Nghiên cứu định lượng stevioside trong cỏ ngọt (stevia rebaudiana) bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Nội dung text: Nghiên cứu định lượng stevioside trong cỏ ngọt (stevia rebaudiana) bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

1. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014 NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG STEVIOSIDE TRONG CỎ NGỌT (STEVIA REBAUDIANA) BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Vũ Bình Dương*; Chử Văn Mến*; Nguyễn Văn Long* Vũ Tuấn Anh*; Nguyễn Đức Thiện** TÓM TẮT Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp mới và đơn giản để định lượng stevioside trong cỏ ngọt (Stevia rebaudiana, họ Cúc - Asteraceae) được phát triển và thẩm định đầy đủ. Phương pháp này áp dụng vào phân tích hàm lượng stevioside trong các mẫu cỏ ngọt thu mua ở các nguồn khác nhau. Kết quả cho thấy hàm lượng của stevioside trong cỏ ngọt thay đổi nhiều giữa các mẫu (dao động 6,44 - 33,97 mg/g tùy theo nguồn thu hái). * Từ khóa: Cỏ ngọt; Stevioside; HPLC. DETERMINATION OF STEVIOSIDE IN STEVIA REBAUDIANA BY HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY SUMMARY A new and simple high performance liquid chromatography method for the quantitative analysis of stevioside in Stevia (Stevia rebaudiana) was developed and fully validated. The method was applied to analyze stevioside in Stevia. The results showed that the content of stevioside was highly fluctuated among samples collected from markets. * Key words: Stevia; Stevioside; HPLC. ĐẶT VẤN ĐỀ đường huyết [4], kháng khuẩn [5] và hoạt tính thụ thai [6]. Cỏ ngọt (Stevia rebaudiana) là dược liệu Stevioside là hoạt chất chính trong cỏ có nguồn gốc từ Paraguay, được nhập ngọt với hàm lượng cao và độ ngọt mạnh. nội và trồng phổ biến ở Việt Nam [1]. Lá Hiện nay, Học viện Quân y đang bào chế cỏ ngọt chứa một số glycoside loại di- một số chế phẩm có sử dụng nguyên liệu terpen [2], có độ ngọt gấp 300 lần đường từ cỏ ngọt. Hàm lượng hoạt chất bị ảnh mía. Cỏ ngọt có vị ngọt rất đậm, có ích hưởng bởi nhiều yếu tố như nguồn gốc, cho người đái tháo đường và béo phì [1]. thu hái, đất trồng, mùa thu hoạch và cách Dịch chiết cỏ ngọt cho nhiều tác dụng chế biến. Để đảm bảo chất lượng cho các dược lý tốt như điều hòa huyết áp [3], hạ sản phẩm, việc tiêu chuẩn hóa nguyên liệu * Học viện Quân y ** Cục Y tế, Bộ Công an Người phản hồi (Corresponding): Vò B×nh D•¬ng (vbduong2978@gmail.com) Ngày nhận bài: 15/02/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 08/04/2014 Ngày bài báo được đăng: 15/04/2014 13
2. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014 đầu vào rất quan trọng. Với mục đích góp có nồng độ 2,5 mg/ml. Các dung dịch phần tiêu chuẩn hóa nguyên liệu cỏ ngọt chuẩn làm việc được chuẩn bị bằng cách ở Việt Nam, tiến hành xây dựng và thẩm pha loãng dung dịch gốc stevioside đến định phương pháp định lượng stevioside nồng độ thích hợp. trong cỏ ngọt bằng HPLC. Đồng thời, ứng Mẫu thử: cỏ ngọt khô được nghiền tới dụng phương pháp để đánh giá hàm bột mịn, cho qua rây, trộn đều, cân chính lượng của Stevioside trong một số mẫu xác 1,0 gram bột, cho vào bình định mức cỏ ngọt thu mua trên thị trường. 10 ml, thêm hỗn hợp methanol:nước (30:70), lắc đều, bổ sung 30% methanol VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU tới vạch. Cân chính xác khối lượng, chiết siêu âm trong 60 phút ở 30oC, lấy ra, cân 1. Hóa chất và thiết bị. lại và bổ sung hỗn hợp methanol: nước * Hóa chất và nguyên vật liệu: (30:70) tới khối lượng ban đầu, lắc kỹ, lọc Stevioside chuẩn (98%, Sigma Andrich). qua màng 0,45 µm, dịch lọc được dùng Acetonitrile, methanol, nước cất, axít để tiêm mẫu. phosphoric đạt tiêu chuẩn cho sắc ký lỏng hiệu năng cao, các hóa chất khác đạt tiêu KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ chuẩn phân tích. BÀN LUẬN * Thiết bị: Với điều kiện sắc ký và phương pháp Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu, xử lý mẫu đã lựa chọn, sắc ký đồ thu bao gồm bơm LC-20AD, detector SPD-20A UV/Vis, hệ thống tiêm mẫu tự động SIL- được cho các pic tách rõ ràng, nhiễu nền 20A, bộ phận ổn nhiệt CTO-20A (Shimadzu, thấp thể hiện qua sắc ký đồ của mẫu thử Nhật Bản). cỏ ngọt và mẫu chuẩn. Trên sắc ký đồ, mẫu thử có thời gian lưu trùng với thời gian 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. lưu của pic stevioside trong sắc ký đồ của * Điều kiện sắc ký: mẫu chuẩn với thời gian lưu 6,48 phút Cột: cột phân tích pha đảo Optimapak (hình 1). Tại thời gian lưu pic stevioside C (150 x 4,6 mm; 5 μm), Công ty 18 trên sắc đồ mẫu thử và mẫu chuẩn, đã so RStech Corp, Hàn Quốc; bước sóng phát sánh phổ hấp thụ UV thu được của pic. hiện 200 nm; pha động gồm dung dịch axít phosphoric 0,1% trong nước và Kết quả cho thấy phổ mẫu thử và mẫu acetonitrile với chương trình đẳng dòng chuẩn trùng khít lên nhau với hệ số phù 33% B trong 30 phút; tốc độ dòng 1,0 hợp 0,9998. Điều này chứng tỏ: pic thu ml/phút, thể tích tiêm 10 μl. được trên sắc ký đồ của mẫu thử tinh * Chuẩn bị dung dịch chuẩn và thử: khiết và các thành phần khác có trong Mẫu chuẩn: dung dịch chuẩn gốc được mẫu thử không ảnh hưởng đến quá trình chuẩn bị bằng cách hòa tan stevioside phân tích stevioside, qua đó cho phép vào hỗn hợp methanol:nước (50:50) để tiến hành định tính, định lượng. 15
3. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014 Hình 1: Sắc ký đồ của chuẩn stevioside (a) và mẫu cỏ ngọt (b). 1. Lựa chọn bƣớc sóng. Các bước sóng khác nhau được đánh giá tỷ lệ tín hiệu/nhiễu của pÝc chuẩn stevioside và bước sóng tối ưu là bước sóng có tỷ lệ tín hiệu/nhiễu cao nhất. Bảng 1: Tỷ lệ tín hiệu/nhiễu của stevioside tại các bước sóng khác nhau. BƯỚC SÓNG (nm) TÍN HIỆU/NHIỄU 200 175.312,53 210 89.474,10 220 12.780,53 230 2.981,40 240 959,38 250 230,00 260 88,38 270 79,55 2. Tính tƣơng thích của hệ thống sắc ký. Tính tương thích hệ thống sắc ký được khảo sát dựa vào việc phân tích 5 lần một mẫu chuẩn trên máy HPLC với cùng điều kiện đã nêu. Đánh giá dựa vào sai số tương đối và độ lệch chuẩn tương đối của 5 phép thử song song đối với thời gian lưu, diện tích píc. 16
4. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014 Bảng 2: Kết quả đánh giá tính tương thích của hệ thống sắc ký. STEVIOSIDE (250 µg/ml) THỜI GIAN LƯU (phút) DIỆN TÍCH PÍC 1 6,484 1,555,114 2 6,481 1,554,135 3 6,487 1,555,790 4 6,480 1,554,100 5 6,482 1,553,481 X 6,483 1,554,524 SD 0,003 917,851 RSD(%) 0,042 0,059 3. Phƣơng trình đƣờng chuẩn, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ). Hòa tan stevioside trong hỗn hợp methanol:nước (50:50) để được nồng độ 2.500 µg/ml (dung dịch chuẩn mẹ dùng pha dung dịch chuẩn làm việc). Dung dịch chuẩn làm việc được pha loãng tới nồng độ thích hợp để thiết lập đường chuẩn về mối tương quan giữa diện tích pic stevioside với nồng độ. Xây dựng phương trình tuyến tính được dưới dạng y = ax + b, trong đó y là diện tích píc và x là nồng độ stevioside. Đối với giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ), hòa loãng dung dịch chuẩn mẹ với nước cất nồng độ thích hợp và tiêm vào hệ thống HPLC để phân thích. Đánh giá LOD dựa trên pic thấp nhất có thể phát hiện trên sắc đồ có giá trị tỷ lệ tín hiệu/nhiễu bằng 3. Đánh giá LOQ dựa trên nồng độ thấp nhất có thể định lượng được có giá trị tín hiệu/nhiễu bằng 10. l Hình 3: Đường chuẩn của stevioside. 17
5. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014 Bảng 3: Phương trình đường chuẩn, độ tuyến tính, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của stevioside. THAM SỐ GIÁ TRỊ Hệ số góc 5,95 Intercept (giao trục tung) -1,12 Hệ số tuyến tính 0,9998 LOQ (µg/ml) 0,47 LOD (µg/ml) 0,14 Khoảng tuyến tính (µg/ml) 1,0 - 500,0 4. Độ thu hồi. Thực hiện thí nghiệm độ thu hồi để đánh giá mức độ chính xác của phương pháp bằng cách thêm một lượng xác định chuẩn vào mẫu thử đã biết trước hàm lượng. Hỗn hợp được chiết và phân tích ngay. Chuẩn bị chất chuẩn thêm vào ở 3 nồng độ khác nhau, tại mỗi nồng độ, tiến hành lặp lại 5 lần. Bảng 4: Độ thu hồi của stevioside. ĐỘ THU HỒI CHẤT THÊM (µg/ml) PHÁT HIỆN (µg/ml) RSD (%) TRUNG BÌNH (%) 0,0 155,5 - - 5,0 160,3 96,0 3,87 Stevioside 25,0 180,8 101,2 2,67 50,0 205,9 100,8 1,52 5. Độ đúng và độ độ lặp lại. Độ đúng và độ lặp lại trong ngày thực hiện bằng cách phân tích dung dịch mẫu đã biết trước nồng độ 5 lần/ngày. Độ đúng và độ lặp lại giữa các ngày thực hiện bằng cách phân tích dung dịch mẫu đã biết trước nồng độ trong 5 ngày liên tiếp. Bảng 5: Độ đúng và độ lặp lại của stevioside. TRONG NGÀY (n = 5) GIỮA CÁC NGÀY (n = 5) NỒNG ĐỘ Nồng độ phát hiện Nồng độ phát hiện CHẤT BIỂU KIẾN Độ đúng Độ lặp Độ đúng Độ lặp (µg/ml) (µg/ml) (µg/ml (%) (%) (%) (%) Mean ± SD, n = 5 Mean ± SD, n = 5 100,0 100,93 ± 2,65 100,93 2,62 100,55 ± 2,68 100,55 2,67 Stevioside 50,0 50,37 ± 1,23 100,74 2,44 50,94 ± 1,49 101,88 2,92 25,0 24,81 ± 1,16 99,24 4,64 24,73 ± 1,37 98,92 5,54 6. Độ ổn định. Độ ổn định trong thời gian ngắn: đánh giá độ ổn định ở nhiệt độ phòng sau 4 - 24 giờ (tùy thuộc vào khoảng thời gian xử lý phân tích mẫu trong ngày). Pha mẫu chuẩn làm việc có nồng độ 100, 50, 10 µg/ml. Tiến hành định lượng tại các thời điểm 0, 1, 5, 10, 15, 30 ngày. Để xác định độ ổn định của mẫu thử, tiến hành chiết mẫu, bảo quản và phân tích mẫu đó tại thời điểm như trường hợp mẫu chuẩn. 18
6. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014 Bảng 6: Độ ổn định của stevioside tại 25°C. stevioside trong cỏ ngọt, được phát triển DIỆN TÍCH PÍC (mAU/phút) và thẩm định đầy đủ. Phương pháp này T (h) 100 µg/ml 50 µg/ml 10 µg/ml áp dụng vào phân tích hàm lượng stevioside 0 566203 276130 51562 trong cỏ ngọt. Kết quả cho thấy hàm lượng của stevioside trong cỏ ngọt thay đổi phụ 3 565686 275455 51531 thuộc vào nguồn thu hái (6,44 - 33,97 6 565252 276822 51497 mg/g). Từ các kết quả phân tích ban đầu, 9 564883 274169 51467 chúng tôi đặt ra tiêu chuẩn cho hàm lượng 12 563433 275578 51415 stevioside trong cỏ ngọt nguyên liệu không 24 563891 275230 51474 được thấp hơn 20 mg/g. TÀI LIỆU THAM KHẢO Bảng 7: Độ ổn định của stevioside tại 4°C. DIỆN TÍCH PÍC (mAU/phút) 1. Đỗ Huy Bích và CS. Cây thuốc và động NGÀY 100 µg/ml 50 µg/ml 10 µg/ml vật làm thuốc ở Việt Nam. 2004, tập 1, tr. 495- 498. 0 566214 276415 515461 2. Kinghorn. A.D, Soejarto D.D. Sweetening 1 566021 276367 515380 agents of plant origin. Critical Rev Plant Sci. 1986, 4, 5 565952 276143 515283 pp.79-120. 10 566113 276153 515256 3. Melis MSR. Excretion of stevioside in rats. 15 566193 276124 515171 J Nat Prod. 1992, 55, pp.688-690. 30 565855 276006 515066 4. Chu. Q J, Lee. D, TW. Tsao. SW, Wang. X.H & Wong. Y C. S-allylcysteine, a water- 7. Kết quả định lƣợng. soluble garlic derivative, suppresses the growth Tiến hành định lượng mẫu cỏ ngọt theo of a human androgenindependent prostate phương pháp trên, kết quả cho thấy hàm cancer xenograft, CWR22R, under in vivo conditions. lượng stevioside phụ thuộc vào nguồn thu BJU International. 2007, 99, pp.925-932. hái và thời điểm thu hái. Kết quả này phù 5. White J, Kramer J, Campbell RK, hợp với nghiên cứu trước đó về hàm lượng stevioside trong cỏ ngọt. Bernstein R. Oral use of topical preparation containing an extract of Stevia rebaudiana and Bảng 8: Hàm lượng stevioside trong the Chrysanthemum flower in the management cỏ ngọt. of hyperglycemia. Diabetes Care. 1994, 17, HÀM LƯỢNG MẪU SD (n = 3) p.940. (mg/g) 6. Nardi U. Stevia rebaudiana: analisi suun M1 24,22 2,2 dolcificante naturale. Herb Tomorrow. 1996, 6, M2 6,44 0,9 pp.58-64. M3 33,97 2,7 7. Planas MG, Kuc J. Contraceptive properties M4 32,21 3,1 of Stevia rebaudiana. Science. 1968, 162, M5 28,88 3,5 p.1007. M6 26,75 4,2 M7 31,39 2,8 M8 31,31 2,1 M9 31,78 1,5 M10 31,19 1,2 KẾT LUẬN Sắc ký lỏng hiệu năng cao là phương pháp mới và đơn giản để định lượng 19