Nghiên cứu chế tạo và xác định biểu hiện một số dấu ấn của tế bào gốc trong màng ối người đông khô

Nội dung text: Nghiên cứu chế tạo và xác định biểu hiện một số dấu ấn của tế bào gốc trong màng ối người đông khô

1. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 7-2012 NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO VÀ XÁC ĐỊNH BIỂU HIỆN MỘT SỐ DẤU ẤN CỦA TẾ BÀO GỐC TRONG MÀNG ỐI NGƢỜI ĐÔNG KHÔ Đỗ Minh Trung*; Trần Hải Anh*; Nguyễn B¶o Tr©n* Toshio Nikaido**; Phạm Văn Trân*** TÓM TẮT Màng ối hiện nay được biết đến với nhiều hữu ích trong công nghệ mô cũng như khả năng ứng dụng trong cấy ghép. Màng ối đóng vai trò như là một màng sinh học giúp làm giảm đau đáng kể ở vết thương bỏng nhê khả năng bám dính, che phủ bề mặt vết thương và nhanh làm lành vết thương. Mục tiêu: tạo được tấm tế bào màng ối đông khô không độc, có thể co giãn, đàn hồi theo nhiệt độ người, dễ sử dụng và như một vật liệu thích hợp che phủ trong điều trị vết thương bỏng. Màng ối sau khi thu thập được xử lý làm sạch, đông khô, đóng gói và khử trùng bằng chiếu xạ., Đánh giá đặc tính sinh học, đặc điểm hình thái của tấm tế bào màng ối tạo được và xác định biểu hiện một số dấu ấn của tế bào gốc (TBG) như Oct4, vimentin, collagen týp I, Ck5, desmin bằng kỹ thuật hóa mô miễn dịch (HMMD). Kết quả cho thấy, tấm tế bào màng ối người đông khô vẫn giữ được đặc tính sinh học. * Từ khóa: Màng ối người; Màng ối người đông khô; Tế bào gốc. PRODUCTION AND CHARACTERIZATION THE EXPRESSION OF STEM CELL MARKERS IN FREEZE-DRIED HUMAN AMNIOTIC MEMBRANE SUMMARY Human amniotic membranes are known to be useful in many tissues engineering as well as applied in transplantation. Amniotic membrane as a biological membrane can significantly reduce pain in the burn wounds due to its ability adhesion, surface coverage and wound healing. The aim of this study was to produce freeze-dried human amniotic membrane which is non-toxic, elastic and easy to use as dressing material in burn wounds treatment. After collecting, the fresh membrance was cleaned, freeze-dried, packaged and sterilized and then irradiatedly sterilized. The product was evaluated on biological and morphological characteristics and tested for expression of some stem cells markers (including Oct4, vimentin, collagen type I, Ck5, desmin) by immunohistochemistry techniques. The results showed that the freeze-dried human amniotic membranes retained its main biological features with the expression of Oct4, vimetin, collagen type I, Ck5, desmin. * Key words: Human amniotic membrane; Freeze-dried human amniotic membrane; Stem cells. * Học viện Quân y ** Trường Đại học Toyama - Nhật Bản *** Bệnh viện 103 Chịu trách nhiệm nội dung khoa học: PGS. TS. Nguyễn Gia Tiến TS.Nguyễn Đặng Dũng 30
2. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 7-2012 ®ÆT VÊN ®Ò chuyên gia nghiên cứu về TBG từ Trường Đại học Toyama (Nhật Bản), chúng tôi tiến Công nghệ mô (Tissue engineering - TE) hành nghiên cứu tạo tấm tế bào màng ối được phát triển bằng việc sử dụng các vật người đông khô (freeze-dried) và xác định liệu sinh học thay thế nhằm khôi phục, duy biểu hiện một số dấu ấn của tế bào trong trì và cải thiện chức năng của mô. Màng ối tấm tế bào màng ối người đông khô tạo được. được Davis sử dụng lần đầu tiên cho cấy ghép da vào năm 1910. Kể từ đó, màng ối ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP được sử dụng rộng rãi như một vật liệu sinh NGHIÊN CỨU học hữu ích trong việc kiểm soát vết bỏng, 1. Đối tƣợng nghiên cứu. vết thương da và loét mạn tính ở chân. 30 mẫu màng ối của các sản phụ mổ đẻ, Màng ối được xem như một nguồn cung bảo đảm tiêu chuẩn xét nghiệm sàng lọc cấp mô hay tế bào phù hợp trong cấy ghép âm tính với HIV, HBV, HCV, giang mai... dựa trên hiệu quả chống viêm và tính sinh Màng ối được thu thập, bảo quản đảm bảo miễn dịch thấp (Hao và CS, 2005). Ghép vô trùng và chuyển về trung tâm nghiên cứu. màng ối đã được sử dụng thành công ở 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. bệnh nhân bị dị tật biểu mô khó lành và * Chuẩn bị màng ối: không đáp ứng với điều trị y khoa. Đối với Nhau thai thu nhận sau ca mổ đẻ được yếu tố sinh miễn dịch, các dấu hiệu lâm đặt vào trong bình bảo quản vô trùng có chứa sàng của thải ghép cấp tính không thấy PBS hoặc môi trường RPMI-1640 lạnh, vận khi ghép màng ối trên những người tình chuyển về trung tâm nghiên cứu trong điều nguyện. Màng ối tươi có thể được bảo kiện nhiệt độ lạnh khoảng 4ºC. Tiến hành quản ở -80°C để sử dụng cho cấy ghép, bóc tách màng ối trong phòng sạch, thời nhưng chỉ được một vài tháng và không gian không quá 4 giờ kể từ khi thu thập. thuận tiện trong vận chuyển, bảo quản và * Tạo tấm tế bào màng ối người đông khô: sử dụng. Hiện nay, tấm tế bào màng ối Cắt màng ối thành từng miếng, nhanh người đông khô đã được ứng dụng điều trị chóng hạ lạnh và bảo quản ở nhiệt độ âm o o lâm sàng tại Nhật Bản và một số nước phát sâu từ -50 C đến -80 C. Sau đó, đưa màng triển khác. So sánh với màng ối tươi, màng ối vào thiết bị đông khô; kết thúc quá trình ối đông khô gần như không thay đổi về cấu đông khô, đóng gói bảo quản, đưa đến cơ sở chiếu xạ; kết thúc quá trình chiếu xạ, trúc, chức năng và rất dễ xử lý khi điều trị kiểm tra độ vô trùng, xác định các marker các tổn thương có kích thước khác nhau. và các thông số khác của các tấm tế bào Màng ối người đông khô đã được ứng dụng màng ối đông khô tạo được. trong điều trị, mang lại kết quả tốt cho bệnh * Xét nghiệm HMMD: nhân. Được sự hỗ trợ kỹ thuật của các 31
3. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 7-2012 Mẫu màng ối sau khi đúc parafin được Nhuộm với hematoxylin tạo nền tương phản cắt mỏng, dán lên lam kính, làm khô ở 45oC. trong 2 phút và rửa tiêu bản với nước cất. Khử parafin trong xylen và cồn trong 10 phút. Khử nước bằng cồn và xylen. Dán lamen Ức chế peroxydase nội bào bằng hydrogen và quan sát, chụp lưu lại hình ảnh trên peroxide 0,03% trong 20 phút. Ủ với kháng kính hiển vi. Kết quả sau khi nhuộm thể đơn clon kháng collagen týp I, desmin, HMMD: âm tính: chỉ có màu xanh tím của Oct3/4, Ck5, Ck18, vimentin và rửa tiêu bản hematoxylin nhuộm nhân; dương tính: nếu bằng PBS. Ủ với kháng thể thứ hai có gắn có hiện diện của kháng nguyên trên tế biotin trong 1 giờ. Ủ với phức hợp streptavidine bào; phức hợp kháng nguyên - kháng thể - peroxydase trong 20 phút. Hiển thị màu với streptavidine màu sẽ cho màu vàng nâu cơ chất DAB. Rửa tiêu bản với nước cất. (màu của DAB). KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 1. Kết quả chế tạo tấm tế bào màng ối đông khô. 30 mẫu màng ối đông khô đã được chế tạo, đóng gói, chiếu xạ, kiểm tra vô khuẩn, độ ẩm và làm tiêu bản nhuộm HE. Kết quả cho thấy, các màng ối đông khô đều âm tính với vi khuẩn và nấm tổng số. Nhuộm HE, kiểm tra màng ối đông khô thấy, màng ối khô vẫn giữ được cấu trúc, rất nhẹ, mỏng và dễ xử lý khi sử dụng. Hình 1: Hình ảnh về tấm tế bào màng ối người đông khô: 32
4. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 7-2012 A: Tấm tế bào màng ối người đông khô; B: Tấm tế bào sau khi ngâm vào nước muối sinh lý 1 phút; C: Nhuộm HE; D: Nhuộm HE (tiêu bản cắt ngang). 2. KÕt qu¶ x¸c ®Þnh biÓu hiÖn mét sè dÊu Ên cña TBG biÓu m« màng èi b»ng kü thuËt HMMD. Xác định TBG biểu mô bằng kỹ thuật HMMD với các dấu ấn của TBG biểu mô. Kết quả cho thấy, tế bào biểu hiện dương tính với dấu ấn của TBG là Oct4, Sox2, SSEA4 và các dấu ấn của tế bào biểu mô vimentin, Ck18; biểu hiện âm tính với desmin. Hình 2: Biểu hiện các dấu ấn Oct4, vimentin, Ck5, collagen týp I, desmin của tấm tế bào màng ối người đông khô xác định bằng kỹ thuật HMMD. Màng ối là một mô có nguồn gốc bào vô mạch. Màng ối là một màng sinh học thai và được cấu tạo bởi 3 màng chính: được ứng dụng nhiều trong cấy ghép, màng biểu mô đơn, màng nền dày và màng muốn sử dụng được, màng ối cần phải 32
5. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 7-2012 được thu thập, xử lý, bảo quản và đảm bảo và có các thành phần như collagen, fibronectin, vô trùng trong tất cả các giai đoạn. Ngân laminin và proteoglycans khác, là thành phần hàng Mô châu Âu, Ngân hàng Mô Hoa Kỳ quan trọng cho tế bào tăng trưởng. Màng ối và FDA đã thiết lập các tiêu chuẩn với việc tươi của người đã được chứng minh và duy trì đặc tính sinh học của mô và giảm xem như một nguồn cung cấp mô hay tế thiểu nguy cơ lây truyền tác nhân gây nhiễm. Ngoài áp dụng các tiêu chí để sàng bào phù hợp trong cấy ghép dựa trên hiệu lọc và lựa chọn, kết quả mẫu xét nghiệm quả chống viêm và tính sinh miễn dịch thấp phải âm tính để đảm bảo tối thiểu nguy cơ (Hao và CS, 2005; Niknejad H và CS, 2008) lây truyền bệnh truyền nhiễm, một số xét [7]. Màng ối người như một băng sinh học, nghiệm vi sinh cũng được thực hiện, các được sử dụng trong nhiều thập kỷ qua với mẫu thử phải âm tính với vi khuẩn và nấm các tiện ích và đặc tính mong muốn trong tổng số. Đối với mẫu màng ối đông khô ứng dụng điều trị bệnh giác mạc và tổn chúng tôi tạo được: có thể do màng ối bị thương do bỏng. nhiễm bởi hệ sinh vật âm đạo ở các ca sinh nở bình thường, do đó, cần tuyển chọn Sử dụng màng ối tươi gặp khó khăn mẫu từ những sản phụ mổ đẻ, sinh một, đủ trong vận chuyển và lưu trữ, trước đây một tháng, bảo đảm tiêu chuẩn xét nghiệm sàng số phương pháp đã được sử dụng để bảo lọc âm tính với HIV, HBV, HCV, giang mai... quản như đông lạnh ở nhiệt độ thấp hoặc Màng ối sau khi đông khô được đóng gói, bảo quản trong glycerol ở nhiệt độ âm sâu, chiếu xạ, kiểm tra vô trùng bằng xét nghiệm nhưng chỉ có thể lưu trữ trong vài tháng và vi sinh, kết quả đều cho âm tính với vi đòi hỏi nhiều thiết bị đắt tiền, cồng kềnh khuẩn và nấm tổng số. Kết quả sau khi như tủ lạnh ở nhiệt độ thấp... Màng ối đông nhuộm HE cho thấy, cấu trúc màng ối khô tạo được có thể khắc phục được không thay đổi so với màng ối tươi. Như nhược điểm này. Để đảm bảo vô trùng và vậy, bằng phương pháp đông khô làm cho an toàn cho sử dụng, việc khử trùng rất tinh thể nước được thăng hoa và chuyển quan trọng. Tuy nhiên, liệu màng ối đông thành thể khí. Phương pháp này giúp màng khô được khử trùng bằng chiếu xạ có giữ tế bào duy trì được kích thước và hình được đặc điểm sinh học hay không? dạng tế bào ban đầu. Màng ối đông khô có Trong khuôn khổ của nghiên cứu này, thể được sử dụng bằng cách ngâm trong chúng tôi sử dụng kỹ thuật HMMD để xác nước muối sinh lý trong 1 - 2 phút (hình 2B), định biểu hiện một số dấu ấn của màng ối màng ối vẫn trong suốt và giữ được đặc đông khô với các dấu ấn Ck5, vimentin, tính đàn hồi, co giãn. collagen týp I, Oct3/4, desmin. Màng ối và Màng ối có nhiều đặc điểm và khả năng tế bào của màng ối người thường biểu hiện các dấu ấn biểu bì như Ca125 và dấu ấn thích hợp để sử dụng trong kỹ thuật mô. biểu mô phổ biến như cytokeratin và biểu Các lớp biểu mô của màng ối bao gồm hiện dương tính với các dấu ấn như desmin, những tế bào có đặc tính của TBG. Theo vimentin (Toda A và CS, 2007) [1]. Nghiên mô tả, những tế bào này biểu hiện dấu ấn cứu của Ilancheran S và CS (2007) [5], của TBG vạn tiềm năng (pluripotent) và có tế bào biểu mô ở màng ối người biểu hiện thể biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác dấu ấn của TBG như Oct4 (octamer binding nhau. Tế bào biểu mô màng ối cũng là một protein 4), NANOG, SOX2 (SRY-related nguồn cung cấp tế bào sử dụng trong công HMG-box gene 2) và REX-1 (Silvia Dı´az- Prado và CS, 2011; Parolini và CS, 2009; nghệ mô. Màng ối như một giá đỡ (scaffold) Miki và CS, 2007, 2005, Toda và CS, 2007) 33
6. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 7-2012 [1, 3, 4]. Kết quả hình 2 cho thấy các dấu ấn 3. Toshio Miki, Keitaro Mitamura, Mark A Ross, Ck5, vimentin, collagen týp I biểu hiện dương Donna B Stolz, Stephen C Strom. Identification of tính mạnh, Oct 3/4 dương tính nhưng yếu stem cell marker-positive cells by immunofluorescence hơn, dấu ấn desmin cho kết quả âm tính. in term human amnion. Journal of Reproductive Immunology. 2007, 75, pp.91-96. Kết quả này cũng phù hợp với nhiều nghiên cứu của các giả khác trên thế giới về đặc 4. Silvia Dı´az-Prado, EmmaMuinos-Lo´pez, điểm của màng ối cũng như màng ối đông TamaraHermida-Go´mez, ClaudiaCicione, M khô. Như vậy, màng ối sau khi đông khô, EstherRendal-Va´zquez, IsaacFuentes-Boquete, Francisco J De Toro, Francisco J Blanco. được chiếu xạ khử trùng, vẫn giữ được Human amniotic membrane as an alternative đặc tính sinh học và lý học. Màng ối đông source of stem cells for regenerative medicine. khô tạo được rất nhẹ, dễ dàng vận chuyển Differentiation. 2011, 1, pp.162-171. và bảo quản. Kết quả bước đầu này mở ra 5. Ilancheran. S, Michalska. A, Peh. G, một hướng mới trong tạo nguồn vật liệu Wallace. EM, Pera. M, Manuelpillai. U. Stem sinh học cho lĩnh vực cấy ghép mô trong cells derived from human fetal membranes tương lai. display multilineage differ-entiation potential. Biol Reprod. 2007, 77, pp.577-588. KẾT LUẬN 6. Parolini. O, Soncini. M, Evangelista. M, Đã tạo được tấm tế bào màng ối người Schmidt. D. Amniotic membrane and amniotic đông khô, tấm tế bào sau khi chiếu xạ đảm fluid-derived cells: potential tools for regeneative medicine. Regen Med. 2007, 4, pp.275-291. bảo độ vô trùng và có biểu hiện dương tính với một số dấu ấn như vimentin, collagen 7. Niknejad. H, Peirovi. H, Jorjani. M Ahmadiani. týp I, Ck5, Oct4. A, Ghanavi. J, Seifalian. AM. Properties of the amniotic membrane for potential use in tissue engineering. Eur Cell Mater. 2008, 15, pp.88-99. TÀI LIỆU THAM KHẢO 8. Insausti. CL, Blanquer. M, Bleda. P, Iniesta. P, Majado. MJ, Castellanos. G, Moraleda. JM. 1. Ayaka Toda, Motonori Okabe, Toshiko The amniotic membrane as a source of stem Yoshida, Toshio Nikaido. The potential of amniotic cells. Histol Histo-pathol. 2010, 25, pp 91-98. membrane/amnion-derived cells for regeneration 9. Haochuan. Li, Jerry. Y Niederkorn, Sudha of various tissues. J Pharmacol Sci. 2007, 105, Neelam, Elizabeth Mayhew, R Ann Word, James pp.215-228. P McCulley, Hassan Alizadeh. Immunosuppressive 2. Kiyotaka Kitagawa, Shuichiro Yanagisawa, factors secreted by human amniotic epithelial Kazuhiko Watanabe, Tatsuya Yunoki, Atsushi cells. IOVS. 2005, 46 (3). Hayashi, Motonori Okabe, Toshio Nikaido. A 10. G. Saraswathy, SE. Noorjahan, S. Chinni hyperdry amniotic membrane patch using a Krishnan, Ganga Adhakrishnan, TP. Sastry. tissue adhesive for corneal perforations and bleb Preparation of hydrogels using human amniotic leaks. American Journal of Ophthalmology. 2009, membrane and their characteration. Trends 148 (3), pp.383-389. Biomater Artif Organs. 2004, 17 (2), pp.31-36. Ngày nhận bài: 16/5/2012 Ngày giao phản biện: 26/7/2012 Ngày giao bản thảo in: 31/8/2012 34
7. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 7-2012 35