Nghiên cứu định lượng amoxicilin trong huyết tương lợn bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

Nội dung text: Nghiên cứu định lượng amoxicilin trong huyết tương lợn bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

1. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2012 NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG AMOXICILIN TRONG HUYẾT TƢƠNG LỢN BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Đào Văn Đôn*; Nguyễn Văn Bạch* Nguyễn Thanh Huyền*; Đoàn Cao Sơn* TÓM TẮT Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với detector UV (230 nm) được xây dựng và thẩm định để định lượng amoxicilin (AMO) trong huyết tương lợn với cefadroxil (CEF) là nội chuẩn. Sau khi kết tủa protein trong huyết tương bằng axít percloric, AMO và nội chuẩn được phân tách với điều kiện sắc ký như sau: cột Phenomenex Gimini C18 (5 m, 250 x 4 mm) ở 400C; pha động ACN: Na2HPO4 0,01M pH 4,8 (5/95, v/v), tốc độ 1,0 ml/phút. Phương pháp phân tích có giới hạn định lượng dưới là 0,25 µg/ml, RSD < 3%; khoảng tuyến tính từ 0,25 - 15 µg/ml, độ chính xác trong ngày và khác ngày lần lượt là 1,5 - 3,3% và 2,6 - 3,4%; độ đúng trong ngày và khác ngày lần lượt là 93,5 - 105,1% và 93,0 - 107,6%. Phương pháp phân tích đã xây dựng có thể sử dụng trong nghiên cứu sinh khả dụng và tương đương sinh học của AMO trên lợn thực nghiệm. * Từ khóa: Amoxicilin; Sắc ký lỏng hiệu năng cao; Huyết tương lợn. DETERMINATION OF AMOXICILINE IN PIG PLASMA BY HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY METHOD SUMMARY A sensitive and selective HPLC method with UV detection (230 nm) was developed and validated for quantitation of amoxiciline in pig plasma using cefadroxil as an internal standard (IS). After precipitating protein in plasma by percloric acid, the analyte and IS were eluted from Phenomenex Gemini C18 column (5 m, 250 x 4 mm) at 40C temperature with a mobile phase consisting of 10 mM phosphate buffer (pH 4.8): acetonitrile (95/5, v/v), at a flow rate of 1.0 mL/min. The lower limit of quantitation was 0.25 µg/mL, with a relative standard deviation of less than 3%. A linear range of 0,25 - 15 µg/mL was established. This HPLC method was validated with between-batch and within- batch precision of 1.5 - 3.3% and 2.6 - 3.4%, respectively. The between-batch and within-batch accuracy was 93.5 to 105.1% and 93.0 to 107.6%, respectively. This validated method is sensitive and repeatable enough to be used in bioavailability and bioequivalence studies. * Key words: Amoxicilin; HPLC; Pig plasma. ĐẶT VẤN ĐỀ tác dụng từ 6 - 8 giờ, nên phải sử dụng nhiều lần trong ngày (3 - 4 lần) để đạt được Amoxicilin là kháng sinh phổ rộng, thuộc hiệu quả điều trị. Đã có một số nghiên cứu nhóm beta-lactam, được sử dụng rộng rãi được công bố về xây dựng phương pháp trong điều trị nhiễm khuẩn thông thường. AMO có thời gian bán thải ngắn, thời gian * Học viện Quân y Chịu trách nhiệm nội dung khoa học: GS. TS. Nguyễn Liêm PGS. TS. Nguyễn Văn Minh 12
2. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2012 định lượng AMO và các hoạt chất khác - Xây dựng quy trình định lượng gồm trong huyết tương động vật thí nghiệm khác các nội dung: khảo sát điều kiện sắc ký, quy nhau như thỏ, chó [1]. Thử nghiệm trên trình xử lý mẫu và chất nội chuẩn, từ đó lựa những động vật này có ưu điểm là tiết kiệm chọn quy trình định lượng. chi phí, dễ triển khai thực hiện. Tuy nhiên, - Phương pháp thẩm định quy trình định khi triển khai thí nghiệm lấy nhiều máu lượng: theo hướng dẫn FDA (2001) (độ đặc (nhiều thời điểm khác nhau) trên thỏ và chó dễ làm thay đổi huyết động học, kéo dài hiệu, giới hạn định lượng dưới, độ tuyến thời gian phục hồi thể trạng cho nghiên cứu tính, tỷ lệ thu hồi) [2]. chéo đôi và có thể làm chết động vật thử * Chuẩn bị mẫu phân tích: nghiệm. Nghiên cứu sinh khả dụng (SKD) - Dung dịch gốc AMO pha trong Na HPO và tương đương sinh học (TĐSH) trên lợn 2 4 0,01M pH 4,8 có nồng độ 1 mg/ml, từ đó (> 30 kg) có nhược điểm tốn kém, nhưng có nhiều ưu điểm như: có thể lấy máu pha loãng thành các dung dịch thứ cấp để nhiều lần mà ít làm thay đổi huyết động khi thêm 50 µl dung dịch này vào 90 µl học, lợn nhanh chóng phục hồi thể trạng để huyết tương trắng tạo ra nồng độ AMO triển khai nghiên cứu những lần tiếp theo trong huyết tương là 0,25; 0,5; 1; 2,5; 5; 10; [5]. Nghiên cứu về SKD/TĐSH còn ít được 15 µg/ml. triển khai trên lợn. Vì vậy, chúng tôi tiến - Mẫu QC có nồng độ 0,6 µg/ml (LQC), hành nghiên cứu này để góp thêm phương 4,0 µg/ml (MQC) và 12,0 µg/ml (HQC). pháp trong đánh giá SKD/TĐSH, đặc biệt với những thuốc giải phóng kéo dài, phải lấy máu ở nhiều thời điểm trong quá trình KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ thí nghiệm. BÀN LUẬN ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP 1. Kết quả xây dựng quy trình định NGHIÊN CỨU lƣợng AMO trong huyết tƣơng lợn. 1. Nguyên vật liệu và thiết bị. Qua khảo sát thử, chúng tôi lựa chọn quy trình định lượng dưới đây để tiếp tục - Nguyên liệu: huyết tương lợn (màu trắng). đánh giá thẩm định: - Hóa chất: AMO, CEF (chuẩn - Viện Kiểm nghiệm Thuốc TƯ); acetonitrile, methanol - Xử lý mẫu: lấy 1 ml mẫu, thêm 50 µl nội chuẩn và 100 µl HClO4 15% (KL/KL), lắc và nước cất (HPLC-Merck), các dung môi 0 hoá chất khác đạt tiêu chuẩn PA. xoáy 30 giây. Ly tâm lạnh (4 C) với tốc độ 10.000 vòng/phút trong 10 phút. Lấy phần - Thiết bị: hệ thống HPLC Alliance Waters dịch trong để phân tích HPLC. Nội chuẩn: 2695D, 4 kênh dung môi, bơm mẫu tự động, CEF 250 µg/ml (pha trong đệm). detector UV 2487, có buồng gia nhiệt cột; cân phân tích Sartorius (độ chính xác 0,1 mg); - Điều kiện sắc ký: Cột Gemini C18, 5 m, máy ly tâm lạnh UNIVERSAL 320 (Hettich - 250 x 4 mm; 40C; pha động ACN: Đức, tốc độ tối đa 18.000 vòng/phút); máy Na2HPO4 0,01M pH 4,8 (5/95, v/v), tốc độ lắc MS1 Minishaker (IKA® - Mỹ); tủ lạnh âm dòng 1,0 ml/phút; detector UV 230 nm; thể sâu DF8514 (Ilshinlab - Hàn Quốc, nhiệt độ tích tiêm mẫu 50 l; nhiệt độ buồng tiêm âm tối đa -800C). mẫu 40C. 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. 14
3. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2012 2. Kết quả thẩm định quy trình định lƣợng AMO trong huyết tƣơng lợn. 0.80 0.60 0.70 0.50 0.60 0.40 b 0.50 a 0.40 AU AU 0.30 0.30 0.20 0.20 Cefadroxil Amoxicilin 0.10 0.10 0.00 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 Minutes Minutes Hình 1: Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng (a) và mẫu huyết tương chứa AMO, CEF (b). * Độ đặc hiệu - chọn lọc: * Giới hạn định lượng dưới: Phân tích huyết tương trắng và mẫu thử Phân tích 6 mẫu trắng và 6 mẫu chuẩn có chuẩn và nội chuẩn. Kết quả cho thấy: LLOQ (0,25 µg/ml). Kết quả cho thấy: tỷ lệ đáp ứng của mẫu chuẩn gấp từ 8 - 10 lần (> tại thời điểm xuất hiện pic chuẩn AMO (tR = 5 lần), đáp ứng của mẫu trắng; đáp ứng mẫu 5,8 phút) và nội chuẩn CEF (t = 6,6 phút), R chuẩn có độ lặp lại cao với RSD = 2,7% (< trong mẫu thử không thấy xuất hiện trong 20%); độ đúng so với nồng độ thực có trong mẫu trắng. Phương pháp phân tích đã đảm mẫu 88 - 96% (trong khoảng 80 - 120%). Như bảo nhận diện, phân biệt được AMO, CEF vậy, mẫu chuẩn chứa AMO có nồng độ 0,25 và không bị ảnh hưởng bởi các tạp chất có µg/ml đáp ứng được yêu cầu LLOQ của trong huyết tương lợn. phương pháp phân tích dịch sinh học. * Đường chuẩn và khoảng tuyến tính: Bảng 1: Tương quan nồng độ AMO và tỷ lệ diện tích pic S/IS. NỒNG ĐỘ (µg/ml) 0,25 0,50 1,00 2,50 5,00 10,00 15,00 Diện tích pic S 20865 35103 62681 145799 266141 505023 811551 Diện tích pic IS 426610 433730 437419 500680 497615 461376 494456 Tỷ lệ diện tích S/IS 0,049 0,081 0,143 0,291 0,535 1,095 1,641 Phương trình hồi quy Y = 0,1055X + 0,0225 R² = 0,9996 (Y = aX+b)* n tích ệ di ệ l S/IS ỷ pic T Nồng độ AMO (µg/ml) Hình 2: Đồ thị biểu diễn mối tương quan gi÷a nồng độ AMO trong huyết tương với tỷ lệ diện tích pic S/IS. 15
4. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2012 Tiến hành khảo sát độ tuyến tính trong lượt là 93,5 - 105,1% và 93,0 - 107,6% khoảng nồng độ từ 0,25 - 15,00 µg/ml. Kết (trong khoảng 85 - 115%); độ chính xác quả cho thấy: trong khoảng nồng độ khảo trong ngày và khác ngày lần lượt là 1,5 - sát, có tương quan tuyến tính (hệ số tương 3,3% và 2,6 - 3,4% (< 15%). 2 quan R ≈ 1) giữa nồng độ AMO trong mẫu * Tỷ lệ thu hồi: huyết tương (X - ng/ml) với tỷ lệ diện tích Xác định tỷ lệ thu hồi của chất chuẩn và pic chuẩn/nội chuẩn thu được (Y) và thể nội chuẩn bằng so sánh diện tích pic của hiện qua phương trình hồi quy Y = AMO và CEF từ mẫu huyết tương định 0,1055*X + 0,0225. lượng theo phương pháp trên với diện tích * Độ đúng - độ chính xác trong ngày và pic của chúng trong mẫu pha động có chứa khác ngày: cùng nồng độ chất chuẩn hoặc nội chuẩn. Tiến hành khảo độ đúng - độ chính xác Kết quả cho thấy: tỷ lệ thu hồi của nội ở 3 mức nồng độ LQC (0,6 µg/ml), MQC chuẩn CEF tại nồng độ 250 µg/ml là 75,4 ± (4,0 µg/ml) và HQC (12,0 µg/ml). Ở mỗi 1,9% (n = 6). Hiệu suất chiết chuẩn AMO ở nồng độ, xử lý 5 mẫu độc lập và phân tích 3 mức nồng độ LQC, MQC và HQC cao lần lặp lại vào 3 ngày khác nhau. Kết quả cho lượt là 78,9 ± 3,6%; 81,6 ± 3,1% và 82,2 ± 4,0%, thấy: độ đúng trong ngày và khác ngày lần cao từ 79% với độ lặp lại cao (RSD < 5%). * Độ ổn định: Bảng 2: Kết quả nghiên cứu độ ổn định của AMO mẫu huyết tương sau 3 chu kỳ đông - rã đông. LQC (0,605 µg/ml) HQC (12,10 µg/ml) MẪU Sau 3 chu kỳ Sau 3 chu kỳ Ban đầu1 Ban đầu3 đông - rã đông2 ®ông - rã đông4 1 0,588 0,584 11,68 11,67 2 0,606 0,603 12,00 11,98 3 0,610 0,607 11,73 11,72 4 0,57 0,568 12,21 12,16 5 0,613 0,607 12,24 12,19 X ± SD 0,597 ± 0,018 0,594 ± 0,017 11,97 ± 0,26 11,94 ± 0,24 p 0,756 (p1-2 > 0,05) 0,864 (p3-4 > 0,05) Độ ổn định sau ba chu kỳ đông - rã để lại tủ lạnh. Phân tích mẫu sau 3 chu kỳ đông: tiến hành chuẩn bị 3 mẫu LQC và 3 đông rã và so sánh với mẫu fresh. Kết mẫu HQC, bảo quản 24 giờ ở -400C. Sau quả cho thấy: mẫu ổn định sau 3 chu kỳ đó, để mẫu rã hoàn toàn ở nhiệt độ phòng, đông rã. 16
5. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2012 Bảng 3: Kết quả nghiên cứu ổn định ngắn ngày của AMO trong huyết tương. LQC (0,610 µg/ml) HQC (12,20 µg/ml) MẪU Sau 6 giờ/ Sau 6 giờ/ Xử lý ngay1 Xử lý ngay3 nhiệt độ phòng2 nhiệt độ phòng4 1 0,61 0,61 12,07 12,06 2 0,61 0,61 12,18 12,19 3 0,58 0,58 12,21 12,15 4 0,62 0,61 12,02 11,95 5 0,62 0,62 11,74 11,69 X ± SD 0,608 ± 0,016 0,606 ± 0,015 12,04 ± 0,19 12,01 ± 0,20 p 0,846 (p1-2 > 0,05) 0,776 (p3-4 > 0,05) Độ ổn định ngắn hạn: đánh giá độ ổn định trên 3 mẫu LQC, 3 mẫu HQC phân tích ngay sau khi rã đông và sau rã đông 6 giờ ở nhiệt độ phòng, mẫu ổn định sau rã đông 6 giờ ở nhiệt độ phòng. Bảng 4: Kết quả nghiên cứu ổn định dài ngày của AMO trong huyết tương. LQC (0,600 µg/ml) HQC (12,00 µg/ml) MẪU Ban đầu1 Sau 14 ngày2 Sau 28 ngày3 Ban đầu4 Sau 14 ngày5 Sau 28 ngày6 1 0,601 0,613 0,591 11,79 11,76 11,74 2 0,633 0,622 0,623 12,00 11,98 11,92 3 0,585 0,581 0,570 11,86 11,8 11,74 4 0,596 0,580 0,582 12,18 12,19 12,13 5 0,611 0,614 0,614 11,72 11,7 11,66 TB 0,605 0,602 0,596 11,91 11,886 11,838 SD 0,018 0,020 0,022 0,180 0,200 0,190 p p1-2 = 0,797 p1-3 = 0,492 p4-5 = 0,848 p4-6 = 0,556 Độ ổn định dài ngày: đánh giá độ ổn Kết quả thẩm định độ đặc hiệu - chọn định của mẫu huyết tương trên các mẫu lọc, độ đúng, độ lặp lại, khoảng tuyến tính, LQC và HQC. Xác định nồng độ AMO có giới hạn định lượng dưới, hiệu suất chiết và độ ổn định cho thấy: phương pháp xây trong mẫu tại những thời điểm ngay sau khi dựng đáp ứng yêu cầu của một phương pha và sau 14,28 ngày bảo quản mẫu ở pháp phân tích dùng trong sinh học, có thể o -40 C, theo phương pháp phân tích đã áp dụng để định lượng AMO trong huyết được xây dựng. Kết quả cho thấy mẫu ổn tương lợn khi nghiên cứu sinh kh¶ dông và định trong thời gian 28 ngày (p > 0,05). đánh giá TĐSH các chế phẩm chứa AMO. 17
6. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2012 KẾT LUẬN TÀI LIỆU THAM KHẢO Chúng tôi đã tiến hành xây dựng và 1. Đào Văn Đôn, Quách Thị Hà Vân và CS. thẩm định phương pháp định lượng AMO Nghiên cứu định lượng pantoprazol trong huyết trong huyết tương lợn như sau: lấy 1 ml tương chó bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao. Tạp chí Y - Dược Quân sự. 2010, số 7, tr.12-19. mẫu được thêm 50 µl nội chuẩn và 100 µl 2. Center for drug Evaluation and Research. HClO4 15% (KL/KL), lắc xoáy 30 giây. Ly Guidance for industry. Bioanalytical Method tâm lạnh (4oC) với 10.000 vòng/phút trong 10 Validation. FDA, US, Department of Health and phút, lấy phần dịch trong để phân tích HPLC. Human Service. 2001. Điều kiện sắc ký: cột Gemini C18, 5 m, 250 x 3. N.V.S. Ramakrishna, K.N. Vishwottam, S. Wishu, M. Koteshwara. High-performance liquid 4 mm; 40C; pha động ACN: Na2HPO4 chromatography method for the quantification of 0,01M pH 4,8 (5/95, v/v), 1,0 ml/phút; amoxiciline in human plasma. Journal of detector UV 230 nm; thể tích tiêm mẫu 50 l; Chromatography B. 2005, 822, pp.326-329. nhiệt độ buồng tiêm mẫu 4oC. Nội chuẩn: 4. M. A. Pue, J. Laroche, I. Meineke, C. de Mey. Pharmacokinetics of amoxiciline following CEF 250 µg/ml (pha trong đệm). single intravenous and oral administration to Quy trình định lượng AMO trong dịch healthy male subjects. Eur J Clin Pharmacol. sinh học xây dựng đã đáp ứng tất cả yêu 1993, 44, pp.575-578. cầu của phương pháp phân tích dịch sinh 5. T.R. Krishnan, Isaac Abraham and Sylvia Craig. Use of the domestic pig as a model for học theo quy định của FDA Mỹ về thẩm oral bioavailability and pharmacokinetic studies. định phương pháp phân tích trong dịch sinh Biopharmaceuticals and Drug Disposition. 1994, học (2001). 15, pp.341-346. Ngày nhận bài: 4/9/2012 Ngày giao phản biện: 10/10/2012 Ngày giao bản thảo in: 16/11/2012 18
7. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2012 19