Nghiên cứu định lượng adenosine trong đông trùng hạ thảo (cordyceps spp.) bằng phương pháp hplc

Nội dung text: Nghiên cứu định lượng adenosine trong đông trùng hạ thảo (cordyceps spp.) bằng phương pháp hplc

1. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015 NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG ADENOSINE TRONG ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO (Cordyceps spp.) BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPLC Chử Văn Mến*; Vũ Tuấn Anh*; Nguyễn Văn Long* Nguyễn Thị Lan Hương*; Bùi Thị Thu Hà* TÓM TẮT Mục tiêu: xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng adenosine trong Đông trùng hạ thảo bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Đối tượng: Đông trùng hạ thảo. Phương pháp: xác định điều kiện sắc ký để định lượng adenosine trong Đông trùng hạ thảo bằng HPLC. Thẩm định phương pháp theo hướng dẫn của ICH. Kết quả: xác định được điều kiện sắc ký thích hợp định lượng adenosine trong Đông trùng hạ thảo gồm: cột C18 Phenomenex (4,6 mm × 250 mm, 5 µm) với hệ dung môi pha động là dung dịch đệm phosphate và acetonitril, tỷ lệ 92/8, detector UV tại bước sóng 259 nm. Phương pháp được thẩm định đã đáp ứng yêu cầu về tính tương thích hệ thống, chọn lọc đặc hiệu, khoảng tuyến tính, giới hạn định lượng (LOQ), giới hạn phát hiện (LOD), độ đúng, độ chính xác. Kết luận: đã xây dựng và thẩm định được phương pháp định lượng adenosine trong Đông trùng hạ thảo bằng phương pháp HPLC. * Từ khóa: Đông trùng hạ thảo; HPLC; Adenosine. Determination of Adenosine in Cordyceps spp. by HPLC Summary Objectives: Establishment and validation of adenosine quantification in Cordyceps spp. by high performance liquid chromatography. Materials: Cordyceps spp. Methods: Determine chromatographic conditions for quantitation of adenosine in Cordyceps spp. using HPLC. The validation was carried out in accordance with ICH guideline and USP-34. Results: The suitable chromatographic conditions for quantitation of adenosine in Cordyceps spp., including: C18 Phenomenex columns (4.6 mm x 250 mm, 5 µm) with mobile phase of phosphate buffer and acetonitrile, at the ratio of 92/8, the detection wave length of 259 nm. The quantitative method was validated on system compatibility, selectivity, linear range, limit of detection (LOD), limit of quantitation (LOQ), precision and accuracy. Conclusion: The HPLC method for adenosine quantitation has been developed and fully validated in accordance with ICH guideline. * Key words: Cordyceps spp.; HPLC; Adenosine. ĐẶT VẤN ĐỀ militaris, ký sinh trên ấu trùng một số loài côn trùng và sâu chết. Đông trùng hạ Đông trùng hạ thảo, một thuốc cổ truyền thảo phân bố chủ yếu ở một số tỉnh của nổi tiếng của Trung Quốc, có tên khoa học Trung Quốc như Tibet, Qinghai, Sichuan, là Cordyceps sinensis hoặc Cordyceps Yunnan và Gansu. Đây là vị thuốc có nhiều * Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Chử Văn Mến (chuvanmen@gmail.com) Ngày nhận bài: 24/06/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 25/11/2015 Ngày bài báo được đăng: 01/12/2015 18
2. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015 tác dụng quý và giá thành cao. Đông trùng - Hóa chất: hạ thảo dùng trong đông y có tác dụng bổ + Chất chuẩn adenosine (Shanghai Tauto thận, bổ khí điều trị các trường hợp mệt Biotech Co., Ltd. Trung Quốc). mỏi, mồ hôi về đêm, giảm năng lực tình + Ethanol 96, methanol... đạt tiêu chuẩn dục, tăng đường huyết, tăng mỡ máu, vô tinh khiết phân tích. lực sau khi ốm nặng, bệnh phổi, bệnh thận, suy thận, loạn nhịp tim và bện gan + Acetonitril, đệm phosphate, nước cất [1, 2]. Nghiên cứu dược lý học hiệu đại 2 lần: đạt tiêu chuẩn phân tích HPLC - Merck. cho thấy: Đông trùng hạ thảo có tác dụng - Thiết bị, dụng cụ: cải thiện nhiều hệ thống cơ quan của cơ + Bình chiết siêu âm Soniclean, bộ chiết thể như tuần hoàn, miễn dịch, cơ quan hồi lưu dung môi. tạo máu, tim mạch, phổi và các tuyến nội + Máy HPLC Alliance Water 2695D; tiết trong cơ thể [3, 4]. Cho tới nay, hoạt detector PDA. chất chính trong Đông trùng hạ thảo được xác nhận là nucleoside và adenosine là + Cân phân tích Sartorius có độ chính một chỉ tiêu để đánh giá tiêu chuẩn chất xác 0,1 mg. lượng của Đông trùng hạ thảo [3, 5]. + Bộ lọc hút chân không Alltech (Mỹ). Adenosine có tác dụng dập tắt trạng thái + Màng lọc nylon Sartorius Minisart kích thích của tế bào thần kinh trung kích thước lỗ lọc 0,45 µm. ương và ức chế giải phóng nhiều chất dẫn truyền thần kinh tiền sinap [6, 7]. 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. Để đảm bảo hiệu quả chữa bệnh của - Xây dựng phương pháp định lượng Đông trùng hạ thảo, việc đánh giá chất adenosine trong Đông trùng hạ thảo dựa lượng của Đông trùng hạ thảo rất quan trên đánh giá các thông số: tính tương trọng. Nghiên cứu này tiến hành: Định lượng thích hệ thống, tính đặc hiệu, khoảng adenosine trong Đông trùng hạ thảo tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng, giới hạn nhằm đánh giá chất lượng của loại dược phát hiện và giới hạn định lượng dưới. liệu này. - Qua tham khảo tài liệu [3, 5] và thực nghiệm, chúng tôi xây dựng các điều kiện NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP phân tích HPLC như sau: NGHIÊN CỨU + Hệ thống HPLC. 1. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị. + Detector PDA, tại bước sóng 259 nm. - Dược liệu: Đông trùng hạ thảo do + Chương trình rửa giải isocratic với Phòng Dược và các Hợp chất tự nhiên, hệ pha động acetonitrile/dung dịch đệm Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học Quân phosphate pH 6,5 (tỷ lệ 8/92). sự - Học viện Quân y cung cấp. Mẫu được lưu tại Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học + Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút. Quân sự, Học viện Quân y. + Thể tích tiêm: 10 µl. 19
3. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015 - Dung dịch thử: cân chính xác 2 g bột lọc qua màng 0,45 μm, sau đó, đem phân dược liệu (được nghiền tới kích thước tích sắc ký. thích hợp) cho vào bình hồi lưu, thêm - Dung dịch chuẩn: cân chính xác 10,0 mg chính xác 50 ml methanol 90%, cân bình, chất chuẩn adenosine và hòa tan vào ghi chính xác khối lượng. Tiến hành chiết bằng phương pháp hồi lưu trong 60 phút. bình định mức 10 ml với methanol để được Để nguội, cân lại bình, bổ sung methanol dung dịch chuẩn gốc có nồng độ khoảng 90% đến khối lượng ban đầu. Lắc đều, 1,0 mg/ml (dung dịch A). KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 1. Tính tƣơng thích hệ thống. Đánh giá bằng cách tiêm lặp lại 6 lần một dung dịch chuẩn vào hệ thống sắc ký với điều kiện nêu trên. Kết quả trình bày ở bảng 1 và sắc ký đồ của dung dịch chuẩn adenosine, dịch chiết từ Đông trùng hạ thảo được ghi ở hình 1, 2. Adenosine Hình 1: Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn adenosine. Adenosine Hình 2: Sắc ký đồ của dịch chiết dược liệu. 20
4. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015 Bảng 1: Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký. Nội dung Kết quả Stb = 3978562 Diện tích píc RSD = 0,18% tR,tb = 8,58 phút Thời gian lưu RSD = 0,12% Hệ số bất đối xứng 1,26 Số đĩa lý thuyết 3.600 Kết quả cho thấy hệ thống sắc ký tương thích với mẫu phân tích với RSD của diện tích pic và thời gian lưu đều < 1%. Hình 3: Đồ thị tương quan giữa diện tích 2. Tính đặc hiệu. píc và nồng độ adenosine. Sử dụng detector PDA để đánh giá tính Kết quả cho thấy: trong khoảng nồng đặc hiệu của phương pháp tại thời gian độ khảo sát, diện tích píc và nồng độ lưu píc trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn và adenosine có tương quan tuyến tính chặt mẫu thử, xác định phổ UV-VIS. Kết quả chẽ, R2 = 0,9999. cho thấy: phổ của hai píc giống nhau về hình dạng và số đỉnh hấp thụ cực đại, 4. Độ lặp lại. chứng tỏ phương pháp có tính đặc hiệu cao. Tiến hành xác định độ lặp lại của phương 3. Khoảng tuyến tính. pháp bằng cách định lượng adenosine với 6 thí nghiệm riêng biệt theo phương Để khảo sát khoảng tuyến tính của pháp đã chọn. phương pháp, chúng tôi tiến hành pha một dãy dung dịch chuẩn có nồng độ Bảng 3: Kết quả đánh giá độ lặp lại của 2,40; 6,0; 12,0; 30,0; 60,0; 100,0 µg/ml. phương pháp. Sau đó xác định tương quan diện tích píc Lƣợng Lƣợng Hàm và nồng độ các dung dịch chuẩn. Thứ Đông trùng adenosine lƣợng Thống kê tự hạ thảo (g) (mg) (%) Bảng 2: Sự phụ thuộc của diện tích píc vào nồng độ adenosine chuẩn. 1 2,0001 11,70 0,585 Nồng độ (µg/ml) Diện tích (mAUx min) 2 2,9992 17,13 0,571 Xtb = 0,579% 100,00 6674247 3 2,0024 11,53 0,576 RSD = 0,92% 60,00 3978562 4 2,0015 11,65 0,582 30,00 1989281 5 2,0016 11,69 0,584 12,00 796987 6 2,0023 11,57 0,578 6,00 398494 2,40 160345 Kết quả cho thấy: phương pháp định 2 y = 66682 x - 5338 với R = 0,9999 lượng có độ lặp lại tốt với RSD = 0,92%. 21
5. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015 - Độ đúng. + Nồng độ mẫu thử khoảng 0,8 µg/ml Xác định độ đúng của phương pháp là giới hạn phát hiện. Tại nồng độ này, bằng phương pháp thêm chuẩn. đáp ứng píc mẫu thử có diện tích gấp hơn 3 lần diện tích đáp ứng của mẫu trắng. + Dung dịch chuẩn gốc: hút chính xác 1 ml dung dịch chuẩn (dung dịch A), hòa + Nồng độ mẫu thử khoảng 2,4 µg/ml loãng vào bình định mức 50 ml bằng là giới hạn định lượng dưới. Tại nồng độ này, đáp ứng píc mẫu thử có diện tích methanol, lắc kỹ (dung dịch B). gấp hơn 10 lần diện tích đáp ứng của + Dung dịch thử gốc: tiến hành chuẩn mẫu trắng với độ đúng và độ lặp lại ở bị như phần dung dịch thử. mức có thể chấp nhận khi tiến hành phân + Dung dịch hỗn hợp: hút chính xác tích ở nồng độ này. 5 ml dung dịch thử gốc cho vào bình định mức 10 ml, thêm dung dịch chuẩn gốc KẾT LUẬN (dung dịch B) vừa đủ tới vạch, lắc đều. Nghiên cứu đã xây dựng được phương Lọc dung dịch được qua màng 0,45 µm, pháp định lượng adenosine trong Đông sau đó, dung dịch được phân tích sắc ký. trùng hạ thảo bằng phương pháp HPLC với Tiến hành đo HPLC với điều kiện đã điều kiện sắc ký: cột Phenomenex Genimi nêu trên, lặp lại thực nghiệm với 5 dung RP-C18; pha động: acetonitrile: đệm dịch thử khác nhau. phosphate pH6,5 (8:92); detector: UV tại Bảng 4: Kết quả khảo sát độ đúng. bước sóng 259 nm. Phương pháp định lượng này có sự tương quan tuyến tính Thứ Lƣợng thêm Lƣợng thu hồi Tỷ lệ (%) chặt chẽ giữa diện tích píc và nồng độ tự vào (µg) (µg) thu hồi adenosine trong khoảng nồng độ khảo sát 1 60,00 58,91 98,18 với R2 = 0,9999; độ lặp lại (RSD = 0,92%) 2 60,00 59,23 98,72 và độ đúng (98,18 - 101,07%). Thời gian phân tích một mẫu bằng HPLC là phù hợp 3 60,00 59,52 99,20 (khoảng 15 phút). 4 60,00 60,64 101,07 5 60,00 59,43 99,05 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tỷ lệ (%) thu hồi tb = 99,24%; Thống kê 1. Zhu JS, Halpern GM, Johns K. The RSD = 1,10% scientific rediscovery of an ancient Chinese herbal medicine: Cordyceps sinensis: Part I; Phương pháp định lượng có độ đúng J Alt Comp Med. 1998, 4, pp.289-303. cao với tỷ lệ (%) thu hồi từ 98,18 - 101,07%; 2. Zhu JS, Halpern GM, Johns K. The RSD = 1,10%. scientific rediscovery of an ancient Chinese - Giới hạn phát hiện và giới hạn định herbal medicine: Cordyceps sinensis: Part II; lượng dưới: J Alt Comp Med. 1998, 4, pp.429-457. 22
6. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015 3. SP Li, FQ. Yang, Karl WK. Tsim. Quality Republic of China, Chemical Industry Publishing control of Cordyceps sinensis, a valued traditional House, Beijing. 2005. Chinese medicine, Journal of Pharmaceutical 6. Corradetti R, Lo Conte G, Moroni F, and Biomedical Analysis. 2006, 41, pp.1571- Passani MB, Pepeu G. Adenosine decreases 1584. aspartate and glutamate release from rat 4. Ashok Kumar Panda, Kailash Chandra hippocampal slices. Eur J Pharmacol. 1984, Swain. Traditional uses and medicinal Sep 3, 104 (1-2), pp.190-126. potential of Cordyceps sinensis of Sikkim, 7. C Schmidt, M C Bellingham, D W Richter. J Ayurveda Integr Med. 2011, Jan-Mar, 2 (1), Adenosinergic modulation of respiratory pp.9-13. neurones and hypoxic responses in the 5. The Pharmacopoeia Commission of anaesthetized cat. J Physiol. 1995, Mar 15, PRC (Eds.). Pharmacopoeia of the People’s 483 (Pt 3), pp.769-778. 23