Nghiên cứu định lượng một số hoạt chất anthraquinon và stilben trong đại hoàng bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao

Nội dung text: Nghiên cứu định lượng một số hoạt chất anthraquinon và stilben trong đại hoàng bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao

1. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014 NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG MỘT SỐ HOẠT CHẤT ANTHRAQUINON VÀ STILBEN TRONG ĐẠI HOÀNG BẰNG SẮC Kí LỎNG HIỆU NĂNG CAO Hoàng Văn Lương*; Nguyễn Văn Long*; Chử Văn Mến* Nguyễn Thị Thanh Hương*; Phạm Thị Thanh Hương* TÓM TẮT Nghiên cứu đã tiến hành định lƣợng đƣợc một số hoạt chất anthraquinon và stilben trong Đại hoàng bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). 5 hoạt chất đƣợc định lƣợng gồm: 4 hoạt chất là dẫn xuất anthraquinon: chrysophanol, emodin, emodin-glucoside và sennoside A và 1 hoạt chất nhóm stilben là rhaponticin đƣợc định lƣợng trong nghiên cứu này. Tiến hành phân tách trên cột pha đảo C18 với chƣơng trình gradient sử dụng dung môi A (dung dịch 0,05 M axít phosphoric trong nƣớc) và dung môi B (acetonitrile), bƣớc sóng 280 nm, tốc độ dòng 1,0 ml/phút. Chƣơng trình rửa giải gồm: 0 - 5 phút (20% B); 18 phút (28% B); 25 phút (42% B); 30 phút (100% B) cho kết quả tách tốt. Thẩm định phƣơng pháp cho kết quả độ tuyến tính cao (r > 0,9995) và độ thu hồi trong khoảng 98,0 - 102,6%. Giới hạn định lƣợng trong khoảng 0,05 - 0,28 μg/ml. Phƣơng pháp trên đƣợc áp dụng để phân tích 31 mẫu Đại hoàng gồm nhiều loài khác nhau. Kết quả: hàm lƣợng hoạt chất biến động nhiều trong các mẫu, hàm lƣợng của sennoside, rhaponticin, emodin- glucoside, emodin và chrysophanol tƣơng ứng là: 2,53 ± 4,26; 16,40 ± 29,50; 0,58 ± 0,48; 0,93 ± 0,83 và 3,72 ± 2,97 mg/g. * Từ khóa: Đại hoàng; Sắc ký lỏng hiệu năng cao. STUDY ON THE QUANTITATION OF SOME ANTHRAQUINONE AND STILBENE COMPOUNDS IN RHEI RHIZOMA BY HPLC summary We quantitated some anthraquinone and stilben active compounds in Rhei Rhizoma using high performance liquid chromatography. Five bioactive compounds were quantitated including 4 anthraquinone: chrysophanol, emodin, emodin-glucoside and sennoside A and 1 stilbene compound: rhaponticin. The chromatographic separation was performed on a C18 column by gradient elution with 0.05 M phosphoric acid in water and acetonitrile, the wavelength was set at 280 nm, the flow rate was set at 1 ml/min, gradient condition as followed: 0 - 5 min (20% B); 18 min (28% B); 25 min (42% B); 30 min (100% B) gave the satisfied separation. The methodological validation gave acceptable linearities (r > 0.9995) and recoveries (ranging from 98.0 - 102.6%). The limits of detection (LOD) of these compounds ranged from 0.05 to 0.28 μg/ml. The developed method was applied to the quantitation of 31 samples of different Rhei Rhizoma species. The results showed that the contents of bioactive compounds were fluctuated among samples, the contents of sennoside, rhaponticin, emodin-glucoside, emodin and chrysophanol: 2.53 ± 4.26, 16.40 ± 29.50; 0.58 ± 0.48, 0.93 ± 0.83 and 3.72 ± 2.79 mg/g, respectively. * Key words: Rhei Rhizoma; HPLC. * Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Chử Văn Mến (chuvanmen@gmail.com) Ngày nhận bài: 20/03/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 10/04/2014 Ngày bài báo được đăng: 15/04/2014 7
2. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014 ĐẶT VẤN ĐỀ đông y thƣờng bị nhầm lẫn bởi sự không rõ ràng của nhiều loài trong sử dụng Đại hoàng (Rhei Rhizoma) là một nhóm dƣợc liệu Đại hoàng. Do vậy, đánh giá loài trong chi, Rheum thuộc họ rau Răm chất lƣợng Đại hoàng dựa trên thành (Polygonaceae). Có 3 loài của chi Rheum phần hoạt chất đóng vai trò rất quan trọng đƣợc chính thức công nhận trong Dƣợc trong kiểm soát chất lƣợng của dƣợc liệu điển Việt Nam, Hàn Quốc và Trung Quốc là Đại hoàng. R. tanguticum, R. palmatum và R. officinale [1, 2, 3]. Theo Dƣợc điển Nhật Bản, ngoài Dƣợc liệu Đại hoàng có nhiều hoạt chất có tác dụng nhuận tràng, lợi mật, bảo vệ 3 loài trên, ngƣời ta còn công nhận thêm gan, kháng virut, kháng viêm, chống ung Rheum coreanum và những loài lai giữa thƣ... [5, 6, 7]. Đó là các anthraquinone nhƣ: các loài trên là dƣợc liệu Đại hoàng [4]. chrysophanol, emodin [8], dianthrone Ngoài ra, các loài không chính thức nhƣ nhƣ sennoside A [9] hay stilbene nhƣ Rheum undulatum, Rheum rhaponticum, rhaponticin [10]. Trong nghiên cứu này, phƣơng pháp HPLC đƣợc phát triển và Rumex crispus, Rumex aquatica và thẩm định để phân tích 5 hoạt chất là Reynoutria elliptica cũng thƣờng bị sử chrysophanol, emodin, emodin-glucoside, dụng nhầm nhƣ là Đại hoàng. Trong một rhaponticin và sennoside A (hình 1), làm số trƣờng hợp, việc xác định loài dựa trên cơ sở để định lƣợng các hoạt chất sinh phân tích mô học giữa các loài của mẫu học trong 31 mẫu Đại hoàng từ nhiều nguồn gốc khác nhau. Đại hoàng trên thị trƣờng cực kỳ khó khăn. Các nhà nghiên cứu và thầy thuốc Hình 1: Cấu trúc hóa học của các hoạt chất chính trong Đại hoàng: 1. Sennoside A, 2. Rhaponticin, 3. Emodin-glucoside, 4. Emodin, 5. Chrysophanol. 8
3. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Hóa chất và thiết bị. - Hóa chất và nguyên liệu: + Hóa chất: chất chuẩn chrysophanol, emodin, emodin-glucoside, rhaponticin và sennoside A đƣợc GS. Bae Ki Hwan, Khoa Dƣợc, Trƣờng Đại học Chung Nam, Hàn Quốc cung cấp. Xác định độ tinh khiết bằng HPLC và khẳng định lại bằng sắc ký lỏng khối phổ; chuẩn nội (eugenol), acetonitrile, methanol, nƣớc cất, axit phosphoric đạt tiêu chuẩn cho HPLC, các hóa chất khác đạt tiêu chuẩn phân tích. + Mẫu Đại hoàng đƣợc thu hái từ nhiều vùng khác nhau của Trung Quốc và Hàn Quốc (bảng 1), mẫu đƣợc GS. Jae Hyun Lee, Khoa Y học Cổ truyền, Đại học Dong Guk thẩm định và lƣu trữ tại Khoa Dƣợc, Đại học Quốc gia Chung Nam, Hàn Quốc. - Thiết bị: máy HPLC Shimadzu gồm bơm LC-20AD, detector SPD-20A UV/Vis, hệ thống tiêm mẫu tự động SIL-20A, bộ phận ổn nhiệt CTO-20A (Shimadzu, Japan). Thực hiện phân tích trên cột C18 (4,6 x 250 mm, 5 µm, Optimapak, RStech Corp, Korea). Bảng 1: Danh mục mẫu sử dụng trong nghiên cứu. TÊN KÝ HIỆU TÊN TÊN KÝ HIỆU MẪU KÝ HIỆU MẪU KHOA HỌC MẪU KHOA HỌC KHOA HỌC 09B1001 R. tanguticum 09B1012 R. officinale 09B1026 R. tanguticum 09B1002 R. palmatum 09B1013 R. palmatum 09B1027 R. tanguticum 09B1003 R. palmatum 09B1014 R. undulatum 09B1028 R. palmatum 09B1004 R. palmatum 09B1015 R. undulatum 09B1029 R. officinale 09B1005 R. palmatum 09B1016 R. undulatum 09B1030 R. undulatum 09B1006 R. tanguticum 09B1017 R. undulatum 09B2038 R. undulatum 09B1007 R. tanguticum 09B1021 R. palmatum 09B2039 R. undulatum 09B1008 R. tanguticum 09B1022 R. tanguticum 09B2041 R. undulatum 09B1009 R. officinale 09B1023 R. tanguticum 09B2042 R. undulatum 09B1010 R. officinale 09B1024 R. tanguticum 09B1011 R. officinale 09B1025 R. tanguticum 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. - Điều kiện sắc ký: Cột: cột phân tích pha đảo Optimapak C18 (250 mm x 4,6 mm; 5 µm) của Công ty RS Tech (Hàn Quốc); bƣớc sóng phát hiện 280 nm; pha động: dung môi A: dung dịch axít phosphoric 0,05 M trong nƣớc; dung môi B: acetonitrile; tốc độ dòng 1 ml/phút, thể tích tiêm 10 μl. 9
4. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014 Với chƣơng trình rửa giải: THỜI GIAN (phút) % A % B 0 5 80 20 5 18 80 72 20 28 18 25 72 58 28 42 25 30 58 0 42 100 30 35 0 80 100 20 35 40 80 20 - Chuẩn bị dung dịch chuẩn và thử: ký đồ, mẫu thử có thời gian lƣu trùng với + Nội chuẩn (IS): dung dịch eugenol thời gian lƣu của píc sennoside A, nồng độ 1.000 µg/ml trong methanol. rhaponticin, emodin-glucoside, emodin, chrysophanol trong sắc ký đồ của mẫu + Mẫu chuẩn: dãy các dung dịch chuẩn lần lƣợt là 12,25; 13,35; 17,56; chuẩn nồng độ chính xác chrysophanol 34,42; 36,06 phút (hình 2). Tại thời gian (từ 2 - 200 µg/ml), emodin (1 - 100 µg/ml), lƣu píc sennoside A, rhaponticin, emodin-glucoside (0,5 - 50 µg/ml), emodin-glucoside, emodin, chrysophanol rhaponticin (2 - 200 µg/ml) và sennoside trên các sắc đồ mẫu thử và mẫu chuẩn, A (0,5 - 50 µg/ml) trong dung dịch chuẩn so sánh phổ hấp thụ UV thu đƣợc của nội eugenol (200 µg/ml) trong methanol. píc, kết quả: phổ mẫu thử và mẫu chuẩn + Mẫu thử: cân chính xác 100 mg bột trùng khít lên nhau với hệ số phù hợp lần dƣợc liệu Đại hoàng, cho vào bình định lƣợt 0,9997; 0,9996; 0,9998; 0,9992 và mức 10 ml. Thêm khoảng 9 ml ethanol 0,9994. Chứng tỏ: píc thu đƣợc trên sắc 70% và 200 μl dung dịch chuẩn nội, bổ ký đồ của mẫu thử tinh khiết và các sung ethanol 70% vừa đủ, cân, lắc siêu thành phần khác có trong mẫu thử không âm 60 phút, cân lại, bổ sung khối lƣợng ảnh hƣởng đến quá trình phân tích 5 mất bằng ethanol 70%, ly tâm, gạn lấy chất đối chiếu sennoside A, rhaponticin, lớp trên, lọc qua màng lọc 0,45 μm. emodin-glucoside,emodin, chrysophanol. Kết quả trên cho phép tiến hành định KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ tính, định lƣợng. BÀN LUẬN - Tính thích hợp của hệ thống sắc ký: Với điều kiện sắc ký và phƣơng pháp để đánh giá tính thích hợp của hệ thống xử lý mẫu đã lựa chọn, sắc ký đồ thu sắc ký, pha mẫu chuẩn theo chỉ dẫn ở đƣợc cho các píc tách rõ ràng, nhiễu nền trên. Tiêm 6 lần mẫu chuẩn vào hệ thống thấp thể hiện qua sắc ký đồ của mẫu thử HPLC, tiến hành sắc ký với điều kiện đã Đại hoàng và hỗn hợp chuẩn. Trên sắc chọn. 10
5. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014 Bảng 2: Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống. HOẠT CHẤT RSD CỦA THỜI RSD CỦA S Ố ĐĨA LÝ THUYẾT HỆ SỐ BẤT ĐỐI GIAN LƢU DIỆN TÍCH PÍC TRUNG BÌNH TRUNG BÌNH (T) Sennoside A 0,12 0,11 12340 1,10 Rhaponticin 0,14 0,15 13260 1,07 Emodin-glucoside 0,16 0,17 14580 1,11 Emodin 0,18 0,20 14620 1,08 Chrysophanol 0,19 0,22 15146 1,06 Các điều kiện sắc ký đã lựa chọn và hệ thống HPLC sử dụng phù hợp và đảm bảo ổn định cho phép phân tích định lƣợng sennoside A, rhaponticin, emodin-glucoside, emodin, chrysophanol. Hình 2: Sắc ký đồ và so sánh phổ của mẫu chuẩn (a) và mẫu thử (b, c): (1): sennoside A; (2): rhaponticin; (3): emodin-glucoside (4): emodin; (5): chrysophanol. - Khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng: 11
6. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014 Tiêm 6 dung dịch mẫu chuẩn có nồng độ khác nhau (từ 0,5 - 200 μg/ml), tiến hành sắc ký nhƣ điều kiện đã mô tả. Bảng 3: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng. CHẤT CHUẨN NỒNG ĐỘ ( g/ml) PHƢƠNG TRÌNH HỒI QUY r LOD ( g/ml) LOQ ( g/ml) Sennoside A 0,9 - 50 Y = 0,0023 X - 0,0066 1,0000 0,28 0,94 Rhaponticin 2,0 - 200 Y = 0,0066 X - 0,0039 0,9998 0,15 0,50 Emodin-glucoside 0,5 - 50 Y = 0,0211 X - 0,0045 0,9997 0,05 0,15 Emodin 1,0 - 100 Y = 0,0155 X - 0,0069 0,9997 0,06 0,20 Chrysophanol 2,0 - 200 Y = 0,0061 X - 0,0055 0,9996 0,16 0,50 Với khoảng nồng độ của sennoside A từ 0,9 - 50 μg/ml, rhaponticin từ 2,0 - 200 μg/ml, emodin-glucoside từ 0,5 - 50 μg/ml, emodin từ 1,0 - 100 μg/ml, chrysophanol từ 2,0 - 200 μg/ml, có sự tƣơng quan tuyến tính giữa nồng độ và tỷ lệ diện tích píc chuẩn/chuẩn nội tƣơng ứng. Từ phƣơng trình tuyến tính của sennoside A, rhaponticin, emodin-glucoside, emodin, chrysophanol, cho phép xác định giới hạn phát hiện của các chất lần lƣợt 0,28; 0,15; 0,05, 0,06 và 0,16 µg/ml, giới hạn định lƣợng của từng chất tƣơng ứng với từng chất lần lƣợt 0,94; 0,50; 0,15; 0,20 và 0,50 µg/ml. - Kết quả phân tích định lƣợng các hoạt chất trong mẫu dƣợc liệu Đại hoàng: Kết quả khảo sát hàm lƣợng sennoside A, rhaponticin, emodin-glucoside, emodin, chrysophanol có trong 31 mẫu Đại hoàng (hình 3) cho thấy: hàm lƣợng cao nhất của sennoside A, rhaponticin, emodin-glucoside, emodin, chrysophanol là 16,31; 94,41; 1,81; 3,11 và 12,64 mg/g trong dƣợc liệu khô. Sennoside A chỉ phát hiện đƣợc trong các mẫu Đại hoàng thật gồm 3 loài R. tanguticum, R. palamtum và R. officinale; rhaponticin chỉ phát hiện đƣợc trong các mẫu R. undulatum. Hàm lƣợng hoạt chất chính trong các mẫu Đại hoàng biến động nhiều trong tất cả các mẫu. 12
7. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014 Hình 3: Kết quả phân tích hàm lƣợng hoạt chất trong các mẫu Đại hoàng. KẾT LUẬN from Ventilago leiocarpa. The American Journal of Chinese Medicine. 1996, 24, Phƣơng pháp HPLC đơn giản, hiệu pp.139-142. quả đã đƣợc phát triển và thẩm định cho 7. Kang SC, Lee CM, Choung ES, Bak JP, việc định lƣợng đồng thời 5 hoạt chất Bae JJ, Yoo HS, Kwak JH, Zee OP. Anti- trong dƣợc liệu Đại hoàng. Kết quả cho proliferative effects of estrogen receptor modulating thấy hàm lƣợng các hoạt chất biến động compounds isolated from Rheum palmatum. nhiều trong mẫu, hàm lƣợng của sennoside, Archives Pharmaceutical Researches. 2008, 31, rhaponticin, emodin-glucoside, emodin và pp.722-726. chrysophanol tƣơng ứng 2,53 ± 4,26; 8. Kashiwada Y, Nonaka GI, Nishioka I. 16,40 ± 29,50; 0,58 ± 0,48; 0,93 ± 0,83 và Studies on Rhubarb (Rhei Rhizoma). XV. 3,72 ± 2,79 mg/g. Simultaneous determination of phenolic constituents by high-performance liquid chromatography. TÀI LIỆU THAM KHẢO Chemical & Pharmaceutical Bulletin. 1989, 37, pp.999-1004. 1. Dƣợc điển Việt Nam IV. 2010. 9. Komatsu K, Nagayama Y, Tanaka K, 2. Pharmacopoeia of the People's Republic Ling Y, Cai SQ, Omote T, Meselhy MR. of China. 2005. Comparative study of chemical constituents of 3. Korean Pharmacopoeia. 2007. rhubarb from different origins. Chemical & 4. The Japanese Pharmacopoeia. 2001. Pharmaceutical Bulletin. 2006, 54, pp.1491-1499. 5. Li Z, Li LJ, Sun Y, Li J. Identification of 10. Hu C, Ye S, Zhao L, Wang J. Effects of five natural compounds with anti-hepatitis B virus stilbene compounds on NO mediated vasodilation activity from Rheum palmatum L. ethanol extract. and their structure-activity relationship. Zhongguo Chemotherapy. 2007, 53, pp.320-326. Yiyuan Yaoxue Zazhi. 2006, 26, pp.826-829. 6. Chang CH, Lin CC, Yang JJ, Namba T, Hattori M. Anti-inflammatory effects of emodin 13
8. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014 14