Nghiên cứu định lượng đồng thời curcumin và piperin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Nội dung text: Nghiên cứu định lượng đồng thời curcumin và piperin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

1. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014 NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI CURCUMIN VÀ PIPERIN BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Phạm Thị Phương*; Nguyễn Quỳnh Ngọc*; Phạm Thị Thanh Hương* Đào Văn Đôn*; Nguyễn Thị Thanh Phương** TÓM TẮT Nghiên cứu đã xây dựng và thẩm định được quy trình định lượng đồng thời curcumin và piperin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Pha động sử dụng acetonitril - đệm KH2PO4 50 mM, cột phân tích Gemini C18 (250 x 4,6 nm, 5 mm), detector UV tại 340 nm và tốc độ dòng 0,8 ml/phút. Cả 2 chất đã được tách hoàn toàn trong thời gian 10 phút. Giới hạn định lượng của curcumin và piperin là 0,06 và 0,08 µg/ml. Diện tích pic và nồng độ các chất có mối tương quan tuyến tính với hệ số tương quan ~ 1. Phương pháp có độ chính xác cao, độ lặp lại tốt với RSD < 2%. Tỷ lệ thu hồi cả 2 chất từ 93 - 100%. Phương pháp này được sử dụng để định lượng curcumin và piperin trong chế phẩm chứa curcumin và piperin. * Từ khóa: Curcumin; Piperin; HPLC; Định lượng. SIMULTANEOUS QUANTIFICATION OF CURCUMIN AND PIPERINE IN SUPPLEMENT BY HPLC SUMMARY A HPLC method for the simultaneous quantification of curcumin and piperine in supplements was validated. Using acetonitrile and buffer KH2PO4 50 mM (60/40, v/v) as the mobile phase, Gemini C18 (250 x 4.6 nm, 5 µm) column, UV detection at 340 nm and flow at 0.8 ml/min, curcumin and piperine were separated satisfactorily within 10 minutes. The quantitation limits of curcumin and piperine were 0.6 µg/ml and 0.8 µg/ml. The calibration curve of each analyte had a correlation coefficient close to 1. The precisions were all less than 2%. The recovery rates of extraction were 93 - 100% for both curcumin and piperine. * Key words: Curcumin, Piperine, HPLC; Quantification. ĐẶT VẤN ĐỀ số bệnh tiêu hóa, gan mật, kháng khuẩn, chống viêm Curcumin rất kém tan trong Curcumin là hoạt chất chính của Nghệ nước (độ tan 0,001%) và sinh khả dụng đạt vàng (Curcuma longa L.) [1]. Curcumin có 2 - 3%. Các nghiên cứu cho thấy: piperin tác dụng sinh học ưu việt như: ức chế sự làm tăng sinh khả dụng của curcumin lên phát triển của khối u, tăng khả năng miễn dịch, chất chống oxy hóa mạnh, chữa một * Học viện Quân y ** Trung tâm Kiểm nghiệm Dược - Mỹ phẩm Hà Nội Người phản hồi (Corresponding): Đào Văn Đôn (daovandon@gmail.com) Ngày nhận bài: 13/06/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 17/07/2014 Ngày bài báo được đăng: 28/07/2014 7
2. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014 20 lần [2, 3]. Hiện nay, trên thị trường Việt Cân chính xác lượng bột tương đương Nam đã xuất hiện những sản phẩm kết hợp với khoảng 50 mg curcumin, thêm khoảng curcumin và piperin (tỷ lệ khoảng 100:1) 40 ml MeOH, lắc đều. Chiết siêu âm trong nhưng vẫn chưa có phương pháp định 20 phút. Để nguội, chuyển toàn bộ dịch lượng đồng thời 2 chất trên. Vì vậy, chúng chiết vào bình định mức 50 ml. Thêm tôi thực hiện nghiên cứu nhằm: Xây dựng MeOH vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc lấy quy trình định lượng đồng thời curcumin dịch lọc. Lấy 1 ml dịch lọc đem bốc hơi ở và piperin bằng phương pháp HPLC. nhiệt độ phòng tới cắn. Hòa tan cắn trong 10 ml pha động. Lọc qua màng lọc 0,45 µl NGUYÊN VẶT LIỆU VÀ trước khi phân tích bằng HPLC. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU + Điều kiện sắc ký [5, 6]: 1. Nguyên vật liệu và thiết bị nghiên Cố định các điều kiện: cột Gemini C18 cứu. (250 x 4,6 mm, 5 µm); detector PDA; * Hóa chất, nguyên liệu: thể tích bơm mẫu 50 µl; tốc độ dòng - Chất chuẩn: curcumin chuẩn (96,3%, 0,8 ml/phút. Khảo sát pha động với hệ dung Himedia Laboratories, Ấn Độ), piperin môi MeOH:nước và đệm KH2PO4:ACN. chuẩn (99,0%, Sigma- Aldrich). - Thẩm định quy trình định lượng. - Mẫu thử: chế phẩm chứa curcumin và Thẩm định quy trình định lượng theo piperin. hướng dẫn của Bộ Y tế [4] gồm các chỉ - Methanol, acetonitril đạt tiêu chuẩn tiêu: tính tương thích của hệ thống sắc HPLC (Merck). ký, độ chọn lọc - đặc hiệu, khoảng nồng độ tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn - Dung môi, hóa chất khác: KH2PO4, định lượng, độ chính xác, độ đúng. H3PO4, nước cất đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ * Thiết bị và dụng cụ phân tích: BÀN LUẬN - Hệ thống HPLC Alliance Waters 2695D, 1. Khảo sát quy trình định lƣợng. 4 kênh dung môi, bơm mẫu tự động, có Chúng tôi tiến hành xử lý mẫu và khảo buồng gia nhiệt cột, detector PDA, cột sắc sát điều kiện sắc ký và ghi sắc ký đồ. ký Gemini C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm). Phân tích kết quả và lựa chọn được điều - Cân phân tích Sartorius độ chính xác kiện sắc ký HPLC để định lượng đồng thời ± 0,1 mg, máy lắc siêu âm, máy đo pH, curcumin và piperin như sau: cột sắc ký: các dụng cụ thủy tinh, bình định mức, cột Gemini C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm), pipet có độ chính xác phù hợp. detector PDA, ghi phổ ở 340 nm. Pha 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. động: hỗn hợp dung môi acetonitril và dung dịch đệm KH PO 50 mM (điều chỉnh - Khảo sát quy trình định lượng. 2 4 đến pH = 3,5 bằng axít phosphoric) tỷ lệ + Xử lý mẫu: qua tham khảo tài liệu 60:40 (v/v), tốc độ dòng 0,8 ml/phút, thể [5, 6], chúng tôi lựa chọn quy trình xử lý tích bơm mẫu 50 µl, thời gian phân tích: mẫu như sau: 10 phút. 8
3. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014 2. Thẩm định quy trình định lƣợng. - Tính tương thích hệ thống sắc ký: Tiến hành sắc ký 6 lần cùng một mẫu chuẩn hỗn hợp các chất curcumin và piperin đều có nồng độ 10 µg/ml theo điều kiện đã lựa chọn. Kết quả về thời gian lưu và diện tích pic được trình bày trong bảng 1. Bảng 1: Kết quả thẩm định tính thích hợp của hệ thống sắc ký. STT tR (phút) Spic(µV.s) tR (phút) Spic(µV.s) 1 8,155 523508 8,931 1374756 2 8,156 526881 8.973 1375616 3 8,149 534524 8,948 1372662 4 8,154 523406 8,961 1378233 5 8,144 521094 8,950 1375421 6 8,143 520245 8,950 1375634 X 8,150 524943 8,950 1375387 RSD (%) 0,07 0,99 0,15 0,13 Độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu và diện tích pic của cả 2 chất đều < 2%, chứng tỏ hệ thống sắc ký có tính thích hợp cao, có thể ứng dụng để phân tích 2 chất trên trong các mẫu. - Độ chọn lọc - đặc hiệu: Tiến hành phân tích mẫu chuẩn hỗn hợp của curcumin, piperin đều có nồng độ 10 µg/ml, mẫu trắng và mẫu thử. (a) PI (b) CUR (c) CUR PI Hình 1: Sắc ký đồ của curcumin và piperin trong mẫu trắng (a), mẫu chuẩn (b) và mẫu thử (c). 9
4. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014 Trên sắc ký đồ mẫu trắng, tại vị trí tương ứng với thời gian lưu của curcumin và piperin không xuất hiện các pic như ở mẫu chuẩn. Các pic của chất phân tích trong mẫu thử tách hoàn toàn khỏi pic tạp. Như vậy, phương pháp có tính chọn lọc tốt và độ đặc hiệu cao. - Khoảng nồng độ tuyến tính: Pha một dãy dung dịch chuẩn curcumin có nồng độ khoảng 10 - 200 µg/ml, piperin có nồng độ khoảng 0,5 - 10 µg/ml và tiến hành sắc ký theo điều kiện đã lựa chọn. Bảng 2: Kết quả khảo sát mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của curcumin và piperin. (µg/ml) Diện tích pic (μV.s) 610060 3120758 6203550 9380402 12407214 Phương trình hồi quy: y = 59798 x + 976,88 R² = 0,9999 Nồng độ (µg/ml) 0,52 1,04 2,08 5,2 10,4 Piperin. Diện tích pic (μV.s) 29006 52082 96523 219847 452053 Phương trình hồi quy: y = 42572 x + 6084,1; R² = 0,9994 Hình 2: Đường biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ của curcumin. Hình 3: Đường biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ của piperin. Kết quả cho thấy có sự tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ piperin và curcumin trong khoảng khảo sát với hệ số tương quan R2 ~ 1. - Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng dưới: Dựa vào độ nhiễu đường nền của mẫu trắng và đường chuẩn để ngoại suy giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của curcumin và piperin. Tiến hành pha thử 4 - 5 nồng độ quanh điểm dự kiến. Kết quả cho thấy: giới hạn phát hiện của curcumin là 0,01 µg/ml và piperin là 0,02 µg/ml; giới hạn định lượng dưới của curcumin là 0,04 µg/ml và piperin là 0,08 µg/ml. 10 b
5. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014 - Độ chính xác: Cân 20 viên của mẫu 1, tính khối lượng trung bình mTB và nghiền thành bột mịn. Cân chính xác lượng bột tương đương chứa khoảng 50 mg curcumin (tiến hành lặp lại 6 lần). Xử lý mẫu và tiến hành sắc ký, kết quả được thể hiện trong bảng 3. Bảng 3: Kết quả xác định độ chính xác của phương pháp HPLC. (mg) DiÖn tÝch pic Hµm l•îng t×m thÊy DiÖn tÝch pic (μV.s) Hµm l•îng t×m thÊy (μV.s) (mg/viên) (mg/viên) 1 125,6 5205871 171,86 23014 1,34 2 124,8 5058579 168,94 22635 1,31 3 125,6 5247484 175,25 22887 1,33 4 124,9 4996609 166,87 22761 1,32 5 125,1 5064267 169,13 221295 1,27 169,89 1,31 X RSD (%) 1,85 1,89 Độ lệch chuẩn tương đối đều < 2%, chứng tỏ phương pháp có độ chính xác tốt, đáp ứng yêu cầu phân tích. - Độ đúng: Cân 20 viên của mẫu 1, tính khối lượng trung bình mTB, và nghiền thành bột mịn. Cân chính xác lượng bột tương đương chứa khoảng 50 mg curcumin với 6 lần cân khác nhau. Thêm 100 µl dung dịch chất chuẩn piperin có nồng độ 1.000 µg/ml, và 10 mg chuẩn curcumin, trộn đều, để khô tự nhiên. Xử lý mẫu và tiến hành sắc ký. Bảng 4: Kết quả xác định độ đúng của phương pháp HPLC. C h Ê t STT l•îng mg) L•îng (mg) Tû (%) 1 10 9,58 95,8 2 10,1 9,41 93,2 = 96,41 3 10,2 10,12 99,2 Curcumin SD = 2,1 4 10 9,67 96,7 RSD = 2,2% 5 9,9 9,42 95,2 6 10,3 10,12 98,3 1 0,1 0,097 97 2 0,1 0,095 95 = 95 3 0,1 0,093 93 pepirin SD = 1,6 4 0,1 0,094 94 RSD = 1,7% 5 0,1 0,097 97 6 0,1 0,095 95 Tỷ lệ thu hồi của curcumin và piperin từ 93 - 99% nằm trong giới hạn cho phép (92% - 100%) với giá trị RSD < 3%, chứng tỏ phương pháp có độ đúng cao. 11
6. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014 KẾT LUẬN 2. Bộ Y tế. Hướng dẫn của Asean về thẩm Nghiên cứu đã xây dựng và thẩm định định quy trình phân tích. Phụ lục 7 - Thông tư được quy trình định lượng đồng thời curcumin 22/2009/TT-BYT Quy định về đăng ký thuốc. và piperin bằng phương pháp HPLC. Quy 2009. trình xử lý mẫu: chiết cách thuỷ bằng MeOH; 3. P. Anand, A.B Kunnunmakkaram. Bioavailability dịch chiết để bốc hơi đến cắn và hoà tan of curcumin: proplems and promises, Molecular cắn trong pha động để phân tích bằng Pharmaceutics. 2007, 4 (6), pp.807-818. HPLC. Điều kiện HPLC: cột sắc ký Gemini 4. P. Anand et al. Biological activities of C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm), detector UV, pha curcumin and its analogues (Congeners) made by man and Mother Nature. Biochemical động ACN:KH2PO4 50 mM (60:40, v/v), tốc độ dòng 0,8 ml/phút, thể tích bơm mẫu 50 Pharmacology. 2008, 76, pp.1.590-1.611. µl. Quy trình định lượng này đã được 5. Krishna Veni Nagappan, Meyyanathan S thẩm định và có thể ứng dụng để định N, Rajinikanth B Raja and Elango Kannan. A liquid chromatography method for the lượng đồng thời curcumin và piperin trong simultaneous determination of curcumin and các chế phẩm trên thị trường. piperine in food products using diode array detection. Asian J. Research Chem. 2009, 2 (2), TÀI LIỆU THAM KHẢO April.-June. 1. Viện Dược liệu. Cây thuốc và động vật 6. Zhong Ming-Yuan, Quan Shan-Cong, Hu làm thuốc Việt Nam. NXB Khoa học và Jin-Hong. Simultaneous determination of curcumin and piperine in turmeric capsule Kỹ thuật. 2002. by HPLC method, Pharmaceutical Care and Research. 2006, 6 (1), pp.54-56. 12