Nghiên cứu hiệu quả sử dụng bộ kít elisa định lượng nọc rắn hổ mang naja atra trên lâm sàng

Nội dung text: Nghiên cứu hiệu quả sử dụng bộ kít elisa định lượng nọc rắn hổ mang naja atra trên lâm sàng

1. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2017 NGHIÊN C ỨU HI ỆU QU Ả S Ử D ỤNG BỘ KÍT ELISA ĐỊ NH L ƯỢNG NỌC R ẮN H Ổ MANG Naja atra TRÊN LÂM SÀNG Hà Th ị H ải*; Nguy ễn Ng ọc Tu ấn** Đỗ Kh ắc Đạ i**; Nguy ễn Đặ ng D ũng** TÓM T ẮT Mục tiêu : nghiên c ứu này đánh giá kh ả n ăng đị nh l ượng n ọc r ắn H ổ mang (Naja atra) c ủa b ộ xét nghi ệm ELISA đị nh l ượng n ọc r ắn trong m ẫu b ệnh ph ẩm lâm sàng. Đối t ượng và ph ươ ng pháp : 36 b ệnh nhân (BN) (32 nam, 4 n ữ) được ch ẩn đoán b ị r ắn H ổ mang c ắn, độ tu ổi trung bình 46, th ời gian nh ập vi ện ch ủ y ếu trong 24 gi ờ đầ u sau khi b ị r ắn c ắn. Kết qu ả: n ồng độ n ọc rắn đị nh l ượng được trong huy ết thanh BN dao độ ng t ừ 2,8 - 159,1 ng/ml; 26/36 m ẫu (72%) cho kết qu ả n ồng độ n ọc r ắn < 50 ng/ml; có m ối liên quan gi ữa n ồng độ n ọc r ắn v ới s ố li ều huy ết thanh kháng n ọc r ắn (HTKNR) dùng điều tr ị (R 2 = 0,51; p < 0,001), m ối liên quan này ch ặt ch ẽ hơn khi phân tích nhóm BN nh ập vi ện trong 6 gi ờ đầ u kể t ừ khi b ị r ắn c ắn (R 2 = 0,72; p < 0,001). Kết lu ận: b ộ kít cho phép xác đị nh n ồng độ n ọc r ắn H ổ mang trong m ẫu huy ết thanh BN bị r ắn H ổ mang c ắn. Vi ệc xác đị nh n ồng độ n ọc r ắn đặ c bi ệt có giá tr ị khi th ực hi ện xét nghi ệm ở BN b ị r ắn độ c c ắn nh ập vi ện trong 6 gi ờ đầ u. * T ừ khóa: N ọc r ắn; Naja atra; Định l ượng. Evaluation of the Effect of Quantitative ELISA Test Kit for Naja atra Venom on Clinical Summary Objectives: To evaluate the testing capability of the quantitative ELISA test kit we had developed on clinical samples taken from Naja atra snake-bite patients. Subjects and methods: Involved 36 patients (32 males, 4 females) diagnosed to be bitten by Naja atra snake and hospitalized mainly within 24 hours from the snake-bite. Results: Concentrations of Naja atra venom in 36 serum samples ranged between 2.8 - 159.1 ng/mL; 26/36 (72%) samples had venom concentration below 50 ng/mL; there was a statistically significant relationship between venom concentration and number of antivenom units used for treatment (R 2 = 0.51, p < 0.001) and this relationship was stronger in patients hospitalized within 6 hours from snake-bite (R 2 = 0.72, p < 0.001). Conclusion: The test kit allows the quantitative of N. atra venom concentrations in serum samples of patients diagnosed to be bitten by cobra snake. Determination of snake venom concentration is valuable, especially when performing tests in patients hospitalized within 6 hours from snake-bite... * Keywords: Venom; Naja atra; Quantitative. * Tr ường Đạ i h ọc Y D ược Thái Bình ** Học vi ện Quân y Ng ười ph ản h ồi (Corresponding): Nguy ễn Ng ọc Tu ấn (nguyenngoctuanmd@gmail.com) Ngày nh ận bài: 17/07/2017; Ngày ph ản bi ện đánh giá bài báo: 07/09/2017 Ngày bài báo được đă ng: 18/09/2017 59
2. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2017 ĐẶT V ẤN ĐỀ 2. V ật li ệu nghiên c ứu. Rắn độ c c ắn là m ột c ấp c ứu n ội khoa, - B ộ kít ELISA đị nh l ượng n ọc r ắn H ổ bệnh c ảnh lâm sàng có th ể nh ẹ, ch ỉ là t ổn mang do B ộ môn Mi ễn d ịch, H ọc vi ện th ươ ng mô t ại ch ỗ, nh ưng c ũng có th ể r ất Quân y ch ế t ạo. nặng, đe d ọa các ch ức n ăng s ống, gây - Máy đo m ật độ quang DTX 880 nguy hi ểm đế n tính m ạng c ủa BN, đòi h ỏi (Hãng Beckman Coulter). ph ải có bi ện pháp c ấp c ứu k ịp th ời. Theo - Pippet các lo ại, máy Vortex, t ủ ấm Tổ ch ức Y t ế Th ế gi ới, thu ốc điều tr ị hi ệu - M ột s ố hoá ch ất, v ật t ư tiêu hao khác qu ả nh ất cho BN b ị nhi ễm độ c n ọc r ắn là dùng cho nghiên c ứu đề u đạ t tiêu chu ẩn HTKNR. Hi ện nay, t ại Vi ệt Nam và nhi ều phân tích và do chính hãng s ản xu ất cung nước trên th ế gi ới, HTKNR được s ử d ụng cấp. cho BN r ắn độ c c ắn có ngu ồn g ốc t ừ 3. Ph ươ ng pháp nghiên c ứu. ng ựa; vi ệc s ử d ụng HTKNR có th ể kích - Nghiên c ứu ti ến c ứu, mô t ả c ắt ngang. thích đáp ứng mi ễn d ịch c ủa c ơ th ể BN * Các b ước ti ến hành nghiên c ứu: ch ống l ại protein khác loài, gây ra m ột s ố bệnh lý quá m ẫn, do đó HTKNR c ần - Thu th ập: thông tin BN, m ẫu huy ết được ch ỉ đị nh điều tr ị m ột cách phù h ợp. thanh t ừ BN tr ước khi được điều tr ị nhi ễm độc do r ắn H ổ mang cắn. Một trong nh ững c ăn c ứ có tính khoa h ọc để ch ỉ đị nh li ều s ử d ụng HTKNR cho BN - Th ực hi ện ph ản ứng ELISA v ới b ộ kít là k ết qu ả đị nh l ượng n ọc r ắn trong m ẫu đã xây d ựng [3], đị nh l ượng n ọc r ắn trong huy ết thanh c ủa BN b ị r ắn c ắn. Trong các m ẫu huy ết thanh đã thu th ập được. nghiên c ứu tr ước đây, chúng tôi đã phát - X ử lý s ố li ệu theo các ph ươ ng pháp tri ển m ột b ộ kít xét nghi ệm ELISA đị nh th ống kê y sinh h ọc. lượng n ọc r ắn H ổ mang ( Naja atra) [3]. * Nguyên lý k ỹ thu ật ELISA đị nh l ượng: Chúng tôi ti ếp t ục th ực hi ện nghiên c ứu này nh ằm: Đánh giá hi ệu qu ả s ử d ụng trên lâm sàng c ủa b ộ kít xét nghi ệm trên các m ẫu b ệnh ph ẩm t ừ BN b ị r ắn H ổ mang c ắn. ĐỐI T ƯỢNG, V ẬT LI ỆU VÀ PH ƯƠ NG PHÁP NGHIÊN C ỨU 1. Đối t ượng nghiên c ứu. 36 BN được ch ẩn đoán do r ắn H ổ mang c ắn, nh ập vi ện t ại Trung tâm Ch ống độc, B ệnh vi ện B ạch Mai t ừ tháng 4 đến Hình 1: Nguyên lý c ủa kỹ thu ật ELISA 10 - 2014. sandwich. 60
3. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2017 Ph ươ ng pháp d ựa trên nguyên lý c ủa kỹ thu ật ELISA sandwich, trong đó kháng th ể th ứ nh ất (KT1) là IgG ng ựa đặ c hi ệu với n ọc r ắn H ổ mang, được g ắn c ố đị nh trên b ề m ặt gi ếng ph ản ứng (pha r ắn - solid phase); kháng th ể th ứ hai (KT2) là IgG th ỏ đặ c hi ệu v ới kháng nguyên n ọc rắn Naja atra ; kháng th ể th ứ ba (KT3) là IgG c ừu kháng IgG th ỏ, được g ắn enzym horse-radish peoxidase (HRP). M ật độ quang h ọc (OD) c ủa các gi ếng ELISA t ỷ lệ thu ận v ới l ượng kháng nguyên n ọc r ắn có trong gi ếng. Xây dựng đường chu ẩn Bi ểu đồ 1: Phân b ố tu ổi, gi ới c ủa nhóm (đường cong t ươ ng quan gi ữa giá tr ị OD BN nghiên c ứu (n = 36). và n ồng độ n ọc r ắn chu ẩn) d ựa trên giá tr ị Độ tu ổi trung bình 46, th ấp nh ất 9 tu ổi, OD trung bình c ủa các gi ếng ph ản ứng cao nh ất 89 tu ổi, 3/4 s ố BN có độ tu ổi với n ọc r ắn chu ẩn; t ừ đường chu ẩn đã < 52. Đa s ố BN là nam gi ới (32 BN = xây d ựng, tính toán n ồng độ n ọc r ắn có 89%), ch ỉ có 4 BN n ữ (11%). Kết qu ả này trong m ẫu huy ết thanh d ựa trên giá tr ị OD phù h ợp v ới nghiên c ứu c ủa các tác gi ả: trung bình c ủa gi ếng ph ản ứng v ới m ẫu Nguy ễn Kim S ơn (2008) thông báo 84,2% huy ết thanh. BN b ị r ắn h ổ c ắn là nam gi ới [5], Đỗ Kh ắc Đại (2013) báo cáo 68,8% là nam gi ới KẾT QU Ả NGHIÊN C ỨU VÀ trong t ổng s ố 122 BN b ị r ắn c ắn điều tr ị ạ ệ ệ ợ ẫ ế ả BÀN LU ẬN t i B nh vi n Ch R y [2]. K t qu này cũng phù v ới nghiên c ứu c ủa Dong Zong 1. Đặc điểm đố i t ượng nghiên c ứu . Hung và CS (2003) trên 31 BN: 68% BN bị r ắn H ổ mang c ắn là nam [6]. Bi ểu đồ 2: Phân b ố ngh ề nghi ệp c ủa nhóm BN nghiên c ứu (n = 36). 61
4. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2017 Ph ần l ớn BN b ị r ắn H ổ mang c ắn làm nhân) th ường nh ập vi ện s ớm trong ru ộng (25 BN = 70%). Đây là nh ững nh ững gi ờ đầ u [5]. Th ời gian n ằm vi ện ng ười ph ải th ường xuyên ti ếp xúc v ới môi của nhóm BN nghiên c ứu t ừ 3 - 4 ngày, tr ường ho ạt độ ng và sinh s ống c ủa r ắn và ng ắn h ơn đáng k ể so v ới nhóm BN b ị r ắn vào th ời điểm ban đêm khi r ắn đi s ăn m ồi. Cạp nia hay m ột s ố loài r ắn độ c khác c ắn; Ngoài ra, 11% là nh ững ng ười làm ngh ề lý do chính c ủa vi ệc rút ng ắn th ời gian nuôi b ắt r ắn và 6% là h ọc sinh. Có th ể nằm vi ện là nh ững BN này được điều tr ị th ấy, đố i t ượng b ị r ắn c ắn th ường là lao bằng HTKNR đặ c hi ệu (trong khi t ại cùng động chính, n ếu b ị r ắn c ắn thì chính h ọ s ẽ th ời điểm này, HTKNR đặc hi ệu cho các tr ở thành gánh n ặng v ề kinh t ế đố i v ới gia loài r ắn khác không có s ẵn cho điều tr ị) đình h ọ. [5]. Có th ể th ấy, vi ệc s ử d ụng HTKNR k ịp th ời đã giúp h ạn ch ế di ch ứng c ũng nh ư th ời gian n ằm vi ện c ủa BN b ị r ắn độ c c ắn. 2. K ết qu ả định l ượng n ọc r ắn trên các m ẫu b ệnh ph ẩm lâm sàng. Bi ểu đồ 3: Phân b ố th ời gian nh ập vi ện sau khi b ị r ắn c ắn (n = 36). Th ời gian nh ập vi ện ảnh h ưởng r ất l ớn đến vi ệc điều tr ị và ti ến tri ển c ủa BN. Trong nghiên c ứu c ủa chúng tôi, BN ch ủ Bi ểu đồ 4: Phân b ố n ồng độ n ọc r ắn c ủa yếu nh ập vi ện trong 24 gi ờ đầ u, trong đó BN lúc vào vi ện (n = 36). số BN đế n vi ện tr ước 6 gi ờ chi ếm 3/4. Nồng độ n ọc r ắn c ủa BN lúc m ới vào Kết qu ả này phù h ợp v ới nghiên c ứu c ủa vi ện được đị nh l ượng b ằng b ộ xét nghi ệm Dong Zong Hung (2003) [6], Ngô Ng ọc ELISA dao động t ừ 2,8 - 159,1 ng/ml. K ết Quang Minh [4]. R ắn độ c c ắn là m ột trong qu ả c ủa chúng tôi có độ dao độ ng th ấp nh ững tai n ạn có t ỷ l ệ t ử vong cao, các hơn so v ới nghiên c ứu c ủa Dong Zong tri ệu ch ứng t ại ch ỗ và toàn thân xu ất hi ện Hung và CS (2003) định l ượng 27 m ẫu sớm, điều này gi ải thích vì sao BN (n ạn huy ết thanh BN b ị r ắn H ổ mang c ắn có 62
5. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2017 giá tr ị dao độ ng khá l ớn (0 - 1.270 ng/ml) [6]. S ự khác bi ệt này có th ể là do s ố m ẫu trong các nghiên c ứu còn th ấp nên ch ưa đủ để mang tính đạ i di ện, nhi ều tr ường hợp vào vi ện mu ộn nên k ết qu ả đị nh lượng có th ể không t ươ ng x ứng v ới tri ệu ch ứng lâm sàng. Tuy nhiên, v ới n ồng độ nọc r ắn đị nh l ượng được h ầu h ết < 50 ng/ml (26 BN = 72%), k ết qu ả c ủa chúng tôi tươ ng đối phù h ợp v ới nghiên c ứu c ủa Bi ểu đồ 6: T ươ ng quan gi ữa n ồng độ n ọc Andrew Churchman (2010) [7], George E. rắn lúc vào vi ện và s ố li ều huy ết thanh Allen (2012) [8]. điều tr ị c ủa nhóm BN nh ập vi ện trong 6 gi ờ đầ u (n = 15). Trên nhóm BN nh ập vi ện trong 6 gi ờ đầu, m ối liên quan gi ữa hai bi ến (s ố li ều HTKNR và n ồng độ n ọc r ắn lúc vào vi ện) càng ch ặt ch ẽ h ơn (r = 0,81); ph ươ ng trình thi ết l ập được: y = 0,21*x + 5,49 v ới y: s ố li ều HTKNR s ử d ụng (l ọ); x: n ồng độ nọc r ắn trong huy ết thanh lúc nh ập vi ện (ng/ml), ph ươ ng trình này có ý ngh ĩa th ống kê (p < 0,001) và h ệ s ố xác đị nh b ội R2 = 0,72. K ết qu ả này g ợi ý, n ồng độ n ọc rắn trong m ẫu huy ết thanh của BN trong Bi ểu đồ 5: T ươ ng quan gi ữa n ồng độ n ọc nh ững gi ờ đầ u (khi n ọc r ắn còn trong rắn lúc vào vi ện và s ố li ều huy ết thanh huy ết thanh c ủa BN r ắn độ c c ắn ch ưa điều tr ị (n = 27). phân tán hoàn toàn đến các mô đích) ph ản ánh t ươ ng đối chính xác m ức độ ễ độ ọ ắ ủ đ ề Có m ối liên h ệ gi ữa n ồng độ n ọc r ắn nhi m c n c r n c a BN. Trong i u ki ện th ực hành lâm sàng điều tr ị BN trong huy ết thanh đị nh l ượng được khi nhi ễm độ c n ọc r ắn do b ị r ắn c ắn, m ột BN nh ập vi ện và s ố li ều HTKNR (l ọ) trong nh ững khó kh ăn c ủa bác s ỹ lâm (r = 0,76). Ph ươ ng trình mô t ả s ự liên sàng là ch ỉ đị nh khi nào c ần s ử d ụng quan gi ữa hai bi ến trên là: y = 0,20*x + HTKNR, n ếu s ử d ụng, li ều HTKNR là bao 9,59 v ới y: s ố li ều huy ết thanh kháng n ọc nhiêu để có th ể đủ trung hòa n ọc r ắn mà sử d ụng (l ọ); x: n ồng độ n ọc r ắn trong không lãng phí HTKNR do s ử d ụng quá huy ết thanh lúc vào vi ện (ng/ml), ph ươ ng li ều. K ết qu ả nghiên c ứu cho th ấy n ồng độ n ọc r ắn trong huy ết thanh có th ể là trình này có ý ngh ĩa th ống kê (p < 0,001). một tiêu chí khách quan giúp bác s ỹ lâm Hệ s ố xác đị nh b ội R 2 = 0,51 càng kh ẳng sàng ch ỉ đị nh li ều HTKNR phù h ợp. định m ối liên quan gi ữa hai bi ến k ể trên. 63
6. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2017 KẾT LU ẬN 5. Nguy ễn Kim S ơn. Nghiên c ứu đặ c điểm lâm sàng và điều tr ị BN b ị m ột s ố r ắn độ c trên Bộ kít ELISA đị nh l ượng n ọc r ắn H ổ cạn c ắn thu ộc h ọ r ắn h ổ ( Elapidae ) ở mi ền mang ( Naja atra) cho phép xác định n ồng Bắc Vi ệt Nam. Lu ận án Ti ến s ỹ Y h ọc. độ n ọc r ắn N. atra trong m ẫu huy ết thanh Tr ường Đạ i h ọc Y Hà N ội. 2008. BN b ị r ắn H ổ mang c ắn. B ước đầ u cho th ấy, vi ệc xác đị nh n ồng độ n ọc r ắn có giá 6. D.Z. Hung, Ming-Yi Liau, Shoei-Yn Lin tr ị khi th ực hi ện xét nghi ệm ở BN b ị r ắn Shiau. The clinical significance of venom độc c ắn nh ập vi ện trong 6 gi ờ đầ u. detection in patients of cobra snakebite. Toxicon. 2003, 41, pp.409-415 . TÀI LI ỆU THAM KH ẢO 7. Andrew Churchman, Margaret A O’Leary, 1. Lê V ăn Đông và CS. Nghiên c ứu ch ế Nicholas A Buckley et al. Clinical effects tạo b ộ xét nghi ệm ELISA phát hi ện n ọc r ắn of red - bellied black snake ( Pseudechis độc và ứng d ụng lâm sàng ch ẩn đoán r ắn độ c porphyriacus) envenoming and correlation cắn ở Vi ệt Nam. Báo cáo k ết qu ả đề tài. H ọc with venom concentration: Autralian Snakebite vi ện Quân y. B ộ Qu ốc phòng. 2013. Project (ASP-11). Bites and Stings. 2010, 193, 2. Đỗ Kh ắc Đạ i, Nguy ễn Đặ ng D ũng, Lê pp.696-700. Văn Đông. Nghiên c ứu chế t ạo HTKNR c ủa 8. George E. Allen, Simon G.A. Brown, bốn loài r ắn độ c th ường g ặp ở Vi ệt Nam làm Nicholas A. Buckley et al. Clinical effects and ệ ế ạ ệ ễ ị nguyên li u ch t o xét nghi m mi n d ch antivenom dosing in brown Snake ch ẩn đoán r ắn độ c c ắn. T ạp chí Y - D ược h ọc (Pseudonaja spp.) Envenoming - Australian Quân s ự. 2008, 33, tr.108-113. snake bite project (ASP). Brown Snake 3. Hà Th ị H ải, Nguy ễn Ng ọc Tu ấn, Nguy ễn Envenoming and Antivenom dose. 2012, Trung Nguyên, Phùng Th ế H ải, Nguy ễn Đặ ng 7 (12), pp.1-9. Dũng. Nghiên c ứu phát tri ển b ộ kít ELISA định l ượng n ọc r ắn H ổ mang (Naja atra). Tạp 9. World Health Organization. Guidelines chí Y - D ược h ọc Quân s ự. 2015, 2, tr.38-42. for clinical management of snakebites in the 4. Ngô Ng ọc Quang Minh. 69 tr ường h ợp South-East Asia Region. World Health rắn độ c c ắn t ại B ệnh vi ện Nhi đồ ng I. T ạp chí Organization - Regional office for South-East Y h ọc Th ực hành. 2005, 2, tr.55-58. Asia. New Delhi. 2010. 64