Nghiên cứu định lượng s-allyl-l-cystein trong tỏi đen lý sơn bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

Nội dung text: Nghiên cứu định lượng s-allyl-l-cystein trong tỏi đen lý sơn bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

1. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2012 NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG S-ALLYL-L-CYSTEIN TRONG TỎI ĐEN LÝ SƠN BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Chử Văn Mến*; Vũ Bình Dương* Trịnh Nam Trung*; Đào Văn Đôn* TÓM TẮT Phương pháp định lượng S-allyl-L-cystein (SAC) trong tỏi đen Lý Sơn bằng phương pháp HPLC đã được xây dựng, bao gồm các điều kiện: cột Optimapak C18 (150 x 4,6 mm; 5 μm); bước sóng phát hiện 210 nm; pha động: H3PO3 0,1%: ACN theo gradient; tốc độ dòng 0,5 ml/phút, thể tích tiêm 10 μl, dectector UV. Kết quả thẩm định cho thấy: phương pháp có độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ chính xác, độ đúng cao, giới hạn định lượng thấp. Hàm lượng SAC trong tỏi đen Lý Sơn thay đổi theo thời gian lên men và đạt cao nhất sau 35 ngày. * Từ khóa: Tỏi đen Lý Sơn; S-allyl-L-cystein; Sắc ký lỏng hiệu năng cao. DETERMINATION OF S-ALLYL-L-CYSTEINE IN LYSON BLACK GARLIC BY HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY SUMMARY A HPLC method for the determination of S-Allyl-L-Cysteine in Lyson black garlic was validated. Using a gradient of acetonitrile and 0.1% H3PO4 as the mobile phase and UV detection at 210 nm, optimapak C18 colunm (150 x 4.6 mm; 5 μm), flow rate: 0.5 ml/min, injection volume: 10 µl. The method was applied to the analysis of SAC in Lyson black garlic. The results showed that the content of SAC in Lyson black garlic was affected by the processing time. The content of SAC in Lyson black garlic increased with the processing time, reached maximum content at 35 day and reduced after this time. * Key words: Lyson black garlic; S-allyl-L-cysteine; HPLC. ĐẶT VẤN ĐỀ được người tiêu dùng quan tâm và sử dụng trong ẩm thực cao cấp tại các nước Tỏi đen là tỏi được lên men tự nhiên Nhật Bản, Hàn Quốc, Mỹ Các nghiên trong điều kiện nhiệt độ, độ ẩm thích hợp. cứu về thành phần hóa học của tỏi đen Sản phẩm sau khi lên men có màu đen, cho thấy: sau khi lên men, các hợp chất không có mùi cay hăng, đặc biệt có vị chứa lưu huỳnh tan trong nước tăng mạnh ngọt, có thể sử dụng ngay được [1]. Nhờ như: S-allyl-L-cystein, alliin, isoalliin, methiin, công dụng đặc biệt, tỏi đen ngày càng cycloalliin [4]. Điều này làm cải thiện * Học viện Quân y Chịu trách nhiệm nội dung khoa học: GS. TS. Nguyễn Liêm PGS. TS. Nguyễn Văn Minh 7
2. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2012 một số hoạt tính sinh học của tỏi đen như khả năng chống oxy hóa, tăng cường miễn KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN dịch, ức chế tế bào ung thư [2, 3, 5]. Trong số các hợp chất chứa lưu huỳnh, S-allyl-L- 1. Xây dựng quy trình định lƣợng. cystein (SAC, hình 1) là hoạt chất được chú * Chuẩn bị mẫu chuẩn và thử: ý nhiều nhất vì có hàm lượng cao [6]. - Mẫu chuẩn: chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc bằng cách hòa tan SAC vào nước đến nồng độ 1 mg/ml. Chuẩn bị dung dịch chuẩn làm việc bằng cách pha loãng dung dịch mẹ SAC đến những nồng độ thích hợp. - Mẫu thử: cân chính xác 30 g mẫu tỏi, Hình 1: Cấu trúc hóa học của S-allyl-L- nghiền nhỏ, cho vào bình nón định mức 100 cystein (SAC). ml, thêm 100 ml nước cất hai lần, chiết siêu âm trong 90 phút ở 40oC, lọc qua màng 0,45 Ở Việt Nam, Học viện Quân y đã nghiên µm, dịch lọc được dùng để tiêm mẫu. cứu lên men tỏi đen từ nguồn tỏi Việt Nam * Khảo sát điều kiện sắc ký: (trong đó có tỏi Lý Sơn, Quảng Ngãi) nhằm tạo sản phẩm mới có giá trị cao, phục vụ Chúng tôi tiến hành khảo sát với các điều chăm sóc sức khỏe cộng đồng. Trong nghiên kiện sắc ký: cột optimapak C18 (150 x 4,6; 5 cứu này, chúng tôi tiến hành: Xây dựng μm); pha động gồm dung dịch axít phương pháp định lượng SAC trong tỏi đen phosphoric 0,1% trong nước và acetonitrile Lý Sơn nhằm đánh giá chất lượng các sản với các điều kiện rửa giải khác nhau để phẩm tỏi đen trong quá trình nghiên cứu. điều kiện sắc ký thích hợp như sau: 0 phút, 3%B; 50 phút, 4%B; 55 phút, 3%B; 60 phút, 3%B; tốc độ dòng 0,5 ml/phút, thể tích tiêm 10 NGUYÊN LIỆU VÀ THIẾT BỊ, PHƢƠNG μl; detector UV bước sóng phát hiện 210 nm. PHÁP NGHIÊN CỨU - Mẫu tỏi đen Lý Sơn được lên men trong thời gian khác nhau, lô sản xuất 122011 (do Trung tâm Nghiên cứu Sản xuất thuốc, Học viện Quân y cung cấp). - Hóa chất: S-allyl-L-cystein chuẩn (Sigma) độ tinh khiết 99,78%. Acetonitril, methanol, nước cất, axít phosphoric đạt tiêu chuẩn cho sắc ký lỏng hiệu năng cao, các hóa chất khác đạt tiêu chuẩn phân tích. - Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Hình 2: Sắc ký đồ của chuẩn SAC (a) và Shimadzu bao gồm bơm LC-20AD, detector mẫu tỏi đen Lý Sơn (b), (1): S-allyl-L-cystein. SPD-20A UV/Vis, hệ thống tiêm mẫu tự động SIL-20A, bộ phận ổn nhiệt CTO-20A Sắc ký đồ thu được cho các pic tách rõ (Shimadzu, Japan). Phân tích thực hiện trên ràng, nhiễu nền thấp, thể hiện qua sắc ký cột C18 (4,6 x 150 mm, 5 µm, Optimapak, RStech đồ của mẫu thử tỏi đen Lý Sơn và chuẩn. Corp, Hàn Quốc). Trên sắc ký đồ, pic mẫu thử có thời gian 8
3. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2012 lưu trùng với thời gian lưu của pic SAC Hệ thống sắc ký tương thích với mẫu trong sắc ký đồ của mẫu chuẩn với thời phân tích, RSD của diện tích pic và thời gian lưu đều nhỏ hơn 1%. gian lưu 13,493 phút. Tại thời gian lưu pic SAC, trên sắc đồ mẫu thử và mẫu chuẩn, * Độ đặc hiệu: chúng tôi so sánh phổ hấp thụ UV (bằng Sử dụng detector PDA để đánh giá tính cách ghi phổ của bước sóng từ 190 - 400 đặc hiệu của phương pháp: tại thời gian lưu nm) thu được của pic. Kết quả cho thấy: của pic trên sắc ký đồ mẫu chuẩn và mẫu thử, xác định phổ UV. Kết quả cho thấy: phổ mẫu thử và mẫu chuẩn trùng khít lên phổ mẫu thử và mẫu chuẩn trùng khít lên nhau với hệ số phù hợp 0,9998. Điều này nhau với hệ số phù hợp 0,9998. Điều này chứng tỏ: pic thu được trên sắc ký đồ của chứng tỏ: pic thu được trên sắc ký đồ của mẫu thử tinh khiết và các thành phần khác có mẫu thử tinh khiết và các thành phần khác trong mẫu thử không ảnh hưởng đến quá có trong mẫu thử không ảnh hưởng đến trình phân tích SAC. quá trình phân tích SAC. Vì vậy, có thể ứng dụng để định tính, định lượng SAC trong tỏi 2. Thẩm định phƣơng pháp định lƣợng. đen. Phương pháp có tính chọn lọc tốt, độ * Tính tương thích của hệ thống sắc ký đặc hiệu cao. (System Suitability): * Khoảng tuyến tính: Đánh giá tính tương thích hệ thống sắc Để khảo sát khoảng tuyến tính của ký bằng cách phân tích 5 lần một mẫu SAC phương pháp, chúng tôi tiến hành pha một chuẩn trên máy HPLC với cùng điều kiện. dãy dung dịch chuẩn có nồng độ 5; 10; 25; Bảng 1: Kết quả đánh giá tính tương 50; 100 µg/ml, sau đó xác định tương quan thích của hệ thống sắc ký. giữa diện tích pic và nồng độ các dung dịch chuẩn. SAC THỜI GIAN LƯU DIỆN TÍCH PIC (100 g/ml) (phút) 1 13,217 996.254,000 2 13,206 993.600,000 3 13,218 996.757,000 4 13,207 996.254,000 5 13,214 994.784,000 x 13,212 995.529,800 SD 0,006 1.307,220 Hình 3: Đồ thị tương quan giữa diện tích pic và nồng độ SAC chuẩn. RSD (%) 0,042 0,131 Trong khoảng nồng độ khảo sát, diện Hệ số bất đối xứng 1,31 tích pic và nồng độ SAC có sự tương quan Số đĩa lý thuyết 2700 tuyến tính chặt chẽ với nhau (R2 = 0,9999). * Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng: Đối với giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ), dung dịch chuẩn mẹ được hòa loãng tới những nồng độ thích hợp với nước cất và tiêm vào hệ thống HPLC để phân tích. Đánh giá LOD dựa trên pic thấp nhất có thể phát hiện trên sắc đồ có giá trị tỷ lệ 9
4. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2012 tín hiệu/nhiễu bằng 3. Đánh giá LOQ dựa trên nồng độ thấp nhất có thể định lượng được có giá trị tín hiệu/nhiễu bằng 10. Kết quả khảo sát cho thấy LOD và LOQ của SAC với phương pháp lần lượt là 28,21 ng/ml và 8,46 ng/ml. * Độ chính xác: Để khảo sát độ chính xác của phương pháp bằng cách thêm lượng xác định chất chuẩn SAC (5,0; 10,0; 25,0 µg/ml) vào mẫu đã biết trước hàm lượng. Chiết và phân tích ngay hỗn hợp. Xác định % tìm lại SAC của các mẫu. Bảng 2: Tỷ lệ tìm lại của SAC trong các mẫu. NỒNG ĐỘ SAC NỒNG ĐỘ SAC PHÁT CHẤT TỶ LỆ TÌM LẠI (%) RSD (%) THÊM VÀO (µg/ml) HIỆN (µg/ml) 0,0 1,91 - - 5,0 6,81 98,06 2,01 SAC 10,0 11,84 99,32 1,87 25,0 26,30 97,64 3,11 Phương pháp có độ chính xác cao với % tìm lại từ 97,64 - 98,06% và RSD từ 1,87 - 3,11%. * Độ đúng và độ lặp lại: Độ đúng và độ lặp lại trong ngày và giữa các ngày thực hiện bằng cách phân tích dung dịch chuẩn 5 lần/ngày và trong 5 ngày liên tiếp. Bảng 3: Độ đúng và độ lặp lại của SAC (n = 5). NỒNG ĐỘ TRONG NGÀY (n = 5) GIỮA CÁC NGÀY (n = 5) BAN ĐẦU (µg/ml) Nồng độ phát Độ đúng Độ lặp Nồng độ phát Độ đúng Độ lặp hiện (µg/ml) (%) (%) hiện (µg/ml) (%) (%) 50 50,45 ± 0,77 100,90 1,52 50,54 ± 1,23 101,08 2,44 25 25,29 ± 0,23 101,16 0,89 24,94 ± 0,28 99,76 1,14 10 10,17 ± 0,13 101,70 1,31 10,21 ± 0,35 102,10 3,43 Phương pháp có độ đúng và độ lặp lại trong ngày cũng như khác ngày đạt yêu cầu. * Độ ổn định: Pha các mẫu chuẩn có nồng độ 100, 50, 10 µg/ml. Định lượng SAC vào những thời điểm 0, 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30 ngày. Để xác định độ ổn định của mẫu thử tiến hành chiết mẫu, bảo quản và phân tích mẫu đó tại những thời điểm như của mẫu chuẩn. Bảng 4: Độ ổn định của SAC. 11
5. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2012 SAC (4 oC) SAC (25 oC) NGÀY 100 µg/ml 50 µg/ml 10 µg/ml 100 µg/ml 50 µg/ml 10 µg/ml 0 100,00 50,00 10,00 100,00 50,00 10,00 1 99,93 49,97 9,99 99,90 49,95 9,96 2 99,92 49,98 9,99 99,43 49,89 9,95 5 99,92 49,96 9,98 99,06 49,65 9,91 10 99,90 49,95 9,93 98,77 49,58 9,89 15 99,57 49,87 9,91 98,52 49,54 9,88 20 99,40 49,84 9,91 98,47 49,49 9,88 25 99,24 49,67 9,88 98,25 49,41 9,87 30 99,18 49,56 9,87 98,02 48,91 9,86 * 0,82 0,88 1,3 1,98 2,18 1,4 (* Tỷ lệ hao hụt cao nhất %) Mẫu phân tích sau thời gian bảo quản, lượng SAC giảm nhiều nhất 2,18% (nồng độ 50 µg/ml ở 25oC). Như vậy, mẫu tương đối ổn định trong điều kiện bảo quản và đủ tiêu chuẩn để tiến hành phân tích, kể cả mẫu chuẩn và mẫu thử. 3. Định lƣợng SAC trong tỏi đen Lý Sơn. Định lượng SAC trong các mẫu tỏi đen Lý Sơn lên men với thời gian khác nhau. Bảng 5: Kết quả định lượng SAC trong các mẫu tỏi đen Lý Sơn (n = 5). THỜI GIAN LÊN MEN STT HÀM LƯỢNG SAC (µg/g) p (ngày) 1 0 (tỏi tươi) 24,22 ± 2,35 2 5 56,97 ± 3,85 pi-1 < 0,05 i = 2, 3, 4, 5, 6 3 10 76,21 ± 4.53 4 20 102,88 ± 6,46 pj-5 < 0,05 5 35 129,75 ± 7,18 j = 1, 2, 3, 4, 6 6 40 99,39 ± 6,24 Hàm lượng SAC trong tỏi tươi thấp hơn so với tỏi sau khi lên men (p < 0,05). Như vậy, sau khi lên men, hàm lượng SAC trong tỏi đen đã cải thiện đáng kể. Hàm lượng SAC tăng theo thời gian lên men và đạt cao nhất ở ngày thứ 35 (129,75 µg/g). KẾT LUẬN ml/phút, thể tích tiêm 10 μl, dectector UV. Kết quả thẩm định cho thấy: phương pháp Đã xây dựng được phương pháp định có độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ chính xác, lượng S-allyl-L-Cysteine trong tỏi đen Lý độ đúng cao, giới hạn định lượng thấp. Kết Sơn bằng HPLC với các điều kiện: cột quả định lượng SAC trong mẫu tỏi đen Lý Sơn theo phương pháp đã xây dựng cho Optimapak C18 (150 x 4,6 mm; 5 μm); bước thấy: hàm lượng SAC thay đổi theo thời sóng phát hiện 210 nm; pha động: H3PO3 0,1%: ACN theo gradient; tốc độ dòng 0,5 gian lên men và đạt cao nhất sau 35 ngày. 12
6. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2012 TÀI LIỆU THAM KHẢO 5. Sato E, Kohno M, Hamano H. Increased 1. Montano A, Casado F. J, De Castro A, anti-oxidative potency of garlic by spontaneous Sánchez A. H, & Rejano L. Vitamin content and short-term fermentation. Plant Foods for Human amino acid composition of pickled garlic Nutrition. 2006, 61, pp.157-160. processed with and without fermentation. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 6. Park S. H, Kim S. H, Kim H. S, Jung Y. K, 2004, 52, pp.7324-7330. Kim Y. R, Lee H. Y. Research of S-allyl-(L)- cysteine content changes in aged garlic. In The 2. Chu Q. J, Lee D.T.W, Tsao S.W, Wang 2010 ASABE annual international meeting. X.H, Wong Y. C. S-allylcysteine, a water-soluble 2010, pp.4506-4512. garlic derivative, suppresses the growth of a human androgenindependent prostate cancer 7. Herrera-Mundo M. N, Silva-Adaya D, xenograft, CWR22R, under in vivo conditions. Maldonado P. D, Galvan-Arzate S, Andres- BJU International. 2007, 99, pp.925-932. Martinez L, Perez-De La Cruz V. S-allylcysteine prevents the rat from 3-nitropropionic acid- 3. Shin J. H, Choi D. J, Lee S. J, Cha J. Y, induced hyperactivity, early markers of oxidative Kim J. G, Sung N. J. Changes of stress and mitochondrial dysfunction. physicochemical components and antioxidant Neuroscience Research. 2006, 56, pp.39-44. activity of garlic during its processing. Journal of Life Science. 2008, 18, pp.1123-1131. 8. Chuah S. C, Moore P. K, & Zhu Y. Z. S- 4. Kodera Y, Suzuki A, Sumioka I, Kanezawa allylcysteine mediates cardioprotection in an A, Taru N, Fujikawa M. Physical, chemical and acute myocardial infarction rat model via a biological properties of S-allylcysteine, an amino hydrogen sulfide-mediated pathway. American acid derived from garlic. Journal of Agricultural Journal of Physiology-Heart and Circulatory and Food Chemistry. 2002, 30, pp.622-632. Physiology. 2007, 293, H2693-H2701. 13
7. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2012 Ngày nhận bài: 7/8/2012 Ngày giao phản biện: 10/10/2012 Ngày giao bản thảo in: 16/11/2012 14