Nghiên cứu chiết xuất flavonoid toàn phần từ cúc hoa vàng (chrysanthemum indicum l.)

Nội dung text: Nghiên cứu chiết xuất flavonoid toàn phần từ cúc hoa vàng (chrysanthemum indicum l.)

1. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT FLAVONOID TOÀN PHẦN TỪ CÚC HOA VÀNG (Chrysanthemum indicum L.) Nguyễn Trọng Điệp*; Nguyễn Minh Chính* Nguyễn Tùng Linh*; Nguyễn Thanh Hải** TÓM TẮT Nghiên cứu chiết xuất flavonoid từ Cúc hoa vàng (CHV) để bào chế các chế phẩm thuốc. Từ nghiên cứu, đã lựa chọn đƣợc phƣơng pháp chiết xuất với thông số của quy trình: chiết siêu âm tần số 60 MHz; dung môi: ethanol 50%; nhiệt độ: 600C; chiết 2 lần với tỷ lệ dung môi/dƣợc liệu mỗi lần 10/1; thời gian chiết: 60 phút/lần. Hàm lƣợng flavonoid toàn phần đạt 12,54 mg/g (hiệu suất 96,84%), cao hơn gấp 1,3 lần so với phƣơng pháp chiết nóng (900C, 6 giờ, tỷ lệ dung môi/dƣợc liệu 20/1). * Từ khóa: Cúc hoa vàng; Flavonoid toàn phần; Chiết xuất. STUDY ON THE EXTRACTION OF TOTAL FLAVONOIDS FROM FLOS CHRYSANTHEMI INDICI SUMMARY Study on the extraction of flavonoid from flos chrysanthemi indici to prepare drugs. The optimized extraction procedure was as followed: ultrasonic frequency 60 MHz, extraction solvent of 50% ethanol, temperature of 60oC, extracted 2 times with the solvent/solid ratio of 10/1 in 60 minutes/times, total flavonoid extracted was 12.54 mg/g (yield: 96.84%), 1.3 times higher than that of hot extraction (90oC, 6 hours, solvent/herb ratio of 20/1). * Key words: Chrysanthemum indicum L.; Total flavonoid; Ultrasonic extraction. ĐẶT VẤN ĐỀ virut, kháng viêm, giảm đau, hạ sốt, Cúc hoa vàng (Chrysanthemum chống oxy hóa, ức chế sự phát triển của indicum L.) là dƣợc liệu đƣợc trồng tế bào ung thƣ, chống dị ứng, điều chỉnh rộng rãi ở khu vực Đông Á, trong đó có đáp ứng miễn dịch tế bào, dịch thể và Việt Nam. Một số nghiên cứu cho thấy hoạt động thực bào của bạch cầu đơn CHV có tác dụng kháng khuẩn, kháng nhân, ức chế HIV týp 1 nhân lên... [2, 3]. * Học viện Quân y ** Trường Đại học Quốc gia Hà Nội Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Trọng Điệp (nguyentrongdiepqy@yahoo.com.vn) Ngày nhận bài: 1/10/2013; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 15/11/2013 Ngày bài báo được đăng: 20/11/2013 38
2. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 CHV có chứa tinh dầu, flavonoid, đạt tiêu chuẩn DĐVN IV. Nguyên liệu phenolic, polysaccharid, carotenoid, đƣợc sấy khô, nghiền mịn, rây qua rây sesquiterpen, axít amin Trong đó, có cỡ mắt rây 0,315 mm. flavonoid là thành phần hóa học quan - Hóa chất: quercetin chuẩn (Hãng trọng, liên quan đến một số tác dụng Sigma Aldrich, Hàn Quốc); hóa chất chính của CHV [1, 2]. phân tích: methanol, ethanol 96%, AlCl3... Hiện nay, để chiết xuất flavonoid từ đạt tiêu chuẩn phân tích. nguồn nguyên liệu tự nhiên, một số kỹ * Thiết bị, dụng cụ: thuật mới nhƣ chiết xuất với tác động Thiết bị chiết xuất siêu âm: SONY của siêu âm, vi sóng, chiết xuất siêu tới MEDI SM30-CEP (Hàn Quốc), dung hạn đã đƣợc phát triển và ứng dụng, tích bình chiết 30 lít, tần số siêu âm 60 nhằm thay thế cho các kỹ thuật chiết MHz với 8 đầu siêu âm, nhiệt độ chiết xuất thông thƣờng. Do các kỹ thuật này đến 1000C, có thể lựa chọn chế độ chiết có nhiều ƣu điểm nhƣ giảm lƣợng dung xuất và cô đặc khác nhau; máy quang môi tiêu thụ, rút ngắn thời gian chiết, phổ: Specord 40 Analytikjena (Đức). tăng hiệu suất và chất lƣợng của dịch Cân phân tích Mettler Tolendo ML204 chiết [4, 5]. Tuy nhiên, nghiên cứu về (Thụy Sỹ) có độ chính xác đến 0,1 mg. chiết xuất flavonoid từ CHV để ứng dụng vào bào chế thuốc ở Việt Nam 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. chƣa đƣợc công bố, trong khi đây là * Phương pháp định lượng flavonoid nguyên liệu đƣợc sử dụng phổ biến để toàn phần: làm thuốc. Vì vậy, chúng tôi tiến hành Tiến hành theo phƣơng pháp quang nghiên cứu này nhằm: Xây dựng được phổ UV-Vis [8]: quy trình chiết xuất flavonoid từ CHV. - Dung dịch làm phản ứng: dung dịch Kết quả nghiên cứu là tiền đề quan trọng AlCl3 2% pha trong methanol; dung dịch để bào chế dịch chiết góp phần phát triển chuẩn: dung dịch quercetin chuẩn trong các chế phẩm thuốc từ CHV. ethanol 50% nồng độ 20 µg/ml; chuẩn bị NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP dung dịch thử: với mẫu dƣợc liệu, cân NGHIÊN CỨU chính xác 4,0 g bột dƣợc liệu, thêm 200 ml ethanol 50%, chiết soxhlet ở 600C 1. Nguyên liệu và thiết bị. trong 4 giờ, sau đó, thu lấy phần dịch * Nguyên liệu: chiết, bổ sung ethanol 50% vừa đủ 200 - Dƣợc liệu: hoa khô của cây CHV ml, lọc qua màng lọc 0,45 µm, thu lấy (Chrysanthemum indicum L.) thu hái tại phần dịch lọc; với mẫu dịch chiết: lọc bỏ Văn Lâm, Hƣng Yên vào tháng 9 - 2011, 10 ml dịch lọc đầu, lấy phần dịch lọc sau. 41
3. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 - Tiến hành: cho 5 ml dung dịch và nhiệt độ chiết; thông số đầu ra là hàm quercetin chuẩn hoặc mẫu thử trộn đều lƣợng flavonoid toàn phần (mg) chiết với 5 ml dung dịch AlCl3 2%. Sau 30 phút, đƣợc trên 1 g nguyên liệu tính theo công đo mật độ quang ở bƣớc sóng 415 ηm. thức sau: Mẫu trắng là mẫu dung dịch thử hoặc C × n × V × 100 Flavonoid (mg/g) = chuẩn đƣợc thêm cùng lƣợng methanol M × (100-h) nhƣng không có AlCl . Hàm lƣợng 3 C: nồng độ flavonoid toàn phần trong flavonoid toàn phần (mg/g) đƣợc tính dịch chiết tính theo quercetin (mg/ml); theo quercetin chuẩn. V: thể tích dịch chiết (ml); M: khối lƣợng * Phương pháp chiết xuất flavonoid dƣợc liệu (g); n: hệ số pha loãng; h: độ ẩm từ CHV: dƣợc liệu (%). - Phƣơng pháp chiết siêu âm: tiến KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ hành trên thiết bị chiết siêu âm SM30. BÀN LUẬN Cài đặt các thông số về nhiệt độ, thời gian chiết, chế độ làm việc. Khi thiết bị 1. Kết quả định lƣợng flavonoid đạt đƣợc thông số về nhiệt độ, cho nguyên trong CHV. liệu (khoảng 200 g) vào bình chiết trung Bảng 1: Kết quả định lƣợng flavonoid gian đặt trong bể siêu âm, thêm dung môi toàn phần trong CHV. và chiết xuất theo điều kiện xác định cho FLAVONOID HÀM ĐỘ từng thí nghiệm. Sau chiết xuất, thu lấy CHV TOÀN PHẦN ẨM HẤP (mg/g) (g) dịch chiết, lọc và xác định hàm lƣợng (%) THỤ flavonoid toàn phần. Trƣờng hợp chiết (n = 6) 2 lần, sau khi chiết lần 1, thu dịch chiết, 4,07 8,15 0,2843 12,95 ± 0,40 ép kiệt bã, thêm tiếp dung môi lần 2 vào tiếp tục chiết xuất. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử - Phƣơng pháp chiết nóng: tiến hành dụng phƣơng pháp soxhlet để chiết xuất, tƣơng tự nhƣ phƣơng pháp chiết siêu xác định hàm lƣợng flavonoid trong CHV, âm, nhƣng không có tác động của sóng đồng thời là phƣơng pháp chuẩn dùng để siêu âm. đánh giá hiệu suất khi chiết xuất. Kết quả định lƣợng cho thấy: hàm lƣợng flavonoid - Khảo sát các thông số của quy trình: thông số đầu vào là loại dung môi, tỷ lệ toàn phần tính theo quercetin trong CHV là dung môi/dƣợc liệu, số lần chiết, thời gian 12,95 ± 0,40 mg/g theo dƣợc khô kiệt. 42
4. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 2. Kết quả khảo sát phƣơng pháp chiết xuất. Bảng 2: Điều kiện và kết quả chiết xuất flavonoid trong CHV bằng siêu âm và chiết nóng. HIỆU DƢỢC TỶ LỆ DUNG NHIỆT THỜI PHƢƠNG ĐỘ DUNG FLAVONOID SUẤT LIỆU MÔI/DƢỢC ĐỘ GIAN PHÁP CHIẾT ẨM MÔI (mg/g) CHIẾT (g) LIỆU CHIẾT CHIẾT (%) Chiết siêu âm 205,0 10/1 600C 1 giờ 9,72 75,04 0 202,8 Ethanol 10/1 90 C 1 giờ 6,01 46,42 8,76% Chiết nóng 202,2 50% 10/1 900C 6 giờ 8,14 62,83 203,9 20/1 900C 6 giờ 9,75 75,29 Với phƣơng pháp chiết nóng ở 900C, thâm nhập của dung môi vào dƣợc liệu khi lƣợng dung môi gấp 10 lần dƣợc và làm tăng chuyển khối. Do vậy, làm liệu, sau 1 và 6 giờ chiết đƣợc lần lƣợt tăng hiệu suất chiết, rút ngắn thời gian, 6,01 và 8,14 mg/g flavonoid (hiệu suất giảm nhiệt độ, giảm lƣợng dung môi 46,42 và 62,83%). Khi tăng lƣợng dung tiêu thụ [4, 5]. môi lên gấp 20 lần, sau 6 giờ chiết đƣợc Từ kết quả khảo sát trên, chúng tôi 9,62 mg/g flavonoid (hiệu suất 74,32%). lựa chọn phƣơng pháp chiết siêu âm để Khi chiết siêu âm ở 600C với lƣợng khảo sát tiếp các thông số của quy trình dung môi gấp 10 lần dƣợc liệu, sau 1 giờ chiết xuất nhƣ: loại dung môi, tỷ lệ dung chiết đƣợc 9,72 mg/g flavonoid (hiệu môi/dƣợc liệu, số lần chiết, nhiệt độ và suất 75,04%). Nhƣ vậy, sự tác động của thời gian chiết xuất. sóng siêu âm đã làm tăng lƣợng flavonoid chiết đƣợc, rút ngắn thời gian chiết, 3. Khảo sát lựa chọn các thông số giảm nhiệt độ và lƣợng dung môi so với quy trình chiết xuất. phƣơng pháp chiết nóng. Vai trò của * Ảnh hưởng của dung môi chiết xuất: sóng siêu âm là tạo ra hiệu ứng vật lý và cơ học, dẫn đến phá vỡ màng tế bào, Tiến hành chiết siêu âm CHV 2 lần, tạo điều kiện thuận lợi cho các hoạt chất mỗi lần có tỷ lệ dung môi/dƣợc liệu giải phóng trong dƣợc liệu, làm tăng sự là 10/1 trong 60 phút/lần với dung môi 42
5. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 là nƣớc và ethanol (EtOH) có nồng độ Tiến hành chiết xuất siêu âm CHV khác nhau. với ethanol 50% trong 60 phút, nhiệt độ 600C với số lần chiết và tỷ lệ dung môi/ dƣợc liệu khác nhau. Hình 1: Ảnh hƣởng của dung môi chiết đến hàm lƣợng flavonoid chiết đƣợc. Hình 2: Ảnh hƣởng của số lần chiết và tỷ lệ dung môi/dƣợc liệu đến hàm lƣợng Nồng độ ethanol tăng từ 0 - 50%, đã flavonoid chiết đƣợc. làm tăng đáng kể lƣợng flavonoid chiết (Ghi chú: 1 lần × 10 (20; 30; 40; 50): đƣợc. Nhƣng khi tiếp tục tăng nồng độ chiết lần 1 với tỷ lệ dung môi gấp 10 lần ethanol lên 60, 70 và 80%, lƣợng flavonoid dược liệu (20; 30; 40; 50); 2 lần × 10 × 10 chiết đƣợc lại hơi giảm xuống. Lƣợng (7,5; 5): chiết lần 2 với tỷ lệ dung môi flavonoid chiết đƣợc tăng thể hiện rõ lần 1 gấp 10 và lần 2 gấp 10 lần dược nhất ở lần chiết 1. Ở lần chiết thứ 2, liệu (7,5; 5)). lƣợng flavonoid chiết đƣợc tăng dần khi Chiết 1 lần với tỷ lệ dung môi/dƣợc tăng nồng độ ethanol từ 0 - 50%, sau đó liệu tăng dần từ 10 - 50 lần đã làm tăng giảm dần khi nồng độ ethanol tăng dần. lƣợng flavonoid toàn phần chiết đƣợc, Sau 2 lần chiết, lƣợng flavonoid chiết đặt biệt, khi tỷ lệ này tăng trong khoảng đƣợc cao nhất khi chiết với dung môi từ 10 - 30 lần. Khi tỷ lệ dung môi/dƣợc ethanol 50%. Điều này có thể do ethanol liệu tăng trên 30 lần (40 và 50 lần), 50% có khả năng hòa tan flavonoid tốt flavonoid chiết đƣợc tăng lên không đáng kể. Khi chiết 2 lần, lần thứ nhất với hơn cả dạng aglycol và glycosid trong cùng tỷ lệ dung môi/dƣợc liệu là 10/1, CHV, làm tăng tổng lƣợng flavonoid nhƣng lần thứ 2 lần lƣợt là 10/1, 7,5/1 và trong dịch chiết. Từ kết quả trên, chúng 5/1 đã làm giảm dần lƣợng flavonoid tôi lựa chọn dung môi là ethanol 50% để toàn phần chiết đƣợc. Trƣờng hợp khi khảo sát tiếp. chiết xuất với cùng tỷ lệ dung môi/dƣợc * Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi dược liệu, nhƣng chia làm 2 lần chiết (tỷ lệ liệu và số lần chiết: mỗi lần là 10/1) thu đƣợc 12,54 mg/g 43
6. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 flavonoid, cao hơn so với chiết 1 lần với flavonoid toàn phần chiết đƣợc tăng toàn bộ lƣợng dung môi (12,01 mg/g lên không đáng kể, lần lƣợt là 12,59 và flavonoid). Từ kết quả khảo sát trên, 12,66 mg/g (hiệu suất đạt 97,21 và chúng tôi lựa chọn 2 lần chiết xuất với 97,75%). Do vậy, chiết xuất ở nhiệt độ tỷ lệ dung môi/dƣợc liệu mỗi lần là 600C thích hợp nhất. 10/1/lần, vì lƣợng dung môi sử dụng ít, * Ảnh hưởng của thời gian chiết xuất: nhƣng cho hiệu suất chiết cao (đạt 96,84%). Tiến hành chiết siêu âm CHV với Còn khi tỷ lệ dung môi/dƣợc liệu tăng ethanol 50% ở 600C, chiết 2 lần, tỷ lệ lên 30, 40 và 50 lần, tốn nhiều dung môi dung môi/dƣợc liệu là 10/1/lần với thời hơn, trong khi hiệu suất chiết tăng lên gian chiết khác nhau. không đáng kể, lần lƣợt là 97,98, 98,38 và 98,77%. * Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết xuất: Tiến hành chiết siêu âm CHV với ethanol 50% trong 60 phút, chiết 2 lần với tỷ lệ dung môi/dƣợc liệu của mỗi lần là 10/1, khảo sát nhiệt độ chiết từ 40 - 800C. Hình 4: Ảnh hƣởng của thời gian chiết xuất đến hàm lƣợng flavonoid chiết đƣợc. Thời gian chiết ảnh hƣởng đến tổng lƣợng flavonoid chiết đƣợc sau 2 lần chiết, trong đó, lƣợng flavonoid chiết đƣợc cao nhất sau 60 phút (12,54 mg/g), Hình 3: Ảnh hƣởng của nhiệt độ chiết nhƣng khi tăng thời gian chiết lên đến hàm lƣợng flavonoid chiết đƣợc. 90 phút/lần đã làm giảm nhẹ lƣợng Khi tăng nhiệt độ đã làm tăng lƣợng flavonoid chiết đƣợc (12,13 mg/g). Kết flavonoid chiết đƣợc, đặc biệt trong quả này đƣợc giải thích: sau 60 phút khoảng 40 - 600C. Ở 400C, lƣợng flavonoid chiết, nồng độ flavonoid trong dịch chiết toàn phần chiết đƣợc đạt 11,02 mg/g đã đạt mức cao nhất, khi kéo dài thời (hiệu suất 85,06%), nhƣng khi tăng nhiệt gian chiết đã không làm tăng nồng độ độ lên 600C, đã làm tăng đáng kể lƣợng của flavonoid trong dịch chiết mà còn flavonoid chiết đƣợc (12,54 mg/g, hiệu giảm xuống. Một số nghiên cứu đã suất 96,84%). Tuy nhiên, khi tiếp tục chứng minh sóng siêu âm có thể tác tăng nhiệt độ chiết lên 70 và 800C, lƣợng động làm phá vỡ khung cấu trúc của 44
7. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 flavonoid, lƣợng flavonoid chiết đƣợc indicum L.) trồng ở Việt Nam. Tạp chí giảm [6]. Khi chiết lần 1 trong 60 phút, Dƣợc liệu. 2008, tập 13, số 2, tr.56-59. nhƣng lần 2 lần lƣợt là 60, 45 và 30 phút 2. Liang-Yu Wu, Hong-Zhou Gao, Xun-Lei đã làm giảm lƣợng flavonoid chiết đƣợc Wang. Analysis of chemical composition of và khi tiếp tục giảm xuống còn 30 phút Chrysanthemum indicum flowers by GC/MS ở cả lần chiết 1 và 2, làm giảm rõ rệt and HPLC. Journal of Medicinal Plants lƣợng flavonoid chiết đƣợc (10,55 mg/g). Research. 2010, Vol 4 (5), pp.421-426. Nhƣ vậy, lƣợng flavonoid thu đƣợc sau 3. Wenming Cheng et al. Anti-inflammatory 2 lần chiết cao nhất khi thời gian chiết and immunomodulatory activities of the extracts mỗi lần là 60 phút (hiệu suất đạt 96,84%). from the inflorescence of Chrysanthemum Từ khảo sát trên, chúng tôi lựa chọn thời indicum Linne. Journal of Ethnopharmacology. gian chiết xuất flavonoid từ CHV thích 2005, 101, pp.334-337. hợp nhất 60 phút/lần ở cả hai lần chiết. 4. Sukhdev Swami Handa, Suman Preet Singh Khanuja, Gennaro Longo, Dev Dutt KẾT LUẬN Rakesh. Extraction Technologies for Medicinal Đã xây dựng đƣợc quy trình chiết and Aromatic Plants. International Centre xuất flavonoid toàn phần từ CHV với for Science and High tecnology. Trieste, Italy. các thông số sau: chiết siêu âm tần số 60 2008. MHz; dung môi ethanol 50%; chiết 2 5. Guangyan Pan et al. Optimization lần, mỗi lần với tỷ lệ dung môi/dƣợc liệu of ultrasound-assisted extraction (UAE) of 10/1; nhiệt độ chiết: 600C; thời gian flavonoids compounds (FC) from hawthorn chiết: 60 phút/lần; lƣợng flavonoid toàn seed (HS). Ultrasonics Sonochemistry. 2012, phần chiết đƣợc đạt 12,54 mg/g (tƣơng 19, pp.486-490. ứng với hiệu suất chiết 96,84%). Chiết 6. Magdalena Biesaga. Influence of xuất flavonoid từ CHV bằng phƣơng extraction methods on stability of flavonoids. pháp siêu âm rút ngắn đƣợc thời gian, Journal of ChromatographyA. 2011, 1218, giảm lƣợng dung môi tiêu thụ và có hiệu pp.2505-2512. suất cao hơn gấp 1,3 lần so với phƣơng 7. Li Liao et al. Optimization of total pháp chiết nóng (900C, 6 giờ, tỷ lệ dung flavonoid extraction in Callicarpa nudiflora môi/dƣợc liệu 20/1). Hook. Et Arn, using response surface methodology. Journal of Medicinal Plants TÀI LIỆU THAM KHẢO Research. 2012, Vol 6 (37 of King Saud 1. Trần Vân Hiền, Phạm Hồng Minh, University - Engineering Sciences. 2012, Phạm Hoàng Ngọc. Phân lập và nhận dạng pp.1018-3639. một số flavonoid từ CHV (Chrysanthemum 45
8. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 46