Nghiên cứu hình thái vi thể khối u biểu mô thanh quản người trên chuột thiếu hụt miễn dịch

Nội dung text: Nghiên cứu hình thái vi thể khối u biểu mô thanh quản người trên chuột thiếu hụt miễn dịch

1. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 NGHIÊN CỨU HÌNH THÁI VI THỂ KHỐI U BIỂU MÔ THANH QUẢN NGƢỜI TRÊN CHUỘT THIẾU HỤT MIỄN DỊCH Nguyễn Văn Ba* TÓM TẮT Ung thư biểu mô thanh quản là bệnh ác tính thường gặp trong ung thư đầu cổ. Với nghiên cứu này, chúng tôi đã ghép tế bào (TB) ung thư thanh quản người dòng Hep-2 vào dưới da đùi để tạo khối ung thư phát triển trên chuột thiếu hụt miễn dịch “nude mice”. Kết quả cho thấy chuột hình thành khối u sau 1 tuần ghép 106 TB ung thư. Hình thái vi thể trên tiêu bản nhuộm HE 4 tuần sau gây u cho thấy mô u có hình ảnh ung thư biểu mô TB vảy thanh quản, chưa có di căn tới các cơ quan. * Từ khóa: Ung thư biểu mô thanh quản Hep-2; Chuột thiếu hụt miễn dịch; Ghép dị loài. MORPHOLOGICAL STUDY OF TUMOR TISSUE IN NUDE MICE BEARING HUMAN LARYNGEAL CARCINOMA SUMMARY Laryngeal carcinoma is a common malignancy in head and neck cancers. In this study, we have implanted human laryngeal carcinoma cells (Hep-2 cells line, supplied by ATCC, the USA) into athymic mice (Bal B/c immudeficient mice, namey Foxn1nu, purchaged from Charles-River Co., the USA) by subcutaneous injection of the cancer cells (with 1 x 106 cells per one mouse) on one thigh of the mice. The results showed that one week after implatation, a tumor developed at the side of injection; histological analysis of the tumor tissue (H&E staining) 4 weeks after implatation showed typical features of laryngeal squamous cell carcinoma, without spread of the implanted cancer cells to other organs (liver, lung, kidney and spleen) of the animal. * Key words: Human laryngeal carcinoma Hep-2; Nude mice; Genograft. ĐẶT VẤN ĐỀ 3.700 người chết năm 2002 [3]. Tại Việt Nam, ung thư thanh quản đứng hàng thứ Ung thư thanh quản là bệnh lý ác tính chín (3%) trong các ung thư toàn thân. thường gặp đứng thứ hai trong ung thư Bệnh thường gặp nhiều ở nam (80%) lứa vùng đầu cổ sau ung thư vòm. Ở Mỹ, tuổi 40 - 60, nhưng xu hướng hiện nay tỷ ung thư thanh quản chiếm 2% với khoảng lệ người trẻ mắc bệnh ngày càng nhiều [2]. * Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Văn Ba (bsnguyenvanba@yahoo.com) Ngày nhận bài: 10/9/2013; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 20/10/2013 Ngày bài báo được đăng: 8/11/2013 98
2. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 Mô hình ghép dị loài ung thư mô tế - Dòng TB ung thư biểu mô thanh quản bào vảy thanh quản có vai trò quan trọng người Hep-2, mua từ công ty ATCC, trong nghiên cứu ung thư. Năm 2009, Hoa Kỳ. Myers và CS [5] tạo thành công khối 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. ung thư loại biểu mô TB vảy thanh quản * Nuôi cấy và ghép TB ung thư vào bằng cách tiêm dòng TB Hep-2 lấy từ chuột: khối u trên người vào lưỡi của chuột Nuôi cấy TB ung thư biểu mô thanh nude và nhận thấy có sự di căn đến hạch quản người trong môi trường EMEM, bạch huyết vùng cổ và di căn phổi. bổ sung 10% FBS và 1% kháng sinh penicillin và streptomycine. Mỗi chai Các tác giả thấy khi tiêm TB vào lưỡi nuôi cấy diện tích 75 cm2 chứa 106 TB. chuột, khối u có kích thước lớn hơn so Nuôi cấy tăng sinh TB và thay môi với tiêm dưới da chuột nude. trường 3 lần/tuần ở điều kiện nhiệt độ 0 Tại Việt Nam, chưa có nhiều nghiên 37 C, CO2 5%. Khi TB phát triển đạt cứu nhiều về mô hình ung thư thanh 75 - 80% diện tích, tiến hành cấy chuyển quản. Do vậy, để đáp ứng yêu cầu phục sang chai mới. Trước ghép, rửa TB 2 lần vụ nghiên cứu tiền lâm sàng ung thư bằng dung dịch PBS 1X, sau đó, tách thanh quản, chúng tôi tiến hành đề tài bằng dung dịch Trypsin-EDTA 1X. Hút nhằm: Đánh giá đặc điểm hình thái vi thể dung dịch, cấy TB ung thư biểu mô thanh mô u trên chuột thiếu hụt miễn dịch mang quản người đã chuẩn bị vào bơm tiêm 7 khối ung thư biểu mô thanh quản người. 1 ml với số lượng 10 /ml. Cố định chuột nude và tiêm 0,1 ml dưới da đùi phải ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP (106 TB/chuột). Quá trình thao tác thực NGHIÊN CỨU hiện trong điều kiện vô trùng tuyệt đối. 1. Đối tƣợng nghiên cứu. * Theo dõi và xác định sự hình thành - 10 chuột nhắt BALB/c thiếu hụt miễn khối ung thư trên chuột: dịch, không có TB lympho T (nude mice, - Đánh giá khối u, theo dõi sự phát Foxn1nu) được nhập khẩu từ Công ty triển tại vị trí tiêm (đùi phải) 2 lần/tuần, Charles-River (Hoa Kỳ). bằng quan sát, sờ nắn và đo kích thước khối u bằng thước chính xác NSK. - Môi trường nuôi cấy và bảo quản - Xác định kích thước khối u: đo khối TB: môi trường EMEM (Eagle's Minimum u theo hai kích thước dài x rộng bằng Essential Medium), Catalog No. 30-2003, thước chính xác NSK (Nhật Bản), 2 lần/ ATCC bổ sung 10% FBS và 1% kháng tuần. Xác định kích thước u theo phương sinh penicillin và streptomycine. pháp của Yamaura và CS [8]. 101
3. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 - Theo dõi trọng lượng chuột 2 lần/tuần, 1. Đặc điểm vi thể khối u đùi trên xác định biến đổi trọng lượng chuột giữa chuột nude. các lần cận kế tiếp. Sau 4 tuần gây u, tiến hành giết chuột, * Xác định hình thái vi thể khối ung lấy tiêu bản làm mô học (nhuộm HE) và thư trên chuột: quan sát trên kính hiển vi quang học, - Sau 4 tuần tiến hành giết chuột, bóc chúng tôi nhận thấy: TB u tạo thành các dải, mật độ TB cao. TB u có hình đa tách khối u và các tạng (gan, phổi, lách, diện, nhân to nhỏ, không đều, tăng kiềm thận), bảo quản trong dung dịch formalin tính, chất màu thô đậm, nhiều hình ảnh 10%, trong 24 - 48 giờ. Tiếp theo, khối u và nhân chia bất thường, tỷ lệ nhân so với các tạng được đúc khối paraffin, cắt lát bào tương lớn. Một số nơi các TB u bị dày 5 m, nhuộm HE (hematoxylin eosin). loạn sừng và tạo thành cầu sừng. Những - Đọc, phân tích hình thái vi thể mô TB ung thư xâm nhập lòng mạch và xâm ung u và tạng dưới kính hiển vi quang lấn phá hủy mô cơ vân. Mô ung thư học. Kỹ thuật tiến hành tại Khoa Giải thường có ổ hoại tử lớn nhỏ. Mô đệm là các dải xơ mảnh bị thâm nhiễm, ít TB phẫu Bệnh lý, Bệnh viện 103. viêm lympho. Đây là hình ảnh ung thư * Xử lý số liệu: sử dụng phần mềm biểu mô TB vảy thanh quản. SPSS15.0. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 2 1 1 Hình 1: Hình ảnh TB ung thư. TB u tạo thành các dải, mật độ TB cao (1). Mô đệm (2) là các dải xơ mảnh bị thâm nhiễm, ít TB viêm lympho (HE,100x). 102
4. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 1 . Hình 2: TB ung thư hình đa diện, nhân to nhỏ không đều, tăng kiềm tính, phần bào tương nhìn không rõ vì TB nằm chồng lên nhau. Nhân chia không điển hình (1), nhân (2), hạt nhân (3), (HE 400x). 2 1 3 Hình 3: Hình ảnh TB ung thư dày đặc xâm lấn phá hủy mô cơ vân. TB u tạo thành các cầu sừng. TB ung thư (1), TB ung thư hoại tử (2), cầu sừng (3) (HE, 400x). 102
5. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 1 2 Hình 4. Hình ảnh TB ung thư (1) và hoại tử u (2) (HE, 100x). 2. Đặc điểm vi thể các cơ quan gan, lách, phổi, thận chuột sau gây u. Kết quả nhuộm HE quan sát trên kính hiển vi mô gan, lách, phổi, thận chuột sau 28 ngày gây u cho thấy không có biến đổi lớn nào về cấu trúc và không có xâm nhập của TB ung thư đến những cơ quan khảo sát. 1 2 Hình 5: Hình ảnh gan chuột 28 ngày sau gây u. Cấu trúc tiểu thùy gan bình thường, 1. Khoảng cửa; 2. Các dải TB gan (HE x 400). 103
6. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 2 1 1 Hình 6: Hình ảnh lách chuột 28 ngày sau gây u. Tủy đỏ (1), tủy trắng (2) (HE,100x). 1 2 Hình 7: Hình ảnh phổi chuột 28 ngày sau gây u. (1) Các phế nang, (2) Tiểu phế quản tận. (HE, 400x). 104
7. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 2 1 3 4 Hình 8: Hình ảnh thận chuột 28 ngày sau gây u. (1) Tiểu cầu thận; (2) Ống lượn gần; (3) Ống lượn xa; (4) Mạch máu (HE, 400x). BÀN LUẬN quả cho thấy chất methanol chiết xuất từ rễ cây Rubia cordifolia Linn, thuộc họ Kết quả nghiên cứu hình thái vi thể Rubiaceace có thể làm giảm tăng sinh khối u thanh quản trên chuột nude có TB ung thư và làm biến đổi hình thái vi những đặc điểm giống như khối u thanh thể của những TB này, gây chết TB ung quản nguyên phát ở người [6]. Điều này thư nhiều hay ít tùy thuộc vào liều và rất có ý nghĩa để nghiên cứu đặc tính thời gian điều trị (24 giờ, 48 giờ). sinh học hình thành và phát triển khối u, Đặc điểm của TB ung thư là tăng từ đó tiếp tục nghiên cứu tìm ra các dược sinh mất kiểm soát của một nhóm hoặc chất cũng như phương pháp trị liệu ung nhiều nhóm TB với những hình ảnh thư mới trong điều trị ung thư thanh quản trên thực nghiệm, tiến tới áp dụng hạt nhân lớn, nhân quái, nhân chia tạo cho điều trị ung thư thanh quản trên thành các khối u và di căn ở giai đoạn người dòng Hep-2 (loại ung thư biểu mô cuối. Vì vậy, trong nghiên cứu này, TB vảy). Trên thế giới, đã có nhiều tác chúng tôi quan sát hình ảnh vi thể các giả nghiên cứu về tác dụng các loại thuốc cơ quan có ái lực với TB ung thư như cũng như phương pháp trị liệu ung thư gan, lách, phổi, thận. thanh quản trên chuột nude. Đáng chú ý là nghiên cứu của Shilipa và CS [7], kết 105
8. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 Hình ảnh vi thể của các cơ quan gan, tương đối đồng đều, khoảng 593,6 ± phổi, lách, thận chuột nude 28 ngày sau 117,2 mm3, cùng ở một vị trí ngay dưới gây u cho thấy cấu trúc các cơ quan này da. Vì vậy, tạo thuận lợi cho quá trình bình thường và không có hình ảnh di căn theo dõi phát triển của khối u hàng ngày của TB ung thư đến gan, phổi, lách, thận, bằng các biện pháp không can thiệp. phù hợp với nghiên cứu của Andreas P. Điều này có ý nghĩa trong nghiên cứu, Kyriazis và CS [4]. Nhóm tác giả này đã bởi vì, để đánh giá khối u phát triển trên tiêm 1 x 106 và 2 x 107 TB dòng Hep-2 động vật rất phức tạp, nếu khối u không dưới da chuột nude mà không thấy có di ở khu vực ngoại vi sẽ rất khó theo dõi. căn của TB ung thư đến gan, phổi, lách, Tuy nhiên, do hạn chế của môi trường tổ thận. Đồng thời, họ cũng tiến hành cấy chức dưới da, thời gian nghiên cứu của ghép 1 x 106 và 2 x 107 TB ung thư vào chúng tôi ngắn (28 ngày), dòng TB ung thư chuột nude, 3/7 chuột xuất hiện di căn. Hep-2 ít di căn hơn so với các phương Vào ngày thứ 28 sau gây u, quan sát pháp đưa trực tiếp vào cơ quan cùng loại thấy khoang phúc mạc đã được lấp đầy [4]. Điều này ít nhiều ảnh hưởng đến với khoảng 5 ml chất lỏng màu vàng nghiên cứu tiền lâm sàng liên quan tới nhạt có chứa một số lượng lớn TB ung trị liệu di căn ung thư. thư. Khối u lớn hay nhỏ hay nốt rắn chiếm toàn bộ ổ bụng, xương chậu và KẾT LUẬN các mô sau phúc mạc. Nhóm TB ung thư thâm nhập rộng rãi vào thành ruột, gan, Hình thái vi thể trên tiêu bản nhuộm thận, tuyến tụy và di căn đến gan là biểu HE cho thấy mô u có hình ảnh ung thư hiện nổi bật. Các TB ung thư cũng được biểu mô TB vảy thanh quản chưa có di tìm thấy ở phổi chuột trong động mạch, căn tới các cơ quan lân cận. phế nang, mao mạch phổi. - Tế bào ung thư tạo thành các dải, Chúng tôi lựa chọn phương pháp tiêm mật độ TB cao xâm nhập mạch, xâm lấn TB ung thư vào tổ chức dưới da chuột cơ vân. TB u có hình đa diện, nhân to với liều trung bình 106 TB/chuột là cách nhỏ không đều, tăng kiềm tính, chất màu làm phổ biến nhất, đã được Hồ Anh Sơn, thô đậm, nhiều hình ảnh nhân chia bất Nguyễn Lĩnh Toàn và CS [1] sử dụng thường, tỷ lệ nhân so với bào tương lớn. trước đó. Bằng phương pháp này, không Một số nơi TB u bị loạn sừng và tạo cần gây mê động vật, khối u có thể phát thành cầu sừng. Mô ung thư thường có ổ triển, dễ dàng can thiệp vào khối u để hoại tử lớn nhỏ. Mô đệm là các dải xơ điều trị và đo kích thước. Đồng thời, kỹ mảnh, bị thâm nhiễm ít TB viêm lympho. thuật này tạo ra khối u với kích thước - Hình ảnh vi thể các cơ quan có ái 106
9. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 lực với TB ung thư: gan, lách, phổi, thận 5. Daisuke Sano and Jeffrey N Myers. chưa thấy có di căn của khối u. Xenograft models of head and neck cancers., Head & Neck Oncology. 2009, 32 (1), pp.1-6. TÀI LIỆU THAM KHẢO 6. Manuela Sacchi, Carl H. Snyderman, Dae Seog Heo et al. Local adoptive 1. Hồ Anh Sơn, Nguyễn Lĩnh Toàn, Bùi immunotherapy of human head and neck Khắc Cường, Nguyễn Văn Ba. Tạo khối ung cancer xenografts in nude mice with thư vú người trên chuột nude. Tạp chí Y- lymphokine-activated killer cells and Dược học Quân sự, KC.10. 2012, tr.1-5. interleukin 2. Cancer Research. 1990, 50, 2. Võ Quốc Trứ, Trần Minh Trường. Đối pp.3113-3118. chiếu lâm sàng và hình ảnh học MRI trong ung thư thanh quản. Tạp chí Y học TP. Hồ 7. PN Shilpa, V Sivaramakrishnan, Chí Minh. 2009, tr.239-242. S Niranjali Devaraj. Induction of apoptosis 3. American Academy of Otolaryngology- by methanolic extract of rubia cordifoliaLinn Head and Neck surgery. Laryngeal Cancer in Hep-2 cell line is mediated by reactive Factsheet. Source: www.entnet.org. oxygen species. Asian Pacific Journal of 4. Andreas P. Kyriazis, Linda DiPersio, Cancer Prevention. 2012, 13, pp.2753-2758. Gabriel J. Michael et al. Growth patterns 8. Yamaura et al. Solitary lung tumors and metastatic behavior of human tumors and their spontaneous metastasis in athymic growing in athymic mice. Cancer Research. nude mice orthotopically immplanted with 1978, 38, pp.3186-3190. human non-small cell lung cancer. Neoplasia. 2000, (2), pp.315-324. 107
10. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 108