22/01/2016 35
2. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2016 là sử dụng kỹ thuật sắc ký miễn dịch dưới nguyên - kháng thể sẽ dịch chuyển trên dạng que thử (hay que nhúng), do tính màng đệm của que thử về phía đầu kia đơn giản và nhanh chóng của kỹ thuật của que thử dưới tác động của lực mao này. Xét nghiệm sắc ký miễn dịch dạng dẫn; tại vị trí vạch phát hiện (test line) trên que nhúng (lateral flow immunoassay - que thử, nơi có kháng thể thứ hai kháng LFIA) phát hiện nọc rắn dựa trên nguyên nọc rắn (còn gọi là kháng thể phát hiện) lý kết hợp đặc hiệu kháng nguyên - kháng được cố định trước đó, phức hợp kháng thể. Cụ thể, khi một đầu que thử được nguyên - kháng thể sẽ bị giữ lại do gắn nhúng vào mẫu thử (hoặc mẫu thử được kết của kháng thể thứ hai với kháng nhỏ lên một vị trí nhất định tại một đầu nguyên nọc rắn (hình 1), dẫn đến các hạt que thử), đánh dấu kháng thể thứ nhất nano vàng nano tập trung (gắn trên kháng kháng nọc rắn bằng hạt nano vàng (còn thể thứ nhất) và tạo nên hình ảnh 1 vạch gọi là kháng thể bắt giữ) sẽ gắn với có màu đặc trưng tại vị trí vạch phát hiện, kháng nguyên nọc rắn tương ứng trong đồng nghĩa với kết quả phản ứng dương mẫu thử (nếu có); phức hợp kháng tính. Hình 1: Cấu tạo và nguyên lý xét nghiệm sắc ký miễn dịch. Cặp kháng thể được lựa chọn để chế tạo bộ xét nghiệm cần phải có hoạt tính kháng thể cao với kháng nguyên nọc rắn cần phát hiện [7]. Ngoài ra, cần lựa chọn cặp kháng thể sao cho có thể giảm thiểu phản ứng gắn cạnh tranh của 2 kháng thể với kháng nguyên nọc rắn. Nghiên cứu này được thực hiện nhằm: Lựa chọn cặp kháng thể tốt nhất trong 3 kháng thể đặc hiệu nọc rắn N. atra (do chúng tôi chế tạo và tinh sạch thành công trước đây) để phát triển bộ xét nghiệm sắc ký miễn dịch dạng que nhúng phát hiện nhanh nọc rắn N. atra. 36
3. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2016 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP Tiến hành hấp phụ các kháng thể phản NGHIÊN CỨU ứng chéo bằng cách sử dụng cột sắc ký 1. Vật liệu nghiên cứu. miễn dịch với kháng nguyên nọc rắn Hổ - Nọc rắn Hổ mang N. atra, Hổ đất, Hổ đất và Hổ chúa. Sau hấp phụ, kiểm tra chúa, Lục xanh, Chàm quạp. hoạt tính kháng thể bằng kỹ thuật ELISA, - Kháng thể IgG kháng nọc rắn Hổ mang kiểm tra độ đặc hiệu bằng kỹ thuật Western N. atra từ ngựa, kháng thể IgG kháng nọc blot (theo phương pháp được mô tả ở trên). rắn Hổ mang N. atra từ thỏ và kháng thể * Thử nghiệm lựa chọn cặp kháng thể IgY kháng nọc rắn Hổ mang N. atra từ bằng kỹ thuật ELIS gián tiếp: trứng gà. - Các kháng thể kháng IgG thỏ, IgG ngựa, Từ 3 kháng thể sau tinh sạch, tiến hành IgY gà đánh dấu HRP (Hãng Thermo); hạt thử nghiệm từng cặp kháng thể bằng kỹ nano vàng 30 nm, OD3 (Hãng Tanbead); thuật ELISA. Kháng thể IgG thỏ, IgG một số hóa chất khác: BSA, sucrose, ngựa và IgY gà được gắn lên bề mặt NaCl...; màng PVDF; cơ chất OPD, ECL giếng ELISA (100 μl, nồng độ 10 μg/ml/24 (Hãng Sigma, Merck). giờ). Kháng nguyên nọc rắn N. atra (ở các - Một số dụng cụ, thiết bị dùng cho nồng độ khác nhau, từ 0,3 - 100 ng/ml) nghiên cứu: khay phản ứng ELISA loại 96 giếng, pipet và đầu côn các loại, ống được bổ sung vào các giếng. Tiếp đó, bổ nghiệm, đĩa petri vô trùng; máy đo mật độ sung 100 μl kháng thể thứ hai (nồng độ quang, máy ly tâm lạnh; bộ dụng cụ điện 5 μg/ml) vào các giếng. Sự có mặt của di, máy CCD chụp ảnh màng lai. kháng nguyên được phát hiện gián tiếp 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. bằng cách bổ sung vào các giếng dung * Kiểm tra độ đặc hiệu của kháng thể dịch cộng hợp kháng thể (kháng IgG thỏ, với kháng nguyên nọc rắn: IgG ngựa hoặc IgY gà) đánh dấu enzym peroxidase, tiếp đó là cơ chất OPD Sử dụng kỹ thuật Western blot: nọc rắn N. atra (100 µg) được điện di SDS- (o-phenylenediamin). Đo mật độ quang PAGE 15% trong điều kiện biến tính (theo học (OD) của các giếng ở bước sóng 450 phương pháp do Laemmli mô tả), sau đó nm. Phản ứng được coi là dương tính khi chuyển qua màng PVDF, ủ với kháng thể OD trung bình ( OD) ở các giếng phản IgG thỏ, IgG ngựa và IgY gà đặc hiệu nọc ứng cao hơn của giếng đối chứng âm rắn. Sau đó, ủ màng PVDF với kháng thể OD đánh dấu enzym peroxidase đặc hiệu lần (0 ng/ml) một giá trị 10 lần độ lệch lượt với IgG thỏ, IgG ngựa và IgY gà, chuẩn (SD) giá trị OD giếng đối chứng cuối cùng ủ với cơ chất ECL trong 3 phút. âm. Cặp kháng thể được lựa chọn là cặp Ghi nhận kết quả phản ứng bằng máy kháng thể có khả năng phát hiện nhiều CCD với đầu dò huỳnh quang, trong thời nhất nồng độ nọc rắn N. atra. gian từ 30 giây đến 2 phút. * Phương pháp hấp phụ miễn dịch: 37
4. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2016 * Thử nghiệm lựa chọn cặp kháng thể trực tiếp trên que nhúng: Hình 2: Thử nghiệm lựa chọn cặp kháng thể trực tiếp trên que thử. Các cặp kháng thể sau khi lựa chọn bằng kỹ thuật ELISA, tiếp tục thử nghiệm khảo sát độ nhạy và độc đặc hiệu phản ứng trực tiếp trên que thử. Lựa chọn một kháng thể gắn hạt nano vàng, một kháng thể khác được cố định tại vạch phát hiện của que thử (1 l dung dịch kháng thể nồng độ 1 mg/ml). Kháng thể được gắn vàng theo quy trình của Beesley J (1989) [5]. Nồng độ kháng nguyên nọc rắn dùng cho thử nghiệm lần lượt là 50 ng/ml và 100 ng/ml. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1. Phản ứng đặc hiệu và phản ứng chéo củ kháng thể với các kháng nguyên nọc rắn. M N. atra N. k. O. h. (100 g) N. atra N. k. O. h. (100 g) M N. atra N. k. O. h. (100 g) kDa kDa M kDa 188 188 188 98 98 98 62 62 62 49 49 49 38 38 38 28 28 28 17 17 17 14 14 14 6 6 6 3 3 1 3 3 2 (M: Thang protein chuẩn; 1: Kháng thể IgG thỏ; 2: Kháng thể IgG ngựa; 3: Kháng thể IgY gà; N.k: Rắn Hổ đất; O.h: Rắn Hổ chúa). Hình 3: Phản ứng đặc hiệu và phản ứng chéo của kháng thể trên Western blot. 38
5. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2016 Kết quả phản ứng Western blot cho thấy, các kháng thể có độ đặc hiệu khác nhau với nọc rắn hổ mang N. atra; kháng thể IgG thỏ phản ứng mạnh với kháng nguyên có trọng lượng phân tử < 6 kDa, kháng thể IgY gà phản ứng mạnh với kháng nguyên có trọng lượng phân tử > 188 kDa và < 6 kDa, trong khi kháng thể IgG ngựa phản ứng với hầu hết các kháng nguyên nọc rắn, đặc biệt mạnh với kháng nguyên có trọng lượng phân tử < 6, 14, 17 kDa và 28 - 49 kDa. Với kháng nguyên nọc rắn Hổ đất (Naja kaouthia), các kháng thể đều có phản ứng chéo mạnh với kháng nguyên có trọng lượng phân tử < 6 kDa. Với kháng nguyên nọc rắn Hổ chúa (Ophiophagus hannah), phản ứng chéo xảy ra mạnh nhất ở kháng thể IgG ngựa và IgY gà với kháng nguyên có trọng lượng phân tử từ 49 - 62 kDa. 2. Ho t tính và độ đặc hiệu củ kháng thể với kháng nguyên nọc rắn Hổ m ng N. atra s u hấp phụ miễn dịch. 0,39 KT ngựa 0,34 KT thỏ 0,29 KT gà kT ngựa thường 0,24 KT thỏ thường 0,19 KT gà thường OD 450 nm 450 OD 0,14 0,09 0,04 2 4 8 16 32 64 128 Blank Độ pha loãng KT x 1000 1 0,39 KT ngựa 0,34 KT thỏ KT gà 0,29 kT ngựa thường 0,24 KT thỏ thường 0,19 KT gà thường OD 450 nm 450 OD 0,14 0,09 0,04 2 4 8 16 32 64 128 Độ pha loãng KT x 1000 2 (1: Hấp phụ với kháng nguyên nọc rắn Hổ đất; 2: Hấp phụ với kháng nguyên nọc rắn Hổ chúa). Biểu đồ 1: N. atra Hoạt tính của kháng thể với nọc rắn sau hấp phụ miễn dịch. Sau khi hấp phụ với kháng nguyên nọc rắn Hổ đất, các kháng thể IgG thỏ, IgG ngựa và IgY gà còn thể hiện hoạt tính rõ khi pha loãng lần lượt là 2.000, 4.000 và 2.000 lần. Sau khi hấp phụ với kháng nguyên nọc rắn Hổ chúa, các giá trị đó lần lượt là 32.000, 64.000 và 32.000. 39
6. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2016 M 1 2 3 1 2 3 kDa kDa M 188 188 98 98 62 62 49 49 38 38 28 28 17 17 14 14 6 6 3 a 3 b (M: Thang protein chuẩn; 1: Kháng thể IgG thỏ; 2: Kháng thể IgY gà; 3: Kháng thể IgG ngựa; a: Hấp phụ với nọc rắn Hổ đất, b: Hấp phụ với nọc rắn Hổ chúa) Hình 4: Phản ứng đặc hiệu của kháng thể sau hấp phụ miễn dịch trên Western blot. Tương tự như kết quả ELISA, kết quả Western blot cho thấy hầu hết các kháng thể đặc hiệu với nọc rắn Hổ mang N. atra đã bị hấp phụ bởi nọc rắn Hổ đất. Trong khi đó, sau khi hấp phụ với nọc rắn Hổ chúa, kháng thể còn lại vẫn phản ứng mạnh với kháng nguyên, đặc biệt là những kháng nguyên có trọng lượng phân tử 188 kDa, 14 và 49 - 62 kDa. 3. Kết quả lự chọn cặp kháng thể bằng phƣơng pháp ELISA. Bảng 1: Kết quả thử nghiệm với kháng nguyên nọc rắn Hổ mang N. atra. OD tb Cặp kháng thể (kháng thể bắt giữ - kháng thể phát hiện)a Kháng nguyên IgY gà IgY gà IgG thỏ IgG thỏ IgG ngựa IgG ngựa (ng/ml) IgG thỏ IgG ngựa IgY gà IgG ngựa IgY gà IgG thỏ 0 0,075 0,079 0,078 0,080 0,077 0,084 0,3 0,084 0,085 0,085 0,089 0,083 0,089 1 0,087 0,125 0,113 0,130b 0,093 0,115 3 0,094 0,163b 0,124 0,182 0,097 0,142b 10 0,128b 0,233 0,183b 0,275 0,125b 0,234 30 0,181 0,306 0,274 0,634 0,230 0,580 100 0,229 0,330 0,306 0,846 0,321 0,826 (a): Thử nghiệm với các kháng thể đã được hấp phụ với nọc rắn Hổ chúa; (b): Ngưỡng phát hiện Sau khi được hấp phụ với nọc rắn Hổ chúa, cặp kháng thể IgG thỏ - IgG ngựa vẫn có khả năng phát hiện hầu hết các nồng độ nọc rắn Hổ mang N. atra được thử nghiệm, ngưỡng phát hiện là 1 ng/ml. Cặp kháng thể IgG ngựa - IgG thỏ và cặp kháng thể IgY gà - IgG ngựa có ngưỡng phát hiện 3 ng/ml. 40
7. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2016 4. Kết quả lự chọn cặp kháng thể trực tiếp trên que nhúng. Hình 5: Kết quả lựa chọn cặp kháng thể trực tiếp trên que nhúng. Kết quả thử nghiệm trên que nhúng cho thấy, cặp kháng thể IgY từ trứng gà, IgG từ thỏ và ngựa không xảy ra hiện tượng gắn không đặc hiệu (dương tính giả); sử dụng kháng thể IgG thỏ gắn hạt nano vàng và kháng thể IgG ngựa tại vạch phát hiện cho tín hiệu (màu) dương tính rõ nhất. BÀN LUẬN ngựa. Sự khác biệt này có ý nghĩa quan trọng khi lựa chọn cặp kháng thể để chế Dựa trên kết quả Western blot, có thể tạo bộ kít phát hiện nhanh nọc rắn: do bộ thấy độ đặc hiệu với kháng nguyên nọc kít dựa trên nguyên lý phản ứng miễn rắn N. atra có khác nhau giữa các kháng dịch kiểu “sandwich” nên các kháng thể thể, sự khác biệt này có thể do khác nhau cần được lựa chọn sao cho không có phản giữa các loài về khả năng đáp ứng tạo ứng gắn cạnh tranh của 2 kháng thể với kháng thể [3]. Khác biệt rõ nhất về độ đặc kháng nguyên nọc cần xác định, hay nói hiệu quan sát thấy giữa các cặp kháng cách khác, 2 kháng thể trong cặp kháng thể trong nghiên cứu này là khác biệt thể được lựa chọn phải kháng lại các giữa kháng thể IgG thỏ và IgY gà với IgG epitop khác nhau trên phân tử nọc rắn. 41
8. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2016 Ngoài ra, kết quả này thấy có khá nhiều với nọc rắn Hổ chúa, không nên hấp phụ kháng thể phản ứng chéo với kháng nguyên với nọc rắn Hổ đất. Vì nếu hấp phụ với nọc rắn Hổ đất và Hổ chúa, hoàn toàn nọc rắn Hổ đất, hoạt tính của kháng thể phù hợp với kết quả thử nghiệm độ đặc sau hấp phụ sẽ giảm mạnh, kháng thể hiệu của kháng thể trên phản ứng ELISA, thu được sẽ không đủ yêu cầu để phát được thực hiện trong những nghiên cứu triển xét nghiệm sắc ký miễn dịch kiểu trước đây của chúng tôi. Lý do xảy ra que nhúng. phản ứng chéo rất có thể do có tương tự Với các kháng thể sau hấp phụ với nọc của một hoặc nhiều thành phần trong nọc rắn Hổ chúa, thử nghiệm trên ELISA cho loài rắn cùng họ, đặc biệt sự giống nhau thấy, phản ứng cho tín hiệu tốt nhất khi giữa nọc rắn Hổ mang N. atra với nọc rắn ghép cặp hai kháng thể IgG từ thỏ và Hổ đất. Để kiểm tra sự giống nhau này, ngựa. Kết quả này phù hợp với nghiên chúng tôi tiếp tục tiến hành phương pháp cứu của Đỗ Khắc Đại và CS, lựa chọn hấp phụ miễn dịch. Khi tiến hành hấp phụ cặp kháng thể IgG thỏ và IgG ngựa để miễn dịch với kháng nguyên nọc rắn Hổ chế tạo bộ kít xét nghiệm ELISA phát hiện đất, do có nhiều thành phần giống nhau nọc của bốn loài rắn độc thường gặp ở trong nọc độc nên hầu hết các kháng thể Việt Nam [2]. đã bị hấp phụ, hoạt tính kháng thể sau Các cặp kháng thể có khả năng phát hấp phụ (kiểm tra bằng kỹ thuật ELISA) hiện tốt nọc rắn trên ELISA tiếp tục được rất thấp. Trong khi đó, sau hấp phụ với thử nghiệm trực tiếp trên que thử, so sánh kháng nguyên nọc rắn Hổ chúa, hoạt tính tín hiệu (màu) tại vạch phát hiện; kết quả kháng thể với nọc rắn Hổ mang N. atra cho thấy, sử dụng kháng thể IgG thỏ gắn vẫn còn khá cao, các kháng thể này đặc vàng và IgG ngựa làm kháng thể phát hiệu với kháng nguyên có trọng lượng hiện cho tín hiệu màu tốt nhất. Kết quả phân tử 188 kDa, 14 và 49 - 62 này có thể là do kháng thể IgG ngựa có kDa, đặc biệt với kháng nguyên có trọng hoạt tính cao và kháng lại hầu hết kháng lượng phân tử < 6 kD, các kháng nguyên nguyên nọc rắn Hổ mang N. atra. Việc sử này chính là neurotoxin chủ yếu của nọc dụng kháng thể IgG ngựa ở vạch test rắn Hổ mang N. atra [1]. Kết quả này phù (kháng thể phát hiện) còn có ý nghĩa trên hợp với các nghiên cứu về triệu chứng lâm sàng khi huyết thanh kháng nọc rắn lâm sàng tương tự giữa bệnh nhân bị rắn dùng để điều trị cho bệnh nhân rắn cắn Hổ mang N. atra và rắn Hổ đất cắn [4]; có nguồn gốc từ ngựa [4]. huyết thanh kháng nọc rắn Hổ đất cũng đang được sử dụng để điều trị cho bệnh KẾT LUẬN nhân bị rắn Hổ mang N. atra cắn với hiệu Từ ba nguồn kháng thể kháng nọc rắn quả tương đối tốt. Do đó, để loại một số Hổ mang N. atra, chúng tôi đã lựa chọn phân tử kháng thể phản ứng chéo mà được cặp kháng thể sử dụng chế tạo bộ vẫn giữ được hoạt tính của kháng thể, kít xét nghiệm sắc ký miễn dịch: kháng chỉ nên tiến hành hấp phụ miễn dịch đối thể IgG thỏ sử dụng để gắn hạt nano vàng, 42
9. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2016 kháng thể IgG ngựa được sử dụng làm thực nghiệm. Tạp chí Y - Dược học Quân sự. kháng thể phát hiện ở vạch test. Cặp 2009, số 4, tr.16-23. kháng thể này có khả năng phát hiện 3. Lê Văn Đông. Kháng nguyên. Miễn dịch kháng nguyên nọc rắn Hổ mang N. atra học. Nhà xuất bản Quân đội Nhân dân. 2011, và không cho kết quả phản ứng chéo với tr.76-101. kháng nguyên nọc rắn của một số loài rắn 4. Nguyễn Kim Sơn. Nghiên cứu đặc điểm độc thường gặp khác. lâm sàng và điều trị bệnh nhân bị một số rắn độc trên cạn cắn thuộc họ rắn Hổ (Elapidae) ở miền Bắc Việt Nam. Luận án Tiến sỹ Y học. TÀI LIỆU THAM KHẢO Trường Đại học Y Hà Nội. 2008. 1. Hoàng Ngọc nh, Đặng Tr n Hoàng, 5. Beesley J. Colloidal gold: a new perspective Trương Nam Hải. Nghiên cứu các thành phần for cytochemical marking. Royal Microscopical có hoạt tính sinh học trong nọc rắn Hổ mang Society Handbook. 1989, No 17. Naja naja. Tạp chí Dược liệu. 2006, số 5, 6. Brendan O’Farrell. Evolution from the tr.198-238. current state of the art to the next generation of highly sensitive, quantitative rapid assays. 2. Đỗ Khắc Đại, Đỗ Minh Trung, Nguyễn Lateral Flow Immunoassay Systems. 2013, Đặng Dũng và Lê Văn Đông. Nghiên cứu chế hapter 2.4, pp.89-107. tạo xét nghiệm ELISA phát hiện nọc của bốn 7. Brown MC. Antibodies: key to a robust loài rắn độc thường gặp ở Việt Nam và ứng lateral flow immunoassay. Lateral Flow dụng chẩn đoán rắn độc cắn trên mô hình Immunoassay. 2009, pp.59-74. 43