Nghiên cứu định lượng capsaicin và dihydrocapsaicin trong quả ớt bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu nâng cao

Nội dung text: Nghiên cứu định lượng capsaicin và dihydrocapsaicin trong quả ớt bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu nâng cao

1. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2014 NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG CAPSAICIN VÀ DIHYDROCAPSAICIN TRONG QUẢ ỚT BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Hoàng Văn Lương*; Nguyễn Văn Long*; Chử Văn Mến* Nguyễn Thị Thanh Hương*; Phạm Thị Thanh Hương* TÓM TẮT Tiến hành định lượng capsaicin và dihydrocapsaicin trong quả ớt bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) kết hợp với quang phổ UV-Vis. Tiến hành phân tích trên cột pha đảo C18 (5 μm; 4,6 mm x 150 mm), với chương trình gradient sử dụng dung môi A (nước) và dung môi B (acetonitril), bước sóng 222 nm, tốc độ dòng 0,6 ml/phút. Giới hạn phát hiện của capsaicin và dihydrocapsaicin tương ứng 8 và 11 ng/mL. Giới hạn định lượng của capsaicin và dihydrocapsaicin tương ứng 24 và 33 ng/g. Phương pháp này áp dụng cho 20 mẫu ớt thu mua trên thị trường. Kết quả: hàm lượng capsaicin và dihydrocapsaicin biến động nhiều giữa các mẫu. * Từ khóa: Capsaicin; Ớt; Sắc ký lỏng hiệu năng cao. Quantitation of Capsaicin and Dihydrocapsaicin in Fructus Capsici using HPLC-UV/Vis method summary We quantitated capsaicin and dihydrocapsaicin in Fructus Capsici using HPLC-UV/Vis method. The separation was carried out on a reversed phase C18 (5 μm; 4.6 mm x 150 mm) by gradient elution with water and acetonitrile, the wave length was set at 222 nm, the flow rate water was set at 0.6 ml/min. The limit of detection (LOD) of the method was 8 and 11 ng/g for capsaicin and dihydrocapsaicin, respectively. The limit of quantification (LOD) was 24 and 33 ng/mL. The developed method was applied to the quantitation of 20 sample of different Fructus Capsici samples purchased from markets. The results showed that the contents of capsaicin and dihydrocapsaicin were different between samples. * Key words: Capsaicin; Capsicum; HPLC. ĐẶT VẤN ĐỀ kinh, viêm thanh quản, viêm họng [2]. Nghiên cứu về thành phần hóa học và tác Ớt thuộc chi Capsicum, họ Cà (Solanaceae), dụng sinh học của ớt cho thấy các nhóm có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới châu Mỹ, hoạt chất như capsaicinoid (capsaicin, ngày nay được trồng nhiều ở các nước dihydrocapsaicin...), sắc tố carotenoid là nằm trong vùng nhiệt đới và cận nhiệt capsanthine, adenine, betaine và cholien đới của châu Á [1]. Ở Việt Nam, hiện nay vitamin B1, B2, C có tác dụng giảm đau, có gần 10 loại ớt được sử dụng trong chữa đau lưng, thấp khớp, đau dây thần * Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Chử Văn Mến (chuvanmen@gmail.com) Ngày nhận bài: 28/03/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 08/05/2014 Ngày bài báo được đăng: 26/05/2014 7
2. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2014 tác dụng trên da và niêm mạc, tác dụng chuẩn cho HPLC. Các hóa chất khác đạt giảm tích lũy lipid gan Gần đây, một số tiêu chuẩn phân tích. tác giả nước ngoài cũng đã chứng minh - Máy HPLC Alliance Water 2695D, capsaicin có tác dụng giảm đau, chống gồm hệ bơm 4 kênh dung môi, autosampler, đau viêm khớp và viêm [3, 4]. Một số buồng ổn định nhiệt cột và Water 996 nghiên cứu chỉ ra capsaicin có hiệu PDA Detector. Thực hiện phân tích trên quả chống ung thư [5], cũng như chống cột pha đảo C18 (4,6 mm x 150 mm, lại cholesterol cao và béo phì [6, 7]. 5 µm). Dihydrocapsaicin có tác dụng chống lại 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. sự hình thành mảnh xơ vữa động mạch - Mẫu chuẩn: dung dịch chuẩn gốc [8]. Ngoài ra, capsaicin và những chất được pha bằng cách hòa tan capsaicin và khác trong nhóm capsaicinoid có tác dụng dihydrocapsaicin chuẩn trong methanol sinh lý và dược lý trên đường ruột - dạ với nồng độ 1 mg/ml. Từ dịch gốc capsaicin dày, hệ tim mạch và hô hấp, cũng như và dihydrocapsaicin, pha các dung dịch các giác quan và hệ điều hòa nhiệt. chu ẩ n làm việc thích hợp. Hàm lượng của hoạt chất trong ớt phụ - Mẫu thử: cân chính xác 1 g mẫu bột thuộc nhiều vào loài, thổ nhưỡng, khí ớt, cho vào bình định mức 25 ml, thêm hậu, cách trồng, chăm sóc và thu hoạch. methanol 100% đến vạch. Chiết siêu âm Do vậy, việc đánh giá chất lượng ớt thu trong 60 phút ở 25oC, lọc qua màng 0,45 µm. mua trên thị trường là cần thiết. Trong Dịch lọc được dùng để tiêm mẫu. nghiên cứu này, chúng tôi phát triển phương pháp định lượng capsaicin và KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ dihydrocapsaicin để lựa chọn nguyên liệu BÀN LUẬN ớt có hàm lượng hoạt chất cao nhất. 1. Khảo sát điều kiện sắc ký. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ Tiến hành khảo sát với điều kiện sắc PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ký: cột Water C18 (4,6 mm x 150 mm; 5 μm); pha động gồm nước:acetonitril với các 1. Nguyên liệu và thiết bị. điều kiện rửa giải khác nhau. Chúng tôi - Mẫu ớt được mua tại các khu vực tìm được điều kiện sắc ký tối ưu gồm khác nhau của Việt Nam và mã hóa thành chương trình chạy đẳng dòng, tỷ lệ pha các mẫu C01 đến C20. động là nước:acetonitril = 50:50; tốc độ - Hóa chất: capsaicin và dihydrocapsaicin dòng 0,6 ml/phút, thể tích tiêm 10 μl; chuẩn (Sigma), độ tinh khiết > 98%. detector UV tại bước sóng phát hiện Acetonitril, methanol, nước cất đạt tiêu 222 nm. 8
3. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2014 Hình 1: Sắc ký đồ của hỗn hợp chuẩn (a) và mẫu bột ớt (b); 1: capsaicin, 2: dihydrocapsaicin. Sắc ký đồ thu được cho các píc tách rõ ràng, nhiễu nền thấp thể hiện qua sắc ký đồ của mẫu bột ớt và chuẩn capsaicin và dihydrocapsaicin. Trên sắc ký đồ, píc của mẫu thử có thời gian lưu trùng với thời gian lưu của píc capsaicin và dihydrocapsaicin chuẩn với thời gian lưu 6,97 và 8,93 phút. Tại thời gian lưu píc capsaicin và dihydrocapsaicin trên các sắc đồ mẫu thử và mẫu chuẩn, so sánh phổ hấp thụ UV thu được của píc, kết quả: phổ mẫu thử và mẫu chuẩn trùng khít lên nhau với hệ số phù hợp 0,9998 (hình 2). Chứng tỏ, píc thu được trên sắc ký đồ của mẫu thử tinh khiết và các thành phần khác có trong mẫu thử không ảnh hưởng đến quá trình phân tích capsaicin và dihydrocapsaicin. Hình 2: Phổ UV của chuẩn capsaicin và dihydrocapsaicin (a) và píc capsaicin và dihydrocapsaicin được xác định trong mẫu bột ớt (b). 9
4. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2014 2. Thẩm định phƣơng pháp định lƣợng. - Phương trình đường chuẩn, giới hạn * Lựa chọn bước sóng: phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng Từ phổ UV của capsaicin và (LOQ): dihydrocapsaicin, chúng tôi thấy: capsaicin Hòa tan capsaicin và dihydrocapsaicin và dihydrocapsaicin đều có 2 đỉnh cực đại trong methanol tới nồng độ 1.000 µg/ml tại 222 nm và 278,7 nm. Kết quả đánh giá được dung dịch chuẩn gốc. Từ dung dịch tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N) của capsaicin gốc, pha các dung dịch chuẩn có nồng độ và dihydrocapsaicin tại 2 bước sóng này thích hợp để thiết lập đường chuẩn về được thể hiện ở bảng 1. mối liên hệ giữa diện tích píc capsaicin Bảng 1: và dihydrocapsaicin với nồng độ. Phương BƯỚC trình tuyến tính được xây dựng dưới SÓNG 222 nm 738147,6 419017,6 dạng y = ax + b. Trong đó, y và x lần lượt tương ứng với diện tích píc và nồng độ 278,7 nm 53482,2 15865,6 capsaicin và dihydrocapsaicin. Đối với Tại bước sóng 222 nm, píc capsaicin giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định và dihydrocapsaicin có tỷ lệ tín hiệu/nhiễu lượng (LOQ), hòa loãng dung dịch chuẩn cao nhất. Vì vậy, chúng tôi lựa chọn bước gốc tới nồng độ thích hợp với methanol sóng này để phân tích capsaicin và và tiêm vào hệ thống HPLC để phân dihydrocapsaicin trong các mẫu bột ớt. thích. Đánh giá LOD dựa trên píc thấp * Tính tương thích của hệ thống sắc ký: nhất có thể phát hiện trên sắc đồ có giá Khảo sát tính tương thích hệ thống sắc trị tỷ lệ tín hiệu/nhiễu bằng 3. Đánh giá ký dựa vào phân tích 5 lần một mẫu LOQ dựa trên nồng độ thấp nhất có thể chuẩn capsaicin trên máy HPLC với cùng định lượng được có giá trị tín hiệu/nhiễu điều kiện đã nêu. Đánh giá dựa vào sai bằng 10. số tương đối và độ lệch chuẩn tương đối của 5 phép thử song song đối với thời gian lưu, diện tích píc. Bảng 2: Tính tương thích của hệ thống sắc ký. THỜI GIAN LƯU DIỆN TÍCH PÍC (10 µg/ml) (phút) (mAU x min) 1 6,979 2597147 2 6,975 2642635 3 6,974 2613104 4 6,976 2596175 5 6,978 2632009 X 6,976 2616214 SD 0,002 20750 Hình 3: Đường chuẩn của capsaicin (a) RSD (%) 0,0430 0,793 và dihydrocapsaicin (b). 10
5. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2014 Bảng 3: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của capsaicin và dihydrocapsaicin. THAM SỐ Hệ số góc 4,86 2,58 Giao trục tung 0,73 0,58 Hệ số tuyến tính 0,9997 0,9994 LOD (ng/ml) 11,0 8,0 LOQ (ng/ml) 33,0 24,0 Khoảng tuyến tính (ug/ml) 0,05 - 20 0,05 - 20 * Độ thu hồi: Thí nghiệm độ thu hồi để đánh giá mức độ chính xác của phương pháp bằng cách thêm một lượng xác định chuẩn vào mẫu đã biết trước nồng độ. Hỗn hợp được chiết và phân tích ngay. Chất chuẩn thêm vào được chuẩn bị ở 3 nồng độ khác nhau. Tại mỗi nồng độ, tiến hành lặp lại 5 lần. Bảng 4: Độ thu hồi của capsaicin và dihydrocapsaicin. NỒNG ĐỘ PHÁT HIỆN TỶ LỆ THU HỒI CHẤT NỒNG ĐỘ THÊM (ng/ml) (ng/ml) TRUNG BÌNH (%) 0,0 80,88 - - 50,0 128,84 95,92 2,01 Capsaicin 100,0 178,89 98,01 1,97 200,0 276,31 97,715 3,27 0,0 55,91 - - 50,0 104,82 97,82 2,03 Dihydrocapsaicin 100,0 153,85 97,94 1,87 200,0 252,31 98,20 3,11 * Độ đúng và độ chính xác (độ lặp): Độ đúng và độ lặp lại trong ngày được thực hiện bằng cách phân tích dung dịch chuẩn 5 lần/ngày. Độ đúng và độ lặp lại giữa các ngày được thực hiện bằng cách phân tích dung dịch chuẩn trong 5 ngày liên tiếp. Bảng 5: Độ đúng và độ lặp lại của capsaicin và dihydrocapsaicin. NỒNG ĐỘ TRONG NGÀY (n = 5) GIỮA CÁC NGÀY (n = 5) CHẤT BAN ĐẦU Nồng độ phát Nồng độ phát Độ đúng (%) Độ lặp (%) Độ đúng (%) Độ lặp (%) (ng/ml) hiện (µg/ml) hiện (µg/ml) 100 98,80 ± 1,64 98,80 1,64 98,60 ± 2,61 98,60 2,61 Capsaicin 200 199,60 ± 3,91 99,80 1,96 200,20 ± 3,70 100,10 1,85 500 500,98 ± 4,71 100,20 0,94 501,18 ± 5,04 100,24 1,00 100 99,58 ± 2,85 99,58 2,85 99,78 ± 3,16 98,60 3,16 Dihydrocapsaicin 200 201,18 ± 4,13 100,59 2,07 200,78 ± 4,41 100,39 2,20 500 501,18 ± 5,04 100,24 1,01 501,58 ± 5,73 100,32 1,15 11
6. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2014 3. Kết quả định lƣợng capsaicin và dihydrocapsaicin trong các mẫu bột ớt thu dihydrocapsaicin trong các mẫu bột ớt. mua trên thị trường. Kết quả cho thấy hàm Định lượng capsaicin và dihydrocapsaicin lượng của capsaicin và dihydrocapsaicin trong các mẫu bột ớt được thu mua tại các biến đổi nhiều giữa các mẫu thu mua trên khu vực khác nhau. thị trường. Bảng 6: Hàm lượng capsaicin và TÀI LIỆU THAM KHẢO dihydrocapsaicin (mg/100 g) trong bột ớt. 1. Đỗ Huy Bích và CS. Cây thuốc và động MẪU vật làm thuốc ở Việt Nam, tập 2. NXB Khoa C01 4,22 2,82 học Kỹ thuật. 2004, tr.504-508. C02 4,17 2,67 2. Đỗ Tất Lợi. Những cây thuốc và vị thuốc C03 4,21 2,82 Việt Nam. NXB Y học. 2004, tr.382-384. C04 3,97 2,61 3. Menéndez L, Lastra A, Hidalgo A, C05 4,15 2,74 Baamonde A. The analgesic effect induced by C06 4,31 2,88 capsaicin is enhanced in inflammatory states. C07 4,02 2,64 Life Sci. 2004, May 14, 74 (26), pp.3235-3244. C08 3,95 1,57 4. Kim CS, Kawada T, Kim BS, Han IS, Choe C09 4,20 2,81 SY, Kurata T, Yu R. Capsaicin exhibits anti- inflammatory property by inhibiting IkB-a degradation C10 3,88 1,55 in LPS-stimulated peritoneal macrophages. C11 3,75 1,52 Cell Signal. 2003, Mar, 15 (3), pp.299-306. C12 4,39 2,89 5. Oyagbemi AA, Saba AB, Azeez OI. Capsaicin: C13 3,26 1,84 a novel chemopreventive molecule and its C14 3,92 1,67 underlying molecular mechanisms of action. C15 3,25 1,84 Indian J Cancer. 2010, Jan-Mar, 47 (1), pp.53-58. C16 4,84 2,51 6. Joo JI, Kim DH, Choi JW, Yun JW. C17 3,11 1,79 Proteomic analysis for antiobesity potential of C18 4,91 2,61 capsaicin on white adipose tissue in rats fed C19 3,23 1,88 with a high fat diet. J Proteome Res. 2010, Jun 4, 9 (6), pp.2977-2987. C20 3,81 1,56 7. Negulesco JA, Young RM, Ki P. Capsaicin Hàm lượng capsaicin và dihydrocapsaicin lowers plasma cholesterol and triglycerides of thay đổi nhiều giữa các mẫu. Hàm lượng lagomorphs. Artery. 1985, 12 (5), pp.301-311. biến đổi trong khoảng 3,25 - 4,84 mg/g 8. Yan-Wei Hu, Xin Ma, Jin-Lan Huang, đối với capsaicin và 1,55 - 2,88 mg/g đối Xin-Ru Mao, Jun-Yao Yang, Jia-Yi Zhao, Shu- với dihydrocapsaicin trong mẫu bột ớt khô. Fen Li, Yu-Rong Qiu, Jia Yang, Lei Zheng mail, Kết quả này phù hợp với nhiều nghiên cứu Qian Wang. Dihydrocapsaicin atenuates paque trước đó [9]. fomation through a PPARγ/LXRα pathway in apoE−/− mice fed a high-fat/high-cholesterol KẾT LUẬN diet. Plos One. 2013, June, 8 (6),p.66876. 9. Zeid Abdullah Al Othman, Yacine Badjah Phương pháp HPLC để định lượng Hadj Ahmed, Mohamed Abdelaty Habila, Ayman capsaicin và dihydrocapsaicin trong bột ớt Abdel Ghafar. Determination of capsaicin and (Capsicum sp, họ Cà - Solanaceae) được dihydrocapsaicin in capsicum fruit samples phát triển và thẩm định đầy đủ, áp dụng using high performance liquid chromatography. vào phân tích hàm lượng capsaicin và Molecules. 2011, 16, pp.8919-8929. 12
7. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2014 13