Nghiên cứu định lượng đồng thời metformin và sitagliptin trong chế phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Nội dung text: Nghiên cứu định lượng đồng thời metformin và sitagliptin trong chế phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

1. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2016 NGHIÊN C ỨU ĐỊ NH L ƯỢNG ĐỒ NG TH ỜI METFORMIN VÀ SITAGLIPTIN TRONG CH Ế PH ẨM B ẰNG PH ƯƠ NG PHÁP SẮC KÝ L ỎNG HI ỆU N ĂNG CAO Nguy ễn Ng ọc Nhã Th ảo*; Ph ạm Th ị M ỹ L ệ* Ph ạm Thành Suôl*; Nguy ễn Th ị Ng ọc Vân* TÓM T ẮT Mục tiêu: xây d ựng ph ươ ng pháp định l ượng đồng th ời metformin và sitagliptin (SG) trong ch ế ph ẩm bằng sắc ký l ỏng hi ệu n ăng cao (HPLC). Đối t ượng và ph ươ ng pháp : ti ến hành phân tích “Viên nén bao phim Janumet” do Công ty Merck Sharp and Dohme sản xu ất trên h ệ th ống HPLC v ới c ột: RP8 (250 x 4,6 mm, 5 µm), b ước sóng 265 nm, t ốc độ dòng 1 ml/phút, th ể tích tiêm 20 µl, pha động là h ỗn h ợp methanol-nước ch ứa 0,3% triethylamin 0,1% (60:40). Kết qu ả: ph ươ ng pháp định l ượng đã xây d ựng đả m b ảo tính đặ c hi ệu, tính t ươ ng thích, tính tuy ến tính, độ đúng và độ l ặp l ại. Áp d ụng xác đị nh hàm l ượng metformin và SG trên 3 lô “Viên nén bao phim Janumet”. Kết lu ận: đã xây d ựng được quy trình định l ượng đồ ng th ời metformin và SG đảm b ảo đơ n gi ản, ti ết ki ệm th ời gian, không s ử d ụng h ệ đệ m vô c ơ nh ư phosphat gây đóng mu ối h ệ th ống s ắc ký và gi ảm tu ổi th ọ c ủa thi ết b ị. * T ừ khóa: Metformin hydrochlorid; Sitagliptin; HPLC; Định l ượng. Study of Simultaneous Measurement of Metformine and Sitagliptin by HPLC Method Summary Objectives: To establish a reversed-phase high performance liquid chromatography (HPLC) method for simultaneous measurement of metformine hydroclorid (MH) and sitagliptin (SG) in film coated tablet. Subjects and methods: Film coated Janumet tablet was analyzed on a Phenomenex Luna RP - C8 column (250 x 4.6 mm, 5 µm) with mobile phase in isocratic mode consisting of methanol - water 60:40 v/v containing 0.3% v/v triethylamine and was adjusted to the pH of 9.5 with formic acid with DAD detector highly selective to HPLC system. The flow rate was 1 mL min -1 and the photodiod - array detection wave length was 265 nm. Result: This method ensures the specificity, system suitability, linearity, accuracy and repeatability. The proposed method was successfully applied for the analysis of MH and SG in film coated Janumet tablet. Conclusion: A simple, rapid, and non-inorganic buffer HPLC method for simultaneous determination of MH and SG phosphate, in tablet dosage form has been developed and validated. * Key words: Metformine hydrochloride; Sitagliptin; HPLC; Measurement. * Tr ường Đại h ọc Y D ược C ần Th ơ Ng ười ph ản h ồi (Corresponding): Nguy ễn Th ị Ng ọc Vân (ntnvan@ctump.edu.vn) Ngày nh ận bài: 24/06/2016; Ngày ph ản bi ện đánh giá bài báo: 01/09/2016 Ngày bài báo được đă ng: 16/09/2016 21
2. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2016 ĐẶT V ẤN ĐỀ Dohme) ch ứa MH 500 mg và SG 50 mg. Số đă ng ký: VN1-694-12. S ố lô: J001206. Metformin hydroclorid (MH) là thu ốc điều tr ị đái tháo đường, dùng đường u ống, - Hóa ch ất - dung môi. ưu tiên được l ựa ch ọn trong điều tr ị kh ởi + Ch ất chu ẩn đối chi ếu: MH có hàm đầu đái tháo đường týp 2. MH giúp h ạ lượng 99,54% (tính trên ch ế ph ẩm nguyên đường huy ết thông qua c ơ ch ế gi ảm t ổng tr ạng), s ố ki ểm soát: QT 168 050413 do hợp glucose ở gan. Sitagliptin phosphat Vi ện Ki ểm nghi ệm Thu ốc TP.HCM cung monohydrat là thu ốc điều tr ị đái tháo cấp. SG phosphat monohydrat có hàm đường týp 2 thu ộc nhóm ức ch ế DPP-4 (dipeptidyl peptidase-4), có tác d ụng gi ảm lượng 99,15% (tính trên ch ế ph ẩm phân h ủy GLP-1 và t ăng bài ti ết insulin, nguyên tr ạng, s ố ki ểm soát): WS/STP gi ảm ti ết glucagon t ừ tuy ến t ụy, d ẫn đến 13012, do Công ty Glenmark Generics gi ảm đường huy ết. Vi ệc k ết h ợp 2 thành Ltd., Ấn Độ cung c ấp. ph ần này trong ch ế ph ẩm đã có trên th ị + Dung môi: methanol (MeOH) đạt tiêu tr ường ở dạng viên bao phim phóng thích chu ẩn dùng cho HPLC (Baker, M ỹ) và tức th ời, d ạng phóng thích kéo dài này axít formic, triethylamin dùng trong phân vẫn ch ưa có ở Vi ệt Nam. Trên th ế gi ới, tích ki ểm nghi ệm (Merck, Đức). sử dụng các ph ươ ng pháp để định l ượng đồng th ời hai ho ạt ch ất trên nh ư quang - Thi ết b ị. ph ổ tử ngo ại kh ả ki ến, s ắc ký l ỏng hi ệu Hệ th ống HPLC Hitachi L-2000 v ới đầu năng cao; s ắc ký l ớp m ỏng hi ệu n ăng cao dò dãy diod quang Hitachi L-2455, b ể và điện di mao qu ản [1, 2, 4, 8]. Tuy siêu âm Elmasoonic S70H, cân phân tích nhiên, các ph ươ ng pháp này s ử dụng h ệ ABT 220-5DM, máy đo pH HANNA pha động ph ức t ạp, th ời gian phân tích pH 211. dài [5, 6, 7, 9]. T ại Vi ệt Nam, ch ưa có đề tài nào nghiên c ứu định l ượng đồng th ời 2. Ph ươ ng pháp nghiên c ứu. MH và SG b ằng ph ươ ng pháp s ắc ký * Chu ẩn b ị dung d ịch: lỏng hi ệu n ăng cao (HPLC). Do đó, nghiên cứu này th ực hi ện v ới m ục tiêu: Xây d ựng - Dung d ịch chu ẩn g ốc: và th ẩm định quy trình định l ượng đồng + Dung d ịch MET chu ẩn g ốc 2 mg/ml th ời MH và SG trong ch ế ph ẩm b ằng (dung d ịch C1): cân chính xác 50 mg ph ươ ng pháp HPLC-DAD v ới h ệ pha MET chu ẩn cho vào bình định m ức 25 ml, động đơ n gi ản, th ời gian phân tích ng ắn. hòa tan v ới vài ml methanol, b ổ sung v ừa NGUYÊN V ẬT LI ỆU, THI ẾT B Ị VÀ đủ với methanol, l ắc đều. PH ƯƠ NG PHÁP NGHIÊN C ỨU + Dung d ịch SIT chu ẩn g ốc 200 µg/ml 1. Nguyên li ệu và thi ết b ị. (dung d ịch C2): cân chính xác 12,85 mg * Nguyên li ệu: SIT chu ẩn (t ươ ng ứng 10 mg SIT d ạng - Mẫu th ử. base) cho vào bình định m ức 50 ml, hòa Ch ế ph ẩm th ử: viên nén bao phim tan v ới vài ml methanol, b ổ sung v ừa đủ Janumet® (Công ty Merck Sharp và với methanol, l ắc đều. 22
3. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2016 - Dung d ịch chu ẩn định l ượng: hút gồm: t ươ ng thích h ệ th ống, tính đặc hi ệu, chính xác 5 ml dung d ịch C1 và 5 ml dung tính tuy ến tính và mi ền giá tr ị, độ chính dịch C2 vào bình định m ức 100 ml, b ổ xác, độ đúng. sung v ừa đủ với pha động, l ọc qua màng Ứng d ụng quy trình định l ượng trên để lọc 0,45 µm, được dung dịch chu ẩn làm định lượng đồng th ời MH và SG trong 3 lô vi ệc ch ứa MH 100 µg/ml và SG 10 µg/ml. ch ế ph ẩm nghiên c ứu. - Dung d ịch th ử: cân 20 viên, xác định kh ối l ượng trung bình viên, cho vào c ối KẾT QU Ả NGHIÊN C ỨU nghi ền thành b ột m ịn. Cân chính xác m ột 1. K ết qu ả kh ảo sát tính t ươ ng thích lượng b ột t ươ ng ứng 100 mg MET và 10 của h ệ th ống s ắc ký. mg SIT cho vào bình định m ức dung tích Th ực hi ện s ắc ký h ỗn h ợp 2 ch ất v ới 50 ml. Cho vào bình kho ảng 30 ml hệ pha động g ồm 2 thành ph ần v ới t ỷ lệ methanol, siêu âm trong 15 phút. B ổ sung thay đổi c ủa MeOH t ừ 90 - 40% ( ∆C = 5%), vừa đủ với methanol, l ắc đều. H ỗn h ợp tốc độ dòng 1 ml/phút. D ựa vào c ấu trúc ch ứa trong bình được đem quay ly tâm hóa h ọc c ủa hai ch ất phân tích, MH và với t ốc độ 4.000 vòng/phút trong 5 phút. SG đều là nh ững ch ất phân c ực, đồng Lấy dung d ịch l ớp trên. Hút chính xác th ời tham kh ảo m ột s ố công trình đã công 5 ml dung d ịch cho vào bình định m ức bố [1, 2, 4, 5], k ỹ thu ật s ắc ký pha đảo v ới 100 ml, b ổ sung v ừa đủ bằng pha động. hệ dung môi phân c ực đã áp d ụng. Trong Lọc qua màng l ọc 0,45 µm. quá trình th ực nghi ệm, đã kh ảo sát các * Điều ki ện s ắc ký: yếu t ố ảnh h ưởng đến hi ệu qu ả tách tính - Hệ th ống máy HPLC Hitachi L-2000, ch ọn l ọc c ủa ph ươ ng pháp nh ư pH và t ỷ DAD L-2455. lệ dung môi pha động. Cho thêm TEA vào - Pha t ĩnh: c ột Phenomenex Luna RP- pha động nh ằm làm gi ảm h ệ số bất đối, C8 (250 mm x 4,6 mm, 5 µm, 110 Å). gi ảm hi ện t ượng kéo đuôi c ủa píc MH. Pha động: h ỗn h ợp MeOH: đệm (60:40, Ghi ph ổ hấp th ụ UV trong kho ảng 200 tt/tt), dung d ịch đệm là TEA 0,3%, pH 9,5 - 400 nm. T ại th ời gian l ưu c ủa píc MH và điều ch ỉnh b ằng axít formic. SG trên s ắc ký đồ thu được, k ết qu ả cho - Tốc độ dòng: 1 ml/phút. th ấy: c ực đại h ấp th ụ của MH 235 nm, của SG 265 nm. Nh ằm ưu tiên định l ượng - Th ể tích tiêm m ẫu: 10 µl. ho ạt ch ất có hàm l ượng th ấp trong ch ế - Nhi ệt độ cột: nhi ệt độ phòng. ph ẩm, nên b ước sóng ch ọn để phân tích - Bước sóng phát hi ện: 265 nm. đồng th ời MET và SIT là 265 nm. * Th ẩm định quy trình định l ượng: Từ kết qu ả kh ảo sát b ằng th ực Ti ến hành kh ảo sát tính phù h ợp h ệ nghi ệm, chúng tôi l ựa ch ọn điều ki ện s ắc th ống và th ẩm định quy trình định l ượng ký để định l ượng đồng th ời MH và SG theo tiêu chu ẩn c ủa ICH [3]. Đánh giá 5 nh ư trình bày ở ph ần ph ươ ng pháp ch ỉ tiêu c ủa m ột quy trình định l ượng bao nghiên c ứu. 23
4. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2016 8 8 6 6 Metformin HCl 4 4 mAU mAU 2 Sitagliptin 2 0 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Minutes Hình 1: Sắc ký đồ của m ẫu chu ẩn ch ứa MH 100 µg/ml và SG 10 µg/ml. Ch ươ ng trình s ắc ký trên tách được píc MH và SG kh ỏi píc dung môi và các píc t ạp phân h ủy do tác nhân nhi ệt, ẩm, axít base, oxy hóa... Píc thu được có hình dáng cân đối, g ọn; th ời gian phân tích < 10 phút. Vì v ậy, điều ki ện s ắc ký đạt yêu c ầu phân tích. 2. Th ẩm định ph ươ ng pháp định l ượng. - Tính phù h ợp h ệ th ống: Tính phù h ợp h ệ th ống được xác định b ằng cách tiêm 6 l ần liên ti ếp dung d ịch chu ẩn. Bảng 1: Kết qu ả kh ảo sát tính phù h ợp h ệ th ống c ủa ph ươ ng pháp trên m ẫu chu ẩn (n = 6). Ho ạt ch ất Giá tr ị th ống kê tR (phút) S (mV x giây) AS RS N Trung bình 2,85 145754,60 1,40 1,49 58044,60 MH RSD 0,00 0,97 1,27 0,53 0,58 Trung bình 6,34 100028,40 1,13 17,49 10372,00 SG RSD 0,17 0,79 1,05 0,17 0,69 (t R: th ời gian l ưu, S: di ện tích đỉnh, A s: h ệ số đối x ứng, R s: độ phân gi ải, N: s ố đĩa lý thuy ết). RSD các thông s ố sắc ký c ủa ch ất phân tích trong m ẫu chu ẩn đều < 2%, độ phân gi ải gi ữa píc MH và SG > 1,5, h ệ số đối x ứng c ủa c ả 2 píc đều n ằm trong kho ảng 0,8 - 1,5. Nh ư v ậy, quy trình định l ượng đồng th ời MH và SG đạt tính phù h ợp c ủa h ệ th ống. - Tính đặc hi ệu: Kết qu ả kh ảo sát cho th ấy các píc trong m ẫu th ử có th ời gian l ưu trùng v ới th ời gian lưu píc trong m ẫu chu ẩn. Khi thêm chu ẩn vào m ẫu th ử chi ều cao và di ện tích píc t ăng lên ở các píc có th ời gian l ưu t ươ ng ứng v ới th ời gian l ưu c ủa píc trong m ẫu chu ẩn. Điều đó ch ứng t ỏ quy trình phân tích đúng ho ạt ch ất là MH và SG. 24
5. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2016 Metformin HCl Sitagliptin Metformin HCl Sitagliptin Metformin HCl Sitagliptin Hình 2 : Sắc ký đồ mẫu pha động (1), m ẫu tr ắng B1 (2), m ẫu chu ẩn (3), m ẫu th ử (4), mẫu th ử thêm chu ẩn (5). Metformin HCl Sitagliptin Metformin HCl Sitagliptin Metformin HCl Sitagliptin Hình 3: Sắc ký đồ mẫu th ử (1), m ẫu tr ắng B2 (2), m ẫu th ử phân h ủy trong NaOH 0,1N sau 36 gi ờ (3), m ẫu tr ắng B3 (4), m ẫu th ử phân h ủy trong HCl 0,1N sau 36 gi ờ (5). 25
6. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2016 Hình 4: Ph ổ UV-Vis t ại th ời gian l ưu c ủa MH và SG trong m ẫu chu ẩn và th ử. [A]: ph ổ UV-Vis t ại th ời gian lưu c ủa MH trong m ẫu chu ẩn (b) và th ử (a); [B]: ph ổ UV-Vis t ại th ời gian l ưu c ủa SG trong m ẫu chu ẩn (c) và th ử (d). Ở các píc trong m ẫu pha động, dung đều > 99% (theo ph ổ UV-Vis). Nh ư v ậy, môi pha m ẫu không trùng v ới 2 píc ho ạt quy trình có tính ch ọn l ọc. ch ất. Bên c ạnh đó, qua vi ệc kh ảo sát m ột - Kho ảng tuy ến tính, độ chính xác và số tác nhân nh ư axít, kiềm, k ết qu ả cho độ đúng: th ấy 2 píc ho ạt ch ất v ẫn tách kh ỏi các píc tạp phân h ủy. Trong các m ẫu phân h ủy Kho ảng tuy ến tính c ủa hai ch ất được này, MH và SG v ẫn tách hoàn toàn. Ph ổ xây d ựng trong vùng n ồng độ 20 - 400 UV-Vis t ại th ời gian l ưu c ủa píc MH và SG µg/ml cho MH, kho ảng 2 - 40 µg/ml cho trong các m ẫu đều gi ống nhau (hình 4) . SG. Xây d ựng trên 6 điểm n ồng độ, ứng Sử dụng ch ức n ăng ki ểm tra độ tinh khi ết với m ỗi n ồng độ, chu ẩn b ị 3 dung d ịch cho th ấy píc MH và SG trong các m ẫu chu ẩn độc l ập và tính giá tr ị trung bình. 26
7. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2016 Đánh giá độ chính xác c ủa ph ươ ng Hàm l ượng Hàm l ượng so RSD Lô pháp d ựa vào kh ảo sát độ lặp l ại trong (mg/viên) với nhãn (%) (%) ngày (ti ến hành trên 6 m ẫu th ử khác MH: 515,04 103 0,68 1 nhau) và độ chính xác trung gian (ti ến SG: 48,25 96,5 0,68 hành trong trong 3 ngày liên ti ếp). MH: 513 102,6 0,78 2 Xác định độ đúng b ằng ph ươ ng pháp SG: 49,63 99,3 0,80 thêm chu ẩn, xác định giá tr ị ph ần tr ăm tìm MH: 510 102 0,60 lại. Th ực hi ện ở ba m ức n ồng độ khác 3 SG: 48 96 0,50 nhau, m ỗi m ức n ồng độ ti ến hành 3 m ẫu th ử riêng bi ệt. Hàm l ượng MH và SG trong 3 lô viên Bảng 2: Kết qu ả kh ảo sát kho ảng nén bao phim Janumet 500 mg/50 mg tuy ến tính, độ chính xác và độ đúng . kh ảo sát đều n ằm trong kho ảng 90,0 - 110,0% so v ới hàm l ượng ghi trên nhãn. MH SG Ph ươ ng trình h ồi quy y = 1650 x y = 9494 x BẢN LU ẬN Kho ảng tuy ến tính 20 - 400 2 - 40 Hi ện t ại trong D ĐVN IV c ũng nh ư (µg/ml) Dược điển M ỹ, Anh ch ỉ có các chuyên 2 R 0,9998 0,9997 lu ận riêng l ẻ của MH và SG. Đã công b ố Độ chính xác một s ố nghiên c ứu định l ượng đồng th ời (RSD%) 0,59 0,86 MH và SG. So v ới nghiên c ứu c ủa Độ ặ ạ - l p l i (n = 6) 0,68 0,78 Ramalingam Peraman và CS (2013), - Độ chính xác trung gian (n = 3) điểm gi ống là cùng s ử dụng pha t ĩnh C 8 và phân tích ở bước sóng t ươ ng t ự, Độ đúng (n = 9) nh ưng khác nhau v ề thành ph ần c ũng - Tỷ l ệ h ồi ph ục (%) 99,7 - 100,7 99,7 - 101 - RSD 0,9 1,3 nh ư t ỷ lệ pha động. Nghiên c ứu c ủa chúng tôi đã s ử dụng pha động là h ỗn Kết qu ả th ống kê cho th ấy quy trình hợp MeOH và dung d ịch ch ứa phân tích có kho ảng tuy ến tính r ộng v ới triethylamin 0,2%, axít n-heptansulfonic giá tr ị của h ệ số tươ ng quan cao, đạt yêu 0,2% được điều ch ỉnh b ằng axít cầu v ề độ chính xác, độ đúng và có tính orthophosphoric đến pH 3, t ỷ lệ (45:55). ch ọn l ọc. Do v ậy, quy trình định l ượng đạt Bước sóng phân tích 267 nm và th ời gian các yêu c ầu th ẩm định theo h ướng d ẫn phân tích kho ảng 22 phút [5]. Vì v ậy, k ết của ICH [3]. qu ả cho th ấy, điều ki ện đã kh ảo sát có ưu điểm h ơn do th ời gian phân tích ng ắn 3. Ứng d ụng quy trình định l ượng (kho ảng 7 phút), ti ết ki ệm được dung môi, trên để định l ượng đồng th ời MH và hóa ch ất. So v ới các nghiên c ứu khác, SG trong 3 lô ch ế ph ẩm nghiên c ứu. điều ki ện t ối ưu kh ảo sát được không Bảng 3 : K ết qu ả định l ượng MH và SG dùng các h ệ đệm nh ư đệm phosphat, trong viên nén bao phim Janumet® 500 đệm amoni acetat [6, 7, 9]. Các h ệ đệm mg/50 mg c ủa Công ty Merck Sharp và vô c ơ này n ếu s ử dụng th ường xuyên và Dohme (S ố đă ng ký: VN1-694-12) (n = 6). không r ửa h ệ th ống s ắc ký đúng quy cách 27
8. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2016 có th ể gây đọng mu ối trong h ệ th ống, làm aleeM. Simultaneous determination of SG and hư h ỏng thi ết b ị, gây sai l ệch k ết qu ả metformine in their pharmaceutical phân tích. formulation. Journal of AOAC International. 2013, 96 (2), pp.301-306. KẾT LU ẬN 5. Ramalingam Peraman, Chandra Sekhar Bằng ph ươ ng pháp HPLC v ới đầu dò Gowra, Y Padmanabha Reddy, Krishna Karthik dãy diod quang, chúng tôi đã xây d ựng Peruru. Stability-Indicating RP-HPLC method for simultaneous determination of MH and SG được quy trình định l ượng đồng th ời MH phosphate in dosage forms. Chromatographia. và SG phosphat monohydrat trong viên 2013, 76, pp.1153-1162. nén. Quy trình có tính ch ọn l ọc, đơ n gi ản, 6. Ramzia I El-Bagary, Ehab F Elkady, th ời gian phân tích ng ắn (< 10 phút), Bassam M Ayou . Liquid chromatographic không s ử dụng h ệ đệm vô c ơ nh ư determination of SG either alone or in ternary phosphat gây đóng mu ối trong h ệ th ống mixture with metformin and SG degradation sắc ký, gây gi ảm tu ổi th ọ của thi ết b ị. product. Talanta. 2011, 85, pp.673-680. 7. Sudheer Kumar Sapavat, V Mohan TÀI LI ỆU THAM KH ẢO Goud, JVC Sharma. Method development and validation for simultaneous estimation of MH 1. Darshana K Modi, Punit B Parejiya, and SG by RP-HPLC in tablet dosage form. Bhavesh H Patel. A simple and sensitive International Journal of Pharmacy and Analytial HPTLC method for simultaneous determination Reasearch. 2014, 3 (1), pp.126-134. of metformin hydrochloride and sitagliptin phosphate in tablet dosage form. Hindawi 8. SL Bonde, RP Bhadane, Avinash Gaikwad, Publishing Corporation. Journal of Chemistry. Deepak Katale, Sumit Gavali AS . Narendiran: 2013, pp.1-4. A simple and sensitive method for determination of metformin and SG in human plasma using 2. Govindasamy Jeyabalan, Narendra Nyola. liquid chromatography and tandem mass Simultaneuos estimation of SG phosphate spectrometry. International Journal of Pharmacy monohydrate and MH in bulk and and Pharmaceutical Sciences. 2013, 5 (3), pharmaceutical formulation by RP-HPLC. pp.463-470. Journal of Pharmacy and Education Research. 9. T Raja, A Lakshmana Rao. Validated 2012, 3 (2), pp.25-28. RP-HPLC method for simultaneous estimation 3. ICH. Validation of analytical procedures: of MH and SG phosphate in bulk and Text and Methodology. Q2R1. 2005 pharmaceutical formulation. International Journal 4. MaMdouhR Rezk, Safa’aM. Riad, GhadaY . of Pharmaceutical, Chemical and Biological MahMoud, and abdelaziz el baYouMi abdel Sciences. 2012, 2 (4), pp.696-702. 28