Nghiên cứu đặc điểm hình thái mô u trên chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối ung thư biểu mô tế bào gan người

Nội dung text: Nghiên cứu đặc điểm hình thái mô u trên chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối ung thư biểu mô tế bào gan người

1. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8 - 2013 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI MÔ U TRÊN CHUỘT THIẾU HỤT MIỄN DỊCH MANG KHỐI UNG THƢ BIỂU MÔ TẾ BÀO GAN NGƢỜI Nguyễn Văn Ba* và CS TÓM TẮT Trong nghiên cứu này, chúng tôi ghép tế bào (TB) ung thư gan người dòng Hep 3B2 vào dưới da đùi chuột và tạo khối ung thư phát triển trên chuột thiếu hụt miễn dịch “nude mice”. Kết quả cho thấy chuột hình thành khối u sau 1 tuần ghép 106 TB ung thư Hep 3B. Kích thước khối u phát triển đạt kích thước xấp xỉ 600 mm3 sau 4 tuần ghép TB. Phân tích giải phẫu bệnh lý chứng minh khối u mới tạo thành trên chuột có hình ảnh TB đa diện, tăng sản, nhân quái, nhân chia, một số TB có sắc tố mật. * Từ khóa: Tế bào ung thư gan người dòng Hep 3B; Chuột thiếu hụt miễn dịch; Ghép dị loài. Study on morphological characteristics of tumor tissue in nude mice bearing human hepatocellular carcinoma Summary In this study, we had implanted human hepatocellular carcinoma Hep 3B2 cells into subcutanous thigh of athymic mice. Results showed that mice developed tumor after 1 week of injection Hep 3B cell line with 106 cells/mouse. The size of tumors were 600 mm3 approximately after transplated 4 weeks. The tumor histologic analysis indicated that the tumors contained hyperchromasia, nuclear enlargement with atypia and bile pigments inside cytoplasm. * Key words: Hep 3B; Nude mice; Xenograft. ĐẶT VẤN ĐỀ dày). Phan Thị Phi Phi và CS khám 1.251 BN bị bệnh gan đã phát hiện 193 BN UBTG Ung thư biểu mô tế bào gan (UBTG) là (15,4%), sàng lọc 4.677 người trong quần bệnh ác tính thường gặp. Trong tổng số các thể phát hiện 2 BN UBTG [1]. bệnh nhân (BN) UBTG, châu Á chiếm 70%, Đứng trước thách thức về mức độ ác châu Phi chiếm 12%, trong khi đó châu Âu tính, kháng điều trị của ung thư gan, ngày chỉ có 9% và Bắc Mỹ 2%. Khu vực có tỷ lệ nay người ta đang phát triển các liệu mắc UBTG cao nhất là châu Á, từ 27,6 - pháp và dược chất mới điều trị. Để có thể 36,6 BN/100.000 dân [4]. Ở Việt Nam, ứng dụng kỹ thuật, vật liệu mới trong điều UBTG đứng hàng thứ 3 trong các loại ung trị ung thư, cần phải có mô hình bệnh lý thư (sau ung thư phế quản và ung thư dạ để áp dụng cho thử nghiệm tiền lâm sàng. * Häc viÖn Qu©n y Ng•êi ph¶n håi (Corresponding): NguyÔn V¨n Ba (bsnguyenvanba@yahoo.com) Ngµy nhËn bµi: 27/7/2013; Ngµy ph¶n biÖn ®¸nh gi¸ bµi b¸o: 5/9/2013 Ngµy bµi b¸o ®•îc ®¨ng: 26/9/2013
2. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8 - 2013 Các mô hình ung thư trước đây được môi trường 3 lần/tuần ở điều kiện nhiệt độ 0 tạo ra trên động vật có nguồn gốc đồng loài. 37 C, CO2 5%. Khi TB phát triển đạt 75 - Tuy nhiên, hạn chế của mô hình đó là khối 80% diện tích, tiến hành cấy chuyển sang u không mang đặc tính sinh học giống như chai mới. Trước ghép, rửa TB 2 lần bằng khối u trên người, điều này làm hạn chế dung dịch PBS 1X, sau đó, tách bằng dung trong nghiên cứu cơ chế bệnh lý và áp dịch Trypsin-EDTA 1X. Hút dung dịch TBUT dụng thử nghiệm điều trị cho các loại ung đã chuẩn bị, bơm tiêm 1 ml với số lượng thư người. 107/ml. Cố định chuột nude và tiêm 0,1 ml 6 Do vậy, yêu cầu cấp thiết là cần phải có vào dưới da đùi phải (10 TB/chuột). Quá mô hình động vật bị ung thư mang đặc tính trình thao tác thực hiện trong điều kiện vô sinh học ung thư là nguyên bản của TB ung trùng tuyệt đối. thư người. Để phục vụ nghiên cứu tiền lâm * Theo dõi và xác định sự hình thành sàng ung thư gan, chúng tôi tiến hành đề khối ung thư trên chuột: tài này nhằm: Đánh giá đặc điểm hình thái - Đánh giá theo dõi sự phát triển khối u mô u trên chuột thiếu hụt miễn dịch mang tại vị trí tiêm (đùi phải) 2 lần/tuần, bằng khối UBTG người. Nghiên cứu là cơ sở cho quan sát, sờ nắn và đo kích thước khối u việc thử nghiệm các liệu pháp chẩn đoán bằng thước chính xác NSK. điều trị UBTG. - Xác định kích thước khối u: đo theo hai ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP kích thước dài x rộng bằng thước chính xác NGHIÊN CỨU NSK (Nhật Bản), 2 lần/tuần. Xác định kích 1. Đối tƣợng nghiên cứu. thước u theo phương pháp của Yamaura và CS [5]. - 10 chuột nhắt BALB/c thiếu hụt miễn dịch, không có TB lympho T (nude mice, - Theo dõi trọng lượng chuột 2 lần/tuần, Foxn1nu) nhập khẩu từ Công ty Charles- xác định biến đổi trọng lượng chuột giữa River (Hoa Kỳ). các lần cân kế tiếp. - Môi trường nuôi cấy và bảo quản TB: * Xác định hình thái vi thể khối ung thư môi trường EMEM (Eagle's Minimum Essential trên chuột: Medium), Catalog No.30-2003, ATCC được - Sau 4 tuần tiến hành giết chuột, bóc bổ sung 10% FBS và 1% kháng sinh penicillin tách khối u, bảo quản trong dung dịch và streptomycine. formalin 10% trong 24 - 48 giờ. Tiếp theo, - Dòng TB ung thư biểu mô gan Hep khối u được đúc khối paraffin, cắt lát dày 3B2 mua từ Công ty ATCC (Hoa Kỳ). 5 µm, nhuộm HE (Hematoxylin-Eosin) và đọc phân tích kết quả mô ung thư hình thành 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. dưới kính hiển vi quang học. Phân tích đặc * Nuôi cấy và ghép TBUT vào chuột: điểm về hình thái học TB, cấu trúc mô hình Nuôi cấy UBTG người trong môi trường thành, mạch máu, xâm lấn Kỹ thuật EMEM, bổ sung 10% FBS và 1% kháng tiến hành tại Khoa Giải phẫu Bệnh lý, Bệnh sinh penicillin và streptomycine. Mỗi chai viện 103. 2 nuôi cấy diện tích 75 cm được cấy chứa * Xử lý số liệu: sử dụng phần mềm 106 TB. TB được nuôi cấy tăng sinh và thay SPSS15.0.
3. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8 - 2013 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Tế bào ung thư gan người được nuôi 2 1. Kết quả nuôi cấy, tăng sinh tế bào cấy, tăng sinh trong chai 75 cm . Sau 24 ung thƣ gan. giờ gieo TB, TB bắt đầu tăng sinh. Với số Tế bào ung thư gan người được lựa lượng TB gieo ban đầu khoảng 0,3 - 0,4 x 6 chọn là dòng Hep 3B2 do công ty ATCC 10 /chai, diện tích che phủ chai đạt khoảng (Hoa Kỳ) cung cấp. Đây là dòng TB ung thư 25 - 30%. Tốc độ tăng sinh TB cao nhất trong chuẩn quốc tế được nhiều nhà nghiên cứu khoảng 2 - 5 ngày sau gieo. Sau 5 ngày, trên thế giới áp dụng thử nghiệm in vitro và diện tích che phủ chai nuôi lên tới 65 - 70%. in vivo. TB ung thư gan Hep 3B2 là TB biểu Sau thời điểm này, tốc độ tăng sinh TB mô, có tính bám dính tốt, có khả năng tăng chậm lại và đạt 80% diện tích chai nuôi sau sinh nhanh. Để chủ động thời gian nuôi cấy 7 - 8 ngày. Theo khuyến cáo của nhà cung phục vụ cho thử nghiệm in vitro sau này và cấp, lúc này là thời điểm thu hoạch TB để ghép TB lên chuột nude, chúng tôi tiến hành tiến hành thử nghiệm hoặc lưu giữ. Số lượng quan sát tốc độ tăng sinh của dòng TB này. 6 TB mỗi chai nuôi đạt trung bình 10 TB. 2. Theo dõi và xác định sự hình thành khối ung thƣ trên chuột. Kết quả 10 ngày sau ghép TB có 10/10 chuột (100%) hình thành khối u, kích thước khối u đạt 38,4 ± 7,2 mm3. Sau 4 tuần, khối u phát triển đạt kích thước trung bình 585,9 ± 114,9 mm3. Bảng 1: Kích thước khối ung thư gan trên đùi chuột Hình 1: TB ung thư gan khi mới gieo vào Ngµy KÝch th•íc khèi SE môi trường. sau ghÐp u (mm3, n = 10) t_11 38,4 7,2 t_14 74,1 11,4 t_18 108,5 10,7 t_21 218,4 34,7 t_25 383,9 85,3 t_28 585,9 114,9 Dễ dàng nhận thấy, sau khi khối ung thư xuất hiện vào thời điểm 11 ngày sau ghép, Hình 2: Hình ảnh TB ung thư gan người khối này phát triển liên tục theo thời gian Hep 3B2 phủ ~70% diện tích chai nuôi đến khi kết thúc thí nghiệm. Tốc độ phát sau 5 ngày nuôi cấy. triển mạnh khi khối u đạt kích thước khoảng
4. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8 - 2013 200 mm3, tại thời điểm 21 ngày sau ghép TB. Chỉ trong vòng 2 tuần, khối u tăng gần gấp 3 lần kích thước. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng phù hợp với Kubota T (1994) [3]. Sau ghép, kiểm tra vị trí tiêm TB ung thư 2 lần/tuần, liên tục cho tới khi kết thúc, tiến hành làm giải phẫu bệnh lý sau ghép TB khoảng 4 tuần. Khối ung thư gan người phát triển dưới da đùi chuột có màu tím sẫm, khác biệt với các dòng TB ung thư Hình 3: Hình ảnh khối u xâm lấn vào người cùng kích thước. khối cơ đùi (HE x100). Qua kết quả nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ thành công trong tạo khối UBTG người trên chuột thiếu hụt miễn dịch rất cao, đạt 100% tổng số chuột ghép. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của một số tác giả đã công bố: tỷ lệ thành công trong kỹ thuật ghép dị loài từ 85 - 100% [2, 3]. 3. Đặc điểm hình thái vi thể mô u hình thành trên chuột thiếu hụt miễn dịch. Khối u sau khi bóc tách ra khỏi đùi chuột, cắt thành mảnh nhỏ, bảo quản ở -800C, lấy Hình 4: Hình ảnh các TB đa diện xếp thành 3 mảnh bảo quản trong dung dịch formalin đám, giữa là xoang mạch máu (HE x 200). 10% trong 24 - 48 giờ. Sau đó, đúc mảnh mô ung thư trong khối parafin, cắt lát 5 μm, nhuộm HE để phân tích hình ảnh mô bệnh học mô ung thư hình thành trên chuột. Kết quả nghiên cứu giải phẫu bệnh cho thấy cấu trúc của tổ chức sinh thiết gồm TB hình đa diện sắp xếp thành các đám hoặc ổ, giữa chúng là xoang mạch máu. Các TB u có bào tương rộng, nhân không đều, tăng sắc, chất nhân thô, có nhiều nhân quái và nhân chia bất thường. Trong bào tương, Hình 5: Hình ảnh TB u có bào tương rộng, một số TB u có chứa sắc tố mật. U xâm lấn nhân không đều, tăng sắc, chất nhân thô, tổ chức cơ vân. Đây là hình ảnh UBTG biệt có nhiều nhân quái và nhân chia bất hoá thấp, xâm lấn cơ vân. thường (HE x 400).
5. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8 - 2013 Như vậy đã xây dựng thành công mô 2. GG Steel, MJ Peckham. Human tumour hình UBTG người trên động vật thiếu hụt xenografts: A critical appraisal. Br J Cancer. 1980, 41, Suppl, IV, pp.133-139. miễn dịch, đáp ứng tốt cho đòi hỏi trong điều kiện thực tế nghiên cứu về ung thư tại 3. Kubota T. Metastatic models of human cancer xenografted in the nude mouse: the Việt Nam. Các điều kiện nuôi động vật, TB importance of orthotopic transplantation. J Cell đều đáp ứng yêu cầu nghiêm ngặt về vô Biochem. 1994, 56 (1), pp.4-8. khuẩn, tuân thủ theo hướng dẫn của nhà 4. Myron J Tong et al. Surveillance for cung cấp, tổ chức FDA (Hoa Kỳ). hepatocellular carcinoma in patients with chronic viral hepatitis in the United States of America. KẾT LUẬN Journal of Gastroenterology and Hepatology. 2001, 16, pp.553-559. - Đã ghép thành công TB tạo khối UBTG 5. Yamaura et al. Solitary lung tumors and người trên chuột thiếu hụt miễn dịch bằng their spontaneous metastasis in athymic nude kỹ thuật ghép dị loài. mice orthotopically implanted with human non- small cell lung cancer. Neoplasia. 2000, 2, Tế bào UBTG Hep 3B được nuôi cấy, pp.315-324. tăng sinh và phát triển tốt tại phòng thí nghiệm. Với số lượng TB ghép 1 x 106/con, toàn bộ số chuột nude đều phát triển khối u tại vị trí được ghép. Sau khi cấy ghép lên chuột nude, TB ung thư gan đã phát triển thành khối u có kích thước 600 mm3 sau 4 tuần ghép trên chuột nude. - Hình thái vi thể trên tiêu bản nhuộm HE cho thấy mô u có hình ảnh UBTG biệt hoá thấp. Khối u xâm lấn tổ chức cơ vân, có cấu trúc gồm TB hình đa diện sắp xếp thành các đám hoặc ổ, giữa chúng là xoang mạch máu. Các TB u có bào tương rộng, nhân không đều, tăng sắc, chất nhân thô, có nhiều nhân quái và nhân chia bất thường, trong bào tương một số TB u có chứa sắc tố mật. Kết quả này đã chứng minh khối ung thư gan người phát triển trên chuột nude TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Phan Thị Phi Phi và CS. Góp phần nghiên cứu ung thư gan nguyên phát ở Việt Nam, tần suất HBsAg trong huyết thanh người lành và người bị UBTG. Y học Việt Nam. 1993, 171, tr.26-30.
6. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8 - 2013