Nghiên cứu độc tính cấp và bán trường diễn của dịch chiết xg1 trên thực nghiệm

Nội dung text: Nghiên cứu độc tính cấp và bán trường diễn của dịch chiết xg1 trên thực nghiệm

1. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015 NGHIÊN CỨU ĐỘC TÍNH CẤP VÀ BÁN TRƢỜNG DIỄN CỦA DỊCH CHIẾT XG1 TRÊN THỰC NGHIỆM Nguyễn Thị Minh Hồng*; Phạm Bá Tuyến*; Nguyễn Hoàng Ngân** TÓM TẮT Mục tiêu: đánh giá độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của dịch chiết XG1 trên động vật thưc nghiệm. Phương pháp: đánh giá độc tính cấp theo phương pháp nghiên cứu xác định độc tính cấp của Abraham WB, Tuner A và theo quy định của Bộ Y tế và Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) về nghiên cứu độc tính của thuốc. Đánh giá độc tính bán trường diễn theo phương pháp Abraham WB. Thỏ được uống dịch chiết XG1 hàng ngày liều 10 g/kg/24 giờ và 30 g/kg/24 giờ trong 42 ngày. Kết quả: chưa tìm thấy LD50 trên chuột nhắt trắng theo đường uống với liều tối đa mà chuột có thể uống được (360 g/kg thể trọng/24 giờ). Trên thỏ, XG1 ở các mức liều 10 g/kg/24 giờ và 30 g/kg/24 giờ, uống hàng ngày trong 42 ngày không ảnh hưởng tới sự phát triển trọng lượng thỏ, không làm biến đổi các chỉ số điện tim, huyết học (hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu) và hàm lượng hemoglobin. Các chỉ số đánh giá chức năng gan (hoạt độ AST, ALT), thận (nồng độ ure, creatinin) và mô bệnh học gan, lách, thận thỏ trong giới hạn bình thường. Kết luận: dịch chiết XG1 có tính an toàn cao trên động vật thực nghiệm. * Từ khóa: Dịch chiết XG1; Độc tính cấp; Độc tính bán trường diễn. Research on the Acute and Subchronic Toxicity of XG1 Extract in the Experiment Summary Objectives: Evaluation of acute and subchronic toxicity of XG1 extract on experimented animals. Subjects and methods: Acute toxicity is evaluated according to the research method for determining acute toxicity by Abraham WB, Tuner A and the provisions of Ministry of Health and the World Health Organization (WHO) on the drug toxicity research. The subchronic toxicity is evaluated according to Abraham WB. The rabbit is drunk XG1 extract every day with the dosage of 10 g/kg/24 hours and 30 g/kg/24 hours within 42 days. Results: It has not found LD50 on white house-mouse by oral route with the maximum dosage which the mouse can drink (360 g/kg/24h). On the rabbit, XG1 with levels of dosage of 10 g/kg/24 hours and 30 g/kg/24 hours, is drunk daily in 42 days that does not affect the weight development of rabbit, change ECG indicators, hematological indicators (erythrocyte, leukocyte, and platelet) and the content of hemoglobin in rabbit. Indicators of liver function (degree of activity AST, ALT), kidney function (concentration of urea, creatinine) and liver, spleen and kidney rabbit histopathology are in the normal limit. Conclusion: XG1 extract had a high safety level on experimented animals. * Key words: XG1 extract; Acute toxicity; Subchronic toxicity. * Bệnh viện Y học Cổ truyền Bộ Công an ** Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Thị Minh Hồng (minhhongck2@gmail.com) Ngày nhận bài: 14/07/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 10/09/2015 Ngày bài báo được đăng: 26/11/2015 32
2. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015 ĐẶT VẤN ĐỀ - Tất cả động vật thí nghiệm do Ban Cung cấp Động vật Thí nghiệm, Học viện Viên hoàn cứng XG1 có xuất xứ từ bài Quân y cung cấp, nuôi dưỡng trong điều thuốc cổ phương “Nhân trần ngũ linh thang” kiện phòng thí nghiệm của Trung tâm [3], một bài thuốc nổi tiếng trong sách Nghiên cứu Y Dược học, Học viện Quân Kim quỹ yếu lược, gia thêm các vị thuốc: y. Động vật ăn thức ăn theo tiêu chuẩn Ngũ vị tử, Uất kim, Xuyên quy, Thổ phục thức ăn cho động vật nghiên cứu. Nước linh, Ngũ gia bì có tác dụng bảo vệ tế bào (đun sôi để nguội) uống tự do. Nuôi động gan, lợi tiểu, giảm men gan [1]. Bệnh viện vật nghiên cứu trong chuồng riêng để Y học Cổ truyền Bộ Công an đã nghiên tránh lây chéo có thể xảy ra theo đường cứu sản xuất viên hoàn cứng XG1 trong hô hấp và tiếp xúc. Hàng ngày, theo dõi đề tài cấp Bộ mã số 28/2014/HĐĐTCB để ghi chép diễn biến kết quả thí nghiệm. điều trị bệnh nhân (BN) ơ gan do rượu - Số lượng động vật sử dụng cho nghiên giai đoạn Child Pugh A-B. Để đảm bảo cứu được ghi cụ thể trong phần phương tính an toàn của viên XG1 trước khi áp pháp nghiên cứu. dụng điều trị cho BN, chúng tôi tiến hành * Dụng cụ, thiết bị: thử độc tính cấp và bán trường diễn của chế phẩm XG1. - Máy xét nghiệm sinh hoá tự động Chemix 180 (Hãng Sysmex). CHẤT LIỆU, ĐỐI TƢỢNG VÀ - Máy xét nghiệm huyết học tự động PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU XE2100 (Hãng Sysmex). 1. Đối tƣợng, vật liệu và thiết bị. - Cân phân tích 10-4, model CP224S * Chế phẩm nghiên cứu: (Sartorius, Đức). Viên hoàn cứng XG1 đạt tiêu chuẩn cơ - Tủ sấy (Mỹ). sở, do Khoa Dược và Bào chế Thuốc, - Bộ dụng cụ mổ động vật. Bệnh viện Y học Cổ truyền Bộ Công an - Một số thiết bị, dụng cụ phụ trợ khác. cung cấp. Thành phần viên XG1 như sau: Nhân trần: 15 g; Bạch truật: 15 g; Bạch 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. linh: 16 g; Trư linh: 12 g; Trạch tả: 12 g; * Nghiên cứu độc tính cấp: Quế chi: 6 g; Ngũ vị tử: 10 g; Uất kim: - Dựa theo phương pháp nghiên cứu 12 g; Xuyên quy: 15 g; Thổ phục linh: 20 g; xác định độc tính cấp của Abrham WB, Ngũ gia bì: 15 g. Turner A, theo quy định của Bộ Y tế Việt Hàm lượng viên XG1 0,25 g/viên. XG1 Nam và WHO về nghiên cứu độc tính của được điều chế thành cao đặc trước khi thuốc [4, 6]. cho chuột và thỏ uống. - Tiến hành thí nghiệm trên chuột nhắt * Động vật nghiên cứu: trắng. Chuột nhịn đói 12 giờ, chia làm các - Chuột nhắt trắng dòng Swiss trưởng lô khác nhau, mỗi lô 12 con. Cho từng lô thành, khoẻ mạnh, trọng lượng cơ thể chuột uống dung dich thuốc XG1 với các (TLCT) 20 2 g. mức liều tăng dần để xác định liều thấp - Thỏ nhà, khỏe mạnh, TLCT 2,0 0,2 kg. nhất gây chết 100% số chuột và liều cao 33
3. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015 nhất gây chết 0%. Chuột được nuôi dưỡng - Các chỉ tiêu đánh giá: và theo dõi tình trạng chung trong 7 ngày + Sinh lý - dược lý: theo dõi tình trạng và xác định tỷ lệ chuột chết trong 72 giờ chung, hoạt động, ăn uống, đặc biệt TLCT, của từng lô chuột sau uống thuốc. điện tim. - Tính toán xác định LD50: theo phương + Huyết học: hồng cầu, hemoglobin, pháp cải tiến của Livschitz PZ [5]. bạch cầu, tiểu cầu. * Nghiên cứu độc tính bán trường diễn: + Sinh hóa: SGOT, SGPT, ure, creatinin. Theo phương pháp Abraham, quy định + Mô bệnh học: vào ngày thứ 42, giết của WHO và Bộ Y tế về hiệu lực và an thỏ, lấy gan, lách, thận, quan sát hình ảnh toàn thuốc [2, 6, 7]. đại thể và làm tiêu bản đánh giá hình ảnh - Chia thỏ thành 3 lô, mỗi lô 12 con: mô bệnh học của thỏ thực nghiệm. + Lô chứng: thỏ uống nước muối sinh - Thời điểm xét nghiệm: lấy máu xét lý 4 ml/24 giờ. nghiệm các chỉ số sinh hóa, huyết học, + Lô XG1 L1: thỏ uống cao XG1 tương ghi điện tim tại 3 thời điểm: xuất phát ứng với liều 10 g/kg TLCT/24 giờ (5 ml điểm, sau 3 tuần, sau 6 tuần nghiên cứu. cao 2:1). Thời gian theo dõi: 6 tuần. + Lô XG1 L2: thỏ uống cao XG1 tương * Phương pháp tính toán xử lý kết quả: ứng với liều 30 g/kg TLCT/24 giờ (6 ml Theo phương pháp thống kê sinh y học, cao 5:1) (liều XG1 tính theo g dược liệu khô). sử dụng phần mềm SPSS 16.0. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 1. Kết quả nghiên cứu độc tính cấp của XG1 theo đƣờng uống. Bảng 1: Độc tính cấp của XG1 theo đường uống. Liều sử dụng Số lƣợng động vật chết Số lƣợng động vật STT n (g/kg TLCT) (sau 72 giờ sống sau 72 giờ Lô 1 270,0 12 0 12 Lô 2 280,0 12 0 12 Lô 3 290,0 12 0 12 Lô 4 300,0 12 0 12 Lô 5 310,0 12 0 12 Lô 6 320,0 12 0 12 Lô 7 330,0 12 0 12 Lô 8 340,0 12 0 12 Lô 9 350,0 12 0 12 Lô 10 360,0 12 0 12 Sau khi dùng cao XG1 theo đường uống đến mức liều cao nhất có thể cho chuột (360,0 g/kg thể trọng/24 giờ), không có chuột nào chết trong 72 giờ, cho thấy cao XG1 có độ an toàn cao trên chuột thực nghiệm. 34
4. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015 2. Kết quả nghiên cứu độc tính bán trƣờng diễn của XG1. Bảng 2: Ảnh hưởng của XG1 đến TLCT thỏ (n = 12, X ± SD). TLCT (kg, X ± SD) Thời điểm p Lô chứng (1) Liều 1 (2) Liều 2 (3) Trước uống thuốc (a) 1,92 ± 0,10 1,94 ± 0,05 1,90 ± 0,10 p2-1 > 0,05 Sau 3 tuần (b) 2,23 ± 0,07 2,21 ± 0,05 2,26 ± 0,15 p3-2 > 0,05 Sau 6 tuần (c) 2,50 ± 0,06 2,52 ± 0,10 2,51 ± 0,10 p3-1 > 0,05 p < 0,01 So sánh TLCT thỏ ở 2 lô dùng XG1 với lô chứng sinh học tại các thời điểm thấy thay đổi không có ý nghĩa thống kê với p > 0,05. So sánh giữa các thời điểm sau so với trước thấy TLCT thỏ của 3 lô tăng, thay đổi có ý nghĩa thống kê với p < 0,05. Bảng 3: Ảnh hưởng của XG1 đến điện tim thỏ (n = 12, X SD). Thời điểm XG1 (10 g/kg/24 giờ) XG1 (30 g/kg/24 giờ) Lô chứng (1) p xét nghiệm (2) (3) Tần số tim (CK/phút, X ± SD) Trước thí nghiệm (a) 285,43 ± 17,68 279,09 ± 21,22 282,25 ± 25,79 p2-1 > 0,05 Sau 3 tuần (b) 280,86 ± 14,75 297,70 ± 15,54 287,02 ± 21,71 p3-2 > 0,05 p > 0,05 Sau 6 tuần (c) 292,48 ± 18,45 284,02 ± 18,78 296,23 ± 15,74 3-1 p pb-a > 0,05; pc-b > 0,05; pc-a > 0,05 - Biên độ (mV, X ± SD) Trước thí nghiệm (a) 0,315 ± 0,035 0,325 ± 0,092 0,305 ± 0,094 p2-1 > 0,05 Sau 3 tuần (b) 0,289 ± 0,057 0,300 ± 0,068 0,295 ± 0,086 p3-2 > 0,05 p > 0,05 Sau 6 tuần (c) 0,300 ± 0,035 0,285 ± 0,072 0,315 ± 0,091 3-1 p pb-a > 0,05; pc-b > 0,05; pc-a > 0,05 - Sóng bất thường Không Không Không - Trong từng lô giữa các thời điểm thí nghiệm và giữa các lô ở cùng một thời điểm, tần số và biên độ điện tim thỏ thay đổi không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Không có sóng bất thường trên điện tim của các lô thỏ tại thời điểm nghiên cứu. 35
5. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015 Bảng 4: Ảnh hưởng của XG1 đến chỉ số huyết học của thỏ (n = 12, X SD). Thời điểm Lô ch ứng XG1 XG1 (30 Chỉ tiêu p xét nghiệm (1) (10 g/kg/24 giờ) (2) g/kg/24 giờ) (3) Trước thí nghiệm (a) 5,14 ± 0,71 5,20 ± 1,19 5,02 ± 1,04 Số lượng p2-1 > 0,05 HC thỏ Sau 3 tuần (b) 5,43 ± 0,86 4,92 ± 0,92 5,08 ± 0,88 p3-2 > 0,05 12 (x10 g/l) Sau 6 tuần (c) 4,98 ± 0,49 5,14 ± 0,87 5,20 ± 0,91 p3-1 > 0,05 Trước thí nghiệm (a) 108,75 ± 13,37 107,38 ± 6,02 104,50 ± 6,95 p2-1 > 0,05 HST thỏ Sau 3 tuần (b) 103,38 ± 7,40 106,00 ± 14,76 111,75 ± 5,50 p > 0,05 (g/l) 3-2 Sau 6 tuần (c) 107,50 ± 5,61 110,75 ± 9,57 112,12 ± 5,33 p3-1 > 0,05 Số lượng Trước thí nghiệm (a) 9,47 ± 3,74 9,40 ± 2,87 10,65 ± 2,11 p2-1 > 0,05 BC thỏ Sau 3 tuần (b) 8,94 ± 3,71 9,80 ± 2,39 9,87 ± 3,35 p3-2 > 0,05 (x 109g/l) Sau 6 tuần (c) 9,34 ± 3,77 9,44 ± 2,38 9,46 ± 0,97 p3-1 > 0,05 Số lượng Trước thí nghiệm (a) 353,62 ± 74,65 373,75 ± 50,80 383,88 ± 49,00 p2-1 > 0,05 TC thỏ Sau 3 tuần (b) 333,25 ± 57,16 365,25 ± 55,51 385,12 ± 110,96 p3-2 > 0,05 9 (x 10 g/l) p3-1 > 0,05 Sau 6 tuần (c) 325,25 ± 40,02 382,00 ± 55,49 357,00 ± 86,03 p pc-a > 0,05; pb-a > 0,05; pc-b > 0,05 Trong từng lô giữa các thời điểm thí nghiệm và giữa các lô ở cùng một thời điểm, số lượng HC, BC, TC, HST thay đổi không có ý nghĩa thống kê với p > 0,05. Bảng 5: Ảnh hưởng của XG1 đến chức năng gan, thận của thỏ (n = 12, X SD). XG1 XG1 Thời điểm Lô chứng Chỉ tiêu (10 g/kg/24 giờ) (30 g/kg/24 giờ) p xét nghiệm (1) (2) (3) Trước thí nghiệm (a) 43,41 ± 26,42 46,49 ± 49,37 47,42 ± 13,66 p2-1> 0,05 Hoạt độ AST Sau 3 tuần (b) 41,87 ± 19,85 44,42 ± 28,96 48,11 ± 49,96 p > 0,05 (U/l) 3-2 Sau 6 tuần (c) 48,00 ± 21,79 46,26 ± 13,39 46,20 ± 17,93 p3-1 > 0,05 Trước thí nghiệm (a) 47,14 ± 21,87 48,97 ± 16,45 48,61 ± 39,88 p2-1 > 0,05 Hoạt độ ALT Sau 3 tuần (b) 41,91 ± 21,11 47,39 ± 22,15 50,26 ± 30,37 p3-2 > 0,05 (U/l) p3-1 > 0,05 Sau 6 tuần (c) 50,15 ± 17,97 50,39 ± 7,70 53,39 ± 20,27 Trước thí nghiệm (a) 102,21 ± 17,47 106,60 ± 23,06 103,46 ± 23,11 p2-1 > 0,05 Creatinin máu Sau 3 tuần (b) 101,54 ± 11,65 96,57 ± 16,70 89,71 ± 13,81 p > 0,05 thỏ (mol/l) 3-2 Sau 6 tuần (c) 105,67 ± 13,53 102,72 ± 14,90 94,20 ± 13,92 p3-1 > 0,05 Trước thí nghiệm (a) 3,29 ± 1,01 3,05 ± 1,04 3,56 ± 1,66 p2-1 > 0,05 Ure máu thỏ Sau 3 tuần (b) 3,45 ± 1,49 2,71 ± 0,44 2,90 ± 0,79 p3-2 > 0,05 (mmol/l) Sau 6 tuần (c) 3,32 ± 0,85 3,52 ± 0,99 3,54 ± 1,43 p3-1 > 0,05 p pc-a, pb-a, pc-b > 0,05 36
6. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015 Trong từng lô giữa các thời điểm thí nghiệm và giữa các lô ở cùng một thời điểm, hoạt độ enzym AST, ALT, hàm lượng creatinin máu, hàm lượng ure máu thay đổi không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Như vậy, uống chế phẩm XG1 liên tục trong 6 tuần chưa thấy có ảnh hưởng đến chức năng gan, thận của thỏ thí nghiệm. - Mô bệnh học gan, thận và lách của thỏ thí nghiệm: Quan sát đại thể bằng mắt thường và dưới kính lúp lần thấy: màu sắc, hình thái của gan, lách và thận ở hai lô dùng XG1 vẫn bình thường và không khác so với chứng. a b c d e g h i k Hình 1: Mô bệnh học gan thận và lách của thỏ ở các nhóm nghiên cứu. (Mô bệnh học gan của nhóm chứng (a), nhóm dùng liều 10 g/kg (b), nhóm dùng liều 30 g/kg/24 giờ (c). Mô bệnh học thận của nhóm chứng (d), nhóm dùng liều 10 g/kg/24 giờ (e), nhóm dùng liều 30 g/kg/24 giờ (g). Mô bệnh học lách của nhóm chứng (h), nhóm dùng liều 10 g/kg/24 giờ (i), nhóm dùng liều 30 g /kg/24 giờ (k)) Kết quả nghiên cứu về mô bệnh học gan, lách, thận thỏ cho thấy: cao XG1 dùng đường uống với liều 10 g/kg/24 giờ và liều 30 g/kg/24 giờ liên tục trong 42 ngày không gây tổn thương trên gan, thận, lách của thỏ. 37
7. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015 KẾT LUẬN thuốc y học cổ truyền dân tộc. 1996. QĐ 371/ QĐ-YT. Chưa tìm thấy LD50 trên chuột nhắt trắng 3. Hoàng Bảo Châu. Phương thuốc cổ truyền. theo đường uống. Liều cao nhất chuột có Nhà xuất bản Y học. 1998, tr.161. thể uống là 360 g/kg thể trọng/24 giờ không gây chết động vật thực nghiệm. Khi cho thỏ 4. Đỗ Trung Đàm. Phương pháp xác định độc tính cấp của thuốc. Nhà xuất bản Y học. uống với liều 10 g/kg/24 giờ và 30 g/kg/24 Hà Nội. 1996. giờ liên tục trong 42 ngày, cao XG1 không 5. Nguyễn Xuân Phách và CS. Toán thống làm ảnh hưởng đến sự phát triển trọng kê và tin học ứng dụng trong sinh - y - dược. lượng thỏ, không làm biến đổi điện tim thỏ, Nhà xuất bản Quân đội Nhân dân. 1995, các chỉ số huyết học (hồng cầu, bạch cầu, tr.146-149. tiểu cầu, huyết sắc tố), các chỉ số đánh giá 6. Abrham WB. Techniques of animal and chức năng gan, thận (hoạt độ AST, ALT, clinical toxicology. Med Pub. Chicago. 1978, ure máu, creatin máu), không gây tổn pp.55-68. thương mô bệnh học gan, lách, thận. Như 7. OECD. Drug safety evaluation I: Acute vậy, chế phẩm XG1 an toàn ở các mức and subchronic toxicity assessement. USA liều đã dùng. Academy Press. 2002. 8. WHO. Research guidelines for evaluating TÀI LIỆU THAM KHẢO the safety and efficacy of herbal medicines. 1. Bộ Y tế. Dược học cổ truyền. Nhà xuất ROWP, Manila, Philippines. 1993. bản Y học. 2006, tr.174, 300, 267, 249. 9. WHO. General guidelines for methodologies 2. Bộ Y tế Cộng hòa Xã hội Chủ nghĩa on research and evaluation of traditional Medicine. Việt Nam. Quy định về nghiên cứu dược lý các EDM/TRM, Geneva, Switzerland. 2000. 38