Nghiên cứu định lượng diltiazem trong huyết tương chó bằng phương pháp hplc - ms / ms

Nội dung text: Nghiên cứu định lượng diltiazem trong huyết tương chó bằng phương pháp hplc - ms / ms

1. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2016 NGHIÊN C ỨU ĐỊNH L ƯỢNG DILTIAZEM TRONG HUY ẾT T ƯƠ NG CHÓ B ẰNG PH ƯƠ NG PHÁP HPLC-MS/MS Nguy ễn V ăn B ạch*; T ạ Mạnh Hùng** TÓM T ẮT Mục tiêu: xây d ựng và th ẩm định ph ươ ng pháp s ắc ký l ỏng hi ệu n ăng cao - kh ối ph ổ (HPLC- MS/MS) để định l ượng diltiazem (DIL) trong huy ết t ươ ng chó. Ph ươ ng pháp: chi ết DIL t ừ huy ết tươ ng chó b ằng ph ươ ng pháp chi ết l ỏng-lỏng. Kh ảo sát các điều ki ện s ắc ký; l ựa ch ọn n ội chu ẩn; th ẩm định độ đặc hi ệu, độ ch ọn l ọc, kho ảng tuy ến tính, gi ới h ạn định l ượng d ưới, hi ệu su ất chi ết, n ội chu ẩn và độ ổn định c ủa DIL theo các tiêu chí c ủa FDA. Kết qu ả: chi ết DIL t ừ huy ết t ươ ng chó b ằng ph ươ ng pháp chi ết l ỏng-lỏng v ới h ệ dung môi diethyleter-cloroform, n ội chu ẩn là felodipin (FELO); xác định được các điều ki ện s ắc ký nh ư: c ột, pha động, t ốc độ dòng, detector. Ph ươ ng pháp đã được th ẩm định và đạt các tiêu chí theo quy định c ủa FDA. Kết lu ận: có th ể sử dụng ph ươ ng pháp HPLC-MS/MS để định l ượng DIL trong huy ết t ươ ng chó khi đánh giá sinh kh ả dụng c ủa DIL trên chó th ực nghi ệm. * T ừ khóa: Diltiazem; Huy ết t ươ ng chó; HPLC-MS/MS. Quantitative Determination of Diltiazem in Dogs Plasma by HPLC- MS/MS Summary Objectives: To determine diltiazem (DIL) in dog plasma by high performance liquid chromatography-mass spectrometry (HPLC-MS/MS). Methods: A liquid-liquid extraction technique was used to extract DIL in dog plasma. Chromatographic conditions were studied; selection of internal standard; essessment of the specificity, selectivity, the linear range, lower limit of quantification, extraction efficiency, internal standard and stability of DIL following the guidance of FDA. Results: DIL in dog plasma was performed by liquid-liquid extraction with solvent mixtures diethyl ether-chloroform, felodipin as internal standard; chromatographic conditions were established, including: column, mobile phase, a flow-rate, detector. The method has been evaluated and achieved the FDA’s regulations. Conclusion: The HPLC-MS/MS method can be used to determine the DIL in dog plasma, which would evaluate bioavailability of the DIL in experimental dogs. * Key words: Diltiazem; Dog plasma; HPLC-MS/MS. ĐẶT V ẤN ĐỀ cả mạch ngo ại vi, làm gi ảm co bóp c ơ tim, Diltiazem là d ược ch ất có tác d ụng làm ch ậm nh ịp tim, được s ử dụng trong ch ẹn kênh canxi, làm giãn động m ạch vành, dự phòng và điều tr ị cơn đau th ắt ng ực [6]. * H ọc vi ện Quân y ** Vi ện Ki ểm nghi ệm Thu ốc Trung ương Ng ười ph ản h ồi (Corresponding): Nguy ễn V ăn B ạch (bachhvqy@yahoo.com) Ngày nh ận bài: 04/04/2016; Ngày ph ản bi ện đánh giá bài báo: 01/09/2016 Ngày bài báo được đă ng: 20/09/2016 29
2. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2016 Một s ố ch ức n ăng c ủa h ệ tim m ạch có có độ chính xác 0,1 mg và các d ụng c ụ nh ịp sinh h ọc, nên các b ệnh v ề tim m ạch khác đạt tiêu chu ẩn phân tích. cũng có nh ịp sinh h ọc. Chúng tôi đã bào 2. Ph ươ ng pháp nghiên c ứu. ch ế thành công viên nén DIL 60 mg gi ải phóng theo nh ịp để đáp ứng yêu c ầu * Xây d ựng ph ươ ng pháp: “nh ịp sinh h ọc” c ủa lo ại b ệnh này. Ch ế - Xử lý m ẫu huy ết t ươ ng chó b ằng ph ẩm đạt tiêu chu ẩn c ơ s ở theo các tiêu ph ươ ng pháp chi ết l ỏng-lỏng. C ụ th ể: l ấy chí v ề viên nén c ủa D ược điển Vi ệt Nam 1 ml huy ết t ươ ng chó ch ứa 5 ng DIL và IV và c ủa d ạng thu ốc gi ải phóng theo 250 ng FELO chu ẩn cho vào ống nghi ệm nh ịp. Vi ệc xác định sinh kh ả dụng và chi ết. Thêm 1,0 ml dung d ịch amoniac 0,1 M tươ ng đươ ng sinh h ọc d ựa vào các thông và 7 ml h ỗn h ợp dung môi diethylether- số dược động h ọc c ủa viên nén DIL 60 mg cloroform (7:3). L ắc đều trong kho ảng 10 gi ải phóng theo nh ịp mà chúng tôi bào phút, ly tâm, l ấy l ớp dung môi. B ốc h ơi ch ế được là c ần thi ết [4]. Nh ằm m ục đích dung môi d ưới dòng khí nit ơ, thu l ấy c ắn. đánh giá sinh kh ả dụng trên chó th ực Hòa tan c ắn trong 1 ml pha động. Sau khi nghi ệm, chúng tôi ti ến hành: Xây d ựng và lọc qua màng l ọc 0,45 µm, tiêm vào c ột th ẩm định ph ươ ng pháp HPLC-MS/MS để sắc ký 10 µl. định l ượng DIL trong huy ết t ươ ng chó [2]. - Điều ki ện s ắc ký: d ựa vào tài li ệu [1, 5], chúng tôi kh ảo sát các điều ki ện s ắc ký VẬT LI ỆU VÀ PH ƯƠ NG PHÁP của ph ươ ng pháp HPLC-MS/MS g ồm: NGHIÊN C ỨU cột, nhi ệt độ cột, pha động, t ốc độ dòng, 1. Nguyên li ệu và thi ết b ị. th ể tích tiêm m ẫu và ki ểu ph ổ kh ối. * Nguyên li ệu và hóa ch ất: * Th ẩm định ph ươ ng pháp định l ượng DIL trong huy ết t ươ ng: - Diltiazem hydroclorid chu ẩn: hàm lượng 99,9% (do Vi ện Ki ểm nghi ệm Theo h ướng d ẫn c ủa FDA g ồm các Thu ốc Trung ươ ng c ấp). ph ươ ng pháp: th ẩm định m ẫu tr ắng, m ẫu chu ẩn, m ẫu th ử và m ẫu ki ểm ch ứng. - Felodipin chu ẩn (n ội chu ẩn): hàm Đánh giá các tiêu chí: độ đặc hi ệu, độ lượng 99,8% (do Vi ện Ki ểm nghi ệm ch ọn l ọc, đường chu ẩn và kho ảng tuy ến Thu ốc Trung ươ ng c ấp). tính, gi ới h ạn định l ượng d ưới, độ đúng, - Viên nén DIL 60 mg gi ải phóng theo độ lặp l ại trong ngày và khác ngày, hi ệu nh ịp (t ự bào ch ế) đạt tiêu chu ẩn c ơ s ở. su ất chi ết và độ ổn định c ủa m ẫu huy ết - Huy ết t ươ ng chó tr ắng: do Ban tươ ng [3]. Cung c ấp Động vât thí nghi ệm, H ọc vi ện Quân y c ấp đạt tiêu chu ẩn th ử thu ốc. KẾT QU Ả NGHIÊN C ỨU VÀ BÀN LU ẬN - Các hóa ch ất khác đạt tiêu chu ẩn 1. Xây d ựng và th ẩm định ph ươ ng cho HPLC ho ặc tinh khi ết phân tích. pháp định l ượng DIL trong huy ết * Thi ết b ị: tươ ng chó. Máy HPLC-MS/MS TSQ Quantum * Xây d ựng ph ươ ng pháp: Ultra (Thermo Scientific); máy l ắc GPL - Xử lý m ẫu: so v ới ph ươ ng pháp t ủa 3006 ( Đức); cân phân tích Meller Toledo protein, ph ươ ng pháp chi ết l ỏng-lỏng có 30
3. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2016 nhi ều ưu điểm nh ư: tiến hành đơ n gi ản, ki ểu ph ổ kh ối: MS/MS, ngu ồn ion hóa dễ tri ển khai và gi ảm sai s ố khi ti ến hành ESI (+). phân tích. Vì v ậy, chúng tôi ch ọn ph ươ ng * Th ẩm định ph ươ ng pháp: pháp chi ết l ỏng-lỏng. - Độ đặc hi ệu và ch ọn l ọc: - Điều ki ện s ắc ký: định l ượng DIL theo Xác định độ thích h ợp c ủa h ệ th ống ph ươ ng pháp HPLC-MS/MS v ới các điều HPLC-MS/MS: tiêm l ặp l ại 6 l ần các dung ki ện sau: dịch chu ẩn DIL có n ồng độ kho ảng 400 Cột: C18 (50 x 3 mm; 2,1 µm); nhi ệt ng/ml ch ứa FELO v ới n ồng độ kho ảng độ cột: 40°C; pha động: methanol-amoni 250 ng/ml (m ẫu spike). Xác định th ời gian acetat 2 mM (90:10, v/v); t ốc độ dòng: lưu (T R), di ện tích píc c ủa DIL và FELO 0,3 ml/phút; th ể tích tiêm m ẫu: 10 µl; trên s ắc đồ. Bảng 1: Kết qu ả đánh giá độ thích h ợp c ủa h ệ th ống HPLC-MS/MS (n = 6). DIL FELO STT TR (phút) Di ện tích (mAU.S) TR (phút) Di ện tích (mAU.S) 1 1,47 55693143 1,63 23936463 2 1,47 53010711 1,62 23615459 3 1,45 54899222 1,64 24236487 4 1,46 52599837 1,62 22777336 5 1,48 54263361 163 23849527 6 1,45 56275337 1,62 24586267 X 1,46 54456935 1,63 23833590 RSD (%) 0,83 2,7 0,50 2,6 Hệ th ống HPLC-MS/MS ho ạt động ổn định, có độ lặp l ại t ốt. Giá tr ị RSD (%) c ủa th ời gian l ưu và di ện tích píc c ủa DIL và FELO đều l ần l ượt nh ỏ hơn 1,0% và 5,0% (giá tr ị RSD cao nh ất c ủa T R là 0,83% và c ủa di ện tích píc 2,7%). - Độ đặc hi ệu và ch ọn l ọc c ủa ph ươ ng pháp: phân tích các m ẫu huy ết t ươ ng tr ắng và m ẫu huy ết t ươ ng t ự tạo ch ứa FELO v ới n ồng độ 250 ng/ml và DIL chu ẩn v ới n ồng độ 5 ng/ml (b ằng kho ảng 1/30 đến 1/20 C max khi u ống li ều đơ n 60 mg DIL). 31
4. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2016 Hình 1: Sắc ký đồ của m ẫu huy ết t ươ ng tr ắng. Hình 2: Sắc ký đồ mẫu huy ết t ươ ng t ự tạo ch ứa DIL (n ồng độ 5 ng/ml) và FELO (n ồng độ 250 ng/ml). Kết qu ả trên cho th ấy t ại các th ời điểm DIL đáp ứng được yêu c ầu v ề độ đặc 1,49 và 1,63 phút, không xu ất hi ện các hi ệu và ch ọn l ọc theo h ướng d ẫn c ủa píc có mảnh ph ổ kh ối m/z = 414,5
   FDA. 177,8 (DIL) và m/z = 383,4
   338,1 - Đường chu ẩn và kho ảng tuy ến tính: (FELO). Di ện tích píc c ủa m ẫu tr ắng t ại Pha các m ẫu DIL chu ẩn trong huy ết các th ời điểm trùng v ới th ời gian l ưu c ủa tươ ng chó tr ắng có n ồng độ kho ảng 5 - DIL và FELO đều b ằng 0. Các píc DIL và 478 ng/ml. Xác định m ối t ươ ng quan gi ữa FELO ở mẫu LLOQ đều có t ỷ lệ S/N n ồ ng độ DIL v ới t ỷ lệ di ện tích píc c ủa > 500. Vì v ậy, ph ươ ng pháp phân tích DIL/ FELO trên s ắc ký đồ. 32
5. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2016 Bảng 2: Sự ph ụ thu ộc gi ữa t ỷ lệ di ện tích píc c ủa DIL/FELO và n ồng độ DIL chu ẩn trong huy ết t ươ ng chó. Nồng độ (ng/ml) 4,8 9,6 23,9 47,9 95,7 191,5 383,0 478,7 Di ện tích píc c ủa 1753805 3596455 9583909 15399556 30915949 58709102 106649051 128309847 DIL (mAU.S) Di ện tích píc c ủa 28882780 29652473 31765544 27376294 27197079 29306286 27769163 28178456 FELO (mAU.S) Tỷ lệ di ện tích píc 0,061 0,121 0,302 0,563 1,137 2,003 3,841 4,553 DIL/FELO RSD (%) 8,2 6,8 6,5 5,4 5,6 4,7 3,5 2,8 Ph ươ ng trình h ồi Y = 0,0096 X + 0,097 quy R2 = 0,9975 Độ đúng (%) 94,4 105,4 111,5 105,8 108,1 95,7 92,0 95,9 5 4.5 y = 0.0096x + 0.097 R2 = 0.9975 4 3.5 3 2.5 2 n tich pic DIL/FELO pic tich n ệ di 1.5 ệ l ỷ 1 T 0.5 0 0 100 200 300 400 500 600 Nồng độ DIL (ng/ml) Hình 3: Đồ th ị đường chu ẩn c ủa DIL trong huy ết t ươ ng chó. Trong kho ảng n ồng độ 4,8 - 478,7 ng/ml, có s ự tươ ng quan tuy ến tính gi ữa n ồng độ DIL v ới t ỷ lệ gi ữa diện tích píc c ủa DIL/FELO v ới h ệ số tươ ng quan x ấp x ỉ bằng 1 (R 2 = 0,9975). Độ đúng đạt t ỷ lệ cao (t ừ 94,4 - 111,5%), độ lặp l ại t ốt (2,8 - 8,2%) n ằm trong gi ới h ạn cho phép theo quy định c ủa FDA (±20% đối v ới n ồng độ th ấp nh ất và ±15% đối v ới các n ồng độ còn l ại). - Gi ới h ạn định l ượng d ưới (LLOQ): Phân tích các m ẫu huy ết t ươ ng tr ắng và m ẫu huy ết t ươ ng ch ứa DIL ở nồng độ 4,8 ng/ml (n ồng độ th ấp nh ất trong kho ảng tuy ến tính). Xác định đáp ứng đỉnh c ủa m ẫu chu ẩn và tính n ồng độ DIL trong m ẫu chu ẩn. 33
6. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2016 Bảng 3: Kết qu ả xác định giá tr ị LLOQ c ủa ph ươ ng pháp (n = 6). Mẫu tr ắng Mẫu chu ẩn LLOQ (4,8 ng/ml) Di ện tích píc t ại v ị trí Di ện tích píc Di ện tích píc Nồng độ tính t ừ STT Độ đúng so v ới trùng th ời gian l ưu của DIL của FELO ph ươ ng trình h ồi lý thuy ết (%) với DIL (mAU.S) (mAU.S) (mAU.S) quy (ng/ ml) 1 0 1389355 22658790 4,1 95,5 2 0 1405503 23555350 3,9 92,3 3 0 1511875 22526934 4,6 106,7 4 0 1370366 22819364 4,0 93,1 5 0 1438183 22319586 4,4 101,5 6 0 1777471 30354462 3,8 90,2 X 0 1482126 24039081 4,1 96,6 RSD (%) 7,2 7,2 Tại v ị trí có th ời gian l ưu (1,6 phút), đáp ứng c ủa m ẫu chu ẩn có n ồng độ 4,8 ng/ml lớn h ơn 5 l ần đáp ứng c ủa m ẫu tr ắng. Độ lặp l ại v ới giá tr ị RSD < 10,0% và độ đúng t ừ 90,2 - 106,7% (n ằm trong gi ới hạn 80 - 120%). Nh ư v ậy, m ẫu ch ứa DIL có n ồng độ 4,8 ng/ml đáp ứng yêu c ầu LLOQ c ủa ph ươ ng pháp phân tích d ịch sinh h ọc. - Độ đúng - độ lặp l ại trong ngày và khác ngày: Pha các m ẫu LQC (13,8 ng/ml), MQC (230,7 ng/ml) và HQC (323,0 ng/ml). Xác định nồng độ DIL b ằng ph ươ ng pháp đường chu ẩn và t ỷ lệ (%) gi ữa n ồng độ xác định được t ừ đường chu ẩn so v ới n ồng độ lý thuy ết. K ết qu ả xác định độ đúng, l ặp l ại trong ngày và khác ngày (3 ngày phân tích khác nhau) c ủa ph ươ ng pháp nh ư sau. Bảng 4: Kết qu ả th ẩm định độ đúng, độ lặp l ại trong ngày (n = 6). LQC (13,8 ng/ml) MQC (230,7 ng/ml) HQC (323,0 ng/ml) Nồng độ Nồng độ Nồng độ Tỷ lệ di ện Độ Tỷ lệ di ện Độ Tỷ lệ di ện Độ STT xác định xác định xác định tích đúng tích đúng tích đúng được được được DIL/FELO (%) DIL/FELO DIL/FELO (%) (ng/ml) a(ng/ml) (%) a(ng/ml) 1 0,161 13,8 100,0 2,327 212,9 92,3 3,236 296,6 91,8 2 0,156 13,3 96,1 2,245 205,4 89,0 3,280 300,6 93,1 3 0,148 12,5 90,5 2,265 207,3 89,8 3,125 286,3 88,6 4 0,160 13,7 98,8 2,309 211,3 91,6 3,205 293,7 90,9 5 0,152 13,0 93,6 2,275 208,2 90,2 3,206 293,8 91,0 6 0,180 15,5 112,0 2,289 209,4 90,8 3,354 307,4 95,2 X 98,4 90,6 91,8 RSD (%) 7,6 1,3 2,4 34
7. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2016 Bảng 5: Kết qu ả th ẩm định độ đúng và độ lặp l ại khác ngày (n = 6). LQC MQC HQC (13,8 ng/ml) (230,7 ng/ml) (323,0 ng/ml) Ngày Nồng độ xác Độ đúng Nồng độ xác Độ đúng Nồng độ xác Độ đúng định được định được định được (ng/ml) (%) (ng/ml) (%) (ng/ml) (%) 1 13,8 99,5 212,9 92,3 296,6 91,8 2 13,3 96,1 205,4 89,0 300,6 93,1 3 12,5 90,5 207,3 89,8 286,3 88,6 I 4 13,7 98,8 211,3 91,6 293,7 90,9 5 13,0 93,6 208,2 90,2 293,8 91,0 6 15,5 112,0 209,4 90,8 307,4 95.2 1 14,6 101,5 262,0 109,0 286,9 85,3 2 15,1 104,9 261,4 108,8 349,6 103,9 3 16,1 111,3 257,8 107,3 360,2 107,1 II 4 16,1 111,6 254,8 106,1 343,8 102,2 5 15,6 108,1 257,9 107,3 369,4 109,8 6 15,8 109,8 268,9 111,9 347,6 103,3 1 15,1 104,7 240,6 100,1 340,1 101,1 2 15,8 109,5 237,8 98,9 301,5 89,6 3 15,5 107,4 235,4 98,0 319,3 94,9 III 4 15,2 105,2 235,2 97,9 316,3 94,0 5 14,5 100,3 240,1 99,9 310,1 92,2 6 13,4 92,8 229,6 95,6 312,9 93,0 X 103,2 99,1 96,0 RSD (%) 6,7 7,7 7,2 Ở cả 3 n ồng độ, ph ươ ng pháp đều cho - Hi ệu su ất chi ết c ủa ph ươ ng pháp: độ đúng trong ngày và khác ngày cao + Hi ệu su ất chi ết FELO (n ội chu ẩn): (90,6 - 103,2%) và độ lặp lại trong ngày phân tích các m ẫu huy ết t ươ ng tr ắng và khác ngày v ới giá tr ị RSD < 10% chó ch ứa FELO (n ồng độ 250 ng/ml) (1,3 - 7,6% đối v ới độ lặp l ại trong ngày theo quy trình đã l ựa ch ọn. Xác định và t ừ 6,7 - 7,7% đối v ới độ lặp l ại khác di ện tích píc c ủa FELO. Song song v ới ngày). Điều đó ch ứng t ỏ: ph ươ ng pháp mẫu trên, xác định di ện tích píc c ủa phân tích có độ đúng, độ lặp l ại đáp ứng dung d ịch chu ẩn FELO có cùng n ồng độ được các yêu c ầu c ủa ph ươ ng pháp được pha trong huy ết t ươ ng chó đã phân tích các ch ất trong d ịch sinh h ọc. xử lý. 35
8. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2016 Bảng 6: Hi ệu su ất chi ết n ội chu ẩn FELO (n = 6). Di ện tích píc FELO (mAU.S) STT Hi ệu su ất chi ết (%) Mẫu huy ết t ươ ng (có chi ết) Mẫu spike (không chi ết) 1 22764320 33476941 68,00 2 23557488 34162547 68,95 3 24427925 33172556 73,64 4 22628958 32278905 70,10 5 22428570 34564121 64,89 6 24333856 34264278 71,02 X 23356852,83 33653224,7 69,40 RSD 3,8 2,5 4,2 Hi ệu su ất chi ết c ủa FELO x ấp x ỉ 70% (69,4%), độ lặp l ại c ủa ph ươ ng pháp chi ết t ốt (RSD < 5%). Nh ư v ậy, quy trình x ử lý m ẫu huy ết t ươ ng chó đã được nghiên c ứu thích hợp để chi ết tách FELO. Hi ệu su ất chi ết DIL: phân tích các m ẫu LQC, MQC, HQC c ủa DIL có n ồng độ 13,8; 230,7 và 323,0 ng/ml trong huy ết t ươ ng chó. Song song v ới các m ẫu trên, phân tích các dung d ịch chu ẩn c ủa DIL trong huy ết t ươ ng chó đã x ử lý có n ồng độ DIL t ươ ng ứng. Bảng 7: Hi ệu su ất chi ết DIL (n = 6). Mẫu LQC (13,8 ng/ml) Mẫu MQC (230,7 ng/ml) Mẫu HQC (320,0 ng/ml) Mẫu Hi ệu Hi ệu Hi ệu STT Mẫu Mẫu có Mẫu Mẫu có Mẫu có su ất su ất su ất spike chi ết spike chi ết spike chi ết (%) (%) (%) 1 10,5 13,6 77,0 168,9 228,3 74,0 253,4 320,8 79,0 2 10,5 13,5 78,1 160,8 225,9 71,2 249,1 319,4 78,0 3 9,5 12,9 74,0 167,0 222,6 75,0 252,6 319,8 79,0 4 10,6 14,1 75,1 164,5 218,7 75,2 249,8 320,3 78,0 5 10,7 13,3 80,0 162,5 224,8 72,3 256,4 320,5 80,0 6 9,8 13,0 76,0 175,2 225,2 77,8 247,8 319,7 77,5 X 76,7 74,1 78,6 SD 2,16 2,30 0,92 RSD (%) 2,8 3,1 1,1 Ở cả 3 nồng độ, ph ươ ng pháp đều cho hi ệu su ất chi ết cao (74,1 - 78,6%) v ới độ lặp lại t ốt (các giá tr ị RSD đều < 5%). Do đó, ph ươ ng pháp x ử lý m ẫu đã được xây d ựng phù h ợp để chi ết tách DIL t ừ huy ết t ươ ng chó. 36
9. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2016 - Độ ổn định c ủa m ẫu huy ết t ươ ng: + Độ ổn định c ủa m ẫu sau 3 chu k ỳ đông và rã đông: phân tích các m ẫu LQC và HQC theo ph ươ ng pháp đã xây d ựng. Xác định n ồng độ DIL có trong m ẫu. K ết qu ả so sánh n ồng độ DIL trong các m ẫu LQC và HQC ngay sau khi pha (n ồng độ ban đầu) v ới bảo qu ản sau 3 chu k ỳ đông - rã đông nh ư sau: Bảng 8 : Độ ổn định c ủa DIL trong m ẫu huy ết t ươ ng chó sau 3 chu k ỳ đông - rã đông (n = 5). Mẫu LQC (13,8 ng/ml) Mẫu HQC (323,0 ng/ml) STT Nồng độ ban Nồng độ sau đông-rã Nồng độ ban đầu Nồng độ sau đông- rã đầu (ng/ml) (ng/ml) (ng/ml) (ng/ml) (1) (2) (1) (2) 1 13,8 13,3 320,2 318,6 2 13,5 13,6 321,3 315,8 3 14,1 13,4 328,8 320,7 4 14,3 12,7 317,7 312,6 5 13,6 14,0 312,9 310,5 X 13,86 13,4 320,2 315,6 RSD (%) 2,4 3,5 1,8 1,3 p1,2 0,114 (> 0,05) 0,194 (> 0,05) Nồng độ ban đầu và sau 3 chu k ỳ đông - rã c ủa DIL trong hai lô m ẫu khác nhau không có ý ngh ĩa th ống kê (p > 0,05). Nh ư v ậy, DIL trong m ẫu huy ết t ươ ng ổn định qua 3 chu k ỳ đông - rã đông. Độ ổn định dài ngày: so sánh n ồng độ DIL trong m ẫu LQC, HQC tại các th ời điểm ngay sau khi pha và sau 10, 20 và 30 ngày b ảo qu ản m ẫu ở nhi ệt độ -35 0C. Bảng 9. Kết qu ả độ ổn định dài ngày c ủa DIL trong huy ết t ươ ng chó (n = 5). Kết qu ả định l ượng DIL Mẫu LQC (13,8 ng/ml) Mẫu HQC (323,0 ng/ml) Giai đoạn STT Nồng độ Thông s ố N ồng độ Thông s ố (ng/ml) th ống kê (ng/ml) th ống kê 1 13,8 320,2 2 13,5 321,3 X = 13,86 X = 320,2 Mẫu ban đầu 3 14,1 328,8 RSD = 2,4% RSD = 1,8% 4 14,3 317,7 5 13,6 312,9 37
10. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2016 1 13,9 311,5 2 14,2 X = 13,64 317,8 X = 311,46 Sau 10 ngày 3 13,7 RSD = 3,8% 305,7 RSD = 2,1% p = 0,451 p = 0,056 4 12,8 318,2 (> 0,05) (> 0,05) 5 13,6 304,1 1 14,2 312,8 2 15,1 X = 14,32 324,5 X = 315,03 Sau 20 ngày 3 14,7 RSD = 4% 309,7 RSD = 1,8% p = 0,162 p = 0,199 4 13,2 311,9 (> 0,05) (> 0,05) 5 13,9 316,3 1 13,4 310,8 2 14,1 X = 13,26 320,7 X = 311,3 Sau 30 ngày 3 12,4 RSD = 4,8% 302,4 RSD = 2,3% p = 0,101 p = 0,065 4 13,5 315,9 (> 0,05) (> 0,05) 5 12,9 306,7 Nồng độ DIL ở các m ẫu b ảo qu ản ở nhi ệt độ -35 0C trong vòng 10, 20 và 30 ngày so với n ồng độ DIL trong m ẫu định l ượng ngay khi pha khác bi ệt không có ý ngh ĩa th ống kê (p > 0,05). Điều đó ch ứng t ỏ: DIL ổn định trong huy ết t ươ ng trong 30 ngày b ảo qu ản ở nhi ệt độ -35 0C. KẾT LU ẬN trong huy ết t ươ ng chó. Quy trình đã đáp ứng được yêu c ầu c ủa m ột ph ươ ng - Đã xây d ựng được ph ươ ng pháp pháp phân tích trong d ịch sinh h ọc theo HPLC-MS/MS để định l ượng DIL trong quy định c ủa FDA. Ph ươ ng pháp này có huy ết t ươ ng chó. Chi ết DIL t ừ huy ết th ể áp d ụng để định l ượng DIL trong tươ ng chó b ằng ph ươ ng pháp chi ết l ỏng- huy ết t ươ ng chó khi nghiên c ứu sinh lỏng v ới h ỗn h ợp dung môi dietyleter- kh ả dụng và xác định các thông s ố cloroform (t ỷ lệ 7:3). Các điều ki ện s ắc ký dược động h ọc c ủa viên nén DIL 60 mg gồm: x ột C18 (50 x 3 mm; 2,1 µm), nhi ệt o gi ải phóng theo nh ịp trên chó th ực độ cột 40 C; pha động là methanol-amoni nghi ệm. acetat 2 mM (t ỷ lệ 90:10); t ốc độ dòng 0,3 ml/phút, detector kh ối ph ổ và chu ẩn TÀI LI ỆU THAM KH ẢO nội FELO. 1. Bialer M et al. Pharmacokinetic analysis - Đã th ẩm định được độ đặc hi ệu - of two new sustained-release products of ch ọn l ọc, độ đúng, độ lặp l ại, kho ảng diltiazem designed for twice- and once-daily tuy ến tính, gi ới h ạn định l ượng d ưới, treatment. Biopharm Drug Dispos. 1994, 15, hi ệu su ất chi ết và độ ổn định c ủa DIL pp.45-52. 38