Nghiên cứu chế tạo và tinh sạch kháng thể kháng nọc rắn hổ mang Naja Atra

Nội dung text: Nghiên cứu chế tạo và tinh sạch kháng thể kháng nọc rắn hổ mang Naja Atra

1. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2016 NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO VÀ TINH SẠCH KHÁNG THỂ KHÁNG NỌC RẮN HỔ MANG Naja atra Nguyễn Ngọc Tuấn*; Trịnh Thanh Hùng** Đặng Hồng Thanh***; Nguyễn Đặng Dũng* TÓM TẮT Đặt vấn đề: nhiễm độc nọc rắn nếu không được điều trị kịp thời có thể dẫn đến tử vong hoặc để lại di chứng nặng nề, ảnh hưởng lớn đến chất lượng cuộc sống của nạn nhân. Biện pháp điều trị hiệu quả nhất cho bệnh nhân (BN) bị nhiễm độc nọc rắn là huyết thanh kháng nọc rắn (HTKNR) đặc hiệu; tuy nhiên, trước hết cần xác định được loài rắn độc gây ra tai nạn rắn cắn. Vật liệu và phương pháp: chế tạo và tinh sạch 3 kháng thể đặc hiệu nọc rắn hổ mang miền Bắc N. atra nhằm sử dụng làm nguyên liệu phát triển xét nghiệm miễn dịch phát hiện nọc rắn N. atra. Kết quả: đã chế tạo và tinh sạch thành công 2 kháng thể đặc hiệu với nọc rắn hổ mang N. atra từ huyết thanh thỏ và từ l ng đỏ trứng gà được gây miễn dịch (tại Bộ môn Miễn dịch, Học viện Quân y) và tinh sạch 1 kháng thể từ huyết thanh ngựa được gây miễn dịch (do Đài Loan cung cấp). Kết luận: có thể sử dụng các kháng thể sau tinh sạch để phát triển bộ xét nghiệm miễn dịch phát hiện nhanh nọc rắn hổ mang N. atra. * Từ khoá: Nọc rắn; Naja atra; Kháng thể. Study on Production and Purification of Antibodies Specific to Naja Atra Snake Venom Summary Introduction: Snake envenomation, if not promptly treated, may lead to death or severe complications in the snakebite victims. One of the most effective therapies for snakebite victims relies on administration of specific antivenin, once the causal snake species is identified. Current methods of choice for snake venom identification include immunoassay, which needs venom-specific antibodies for its development. Materials and methods: 3 antibodies specific to Naja atra venom antigen were isolated and purified by conventional methods. Results: We have successfully produced and purified 3 antidobies specific to N. atra venom, 2 of which were created by ourselves (at Vietnam Military Medical University) and the other was kindly provided by Center for Toxicology, China Medical University Hospital, Taichung, Taiwan. Conclusions: These 3 antibodies can be utilized as materials for development of rapid immunoassays for N. atra snake venom detection. * Key words: Snake venom; Naja atra; Antibody. * Học viện Quân y ** Bộ Khoa học và Công nghệ *** Viện Y học Phòng không - Không quân Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Ngọc Tuấn (nguyenngoctuanmd@gmail.com) Ngày nhận bài: 28/10/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 24/12/2015 Ngày bài báo được đăng: 29/12/2015 77
2. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2016 ĐẶT VẤN ĐỀ ký miễn dịch cần có ít nhất 2 kháng thể từ 2 loài khác nhau có hiệu giá cao và Rắn độc cắn là một trong những tai đặc hiệu với kháng nguyên nọc rắn. Xuất nạn nguy hiểm thường gặp đối với nông phát từ thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành dân, công nhân lâm trường và bộ đội hoạt nghiên cứu chế tạo kháng thể (IgG, IgY) động dã ngoại. Nhiễm độc nọc rắn nếu và tinh sạch kháng thể sẵn có đặc hiệu không được điều trị kịp thời có thể dẫn với kháng nguyên nọc rắn hổ mang N. atra, đến tử vong hoặc để lại di chứng nặng có thể sử dụng để phát triển bộ xét nề, ảnh hưởng lớn đến chất lượng cuộc nghiệm miễn dịch phát hiện nọc rắn hổ sống của nạn nhân sau khi sống sót. mang N. atra. Xác định chính xác nọc độc của loài rắn gây tai nạn trong cơ thể nạn nhân rắn cắn ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP có ý nghĩa thực tiễn rất quan trọng, vừa NGHIÊN CỨU giúp sơ cấp cứu đúng cách, vừa định hướng lựa chọn đúng loại HTKNR đơn 1. Đối tƣợng, vật liệu nghiên cứu. đặc hiệu để sử dụng, đem lại hiệu quả * Đối tượng nghiên cứu: điều trị cao và an toàn hơn cho nạn nhân - Động vật thí nghiệm: thỏ đực 12 con, [1, 3, 4]. Theo WHO, thuốc điều trị hiệu cân nặng 2 - 2,5 kg chia làm 4 lô; gà mái quả nhất cho BN bị nhiễm độc nọc rắn là trong độ tuổi đẻ trứng 12 con, cân nặng HTKNR [7, 8]. Tuy nhiên, để lựa chọn 1,5 - 2 kg chia làm 4 lô; động vật thí nghiệm HTKNR đặc hiệu, trước tiên cần xác định được Ban Cung cấp Động vật thí nghiệm, loài rắn độc đã gây ra tai nạn rắn cắn. Tại Học viện Quân y cung cấp và nuôi trong miền Bắc, rắn hổ mang N. atra là một điều kiện đủ thức ăn, nước uống trong trong số các loài rắn có tần suất gây tai suốt quá trình tiến hành thí nghiệm. nạn rắn độc cắn và tỷ lệ tử vong do rắn cắn tương đối cao. Đến nay, tại Việt Nam - Huyết thanh ngựa trước và sau khi chưa có báo cáo về việc phát triển kít gây miễn dịch với kháng nguyên nọc rắn phát hiện nọc rắn hổ mang N. atra cho hổ mang N. atra do Trung tâm Độc chất, chẩn đoán loài rắn gây tai nạn rắn cắn. Bệnh viện Đại học Y Trung Hoa, Đài Loan cung cấp (theo Đề tài hợp tác khoa học Nhờ tính đặc hiệu của phản ứng kết Nghị định thư giữa Việt Nam và Đài Loan). hợp kháng nguyên - kháng thể, các phản ứng miễn dịch được coi là những kỹ thuật * Vật liệu nghiên cứu: tốt nhất được sử dụng để phát hiện nọc Nọc tổng số của rắn hổ mang N. atra độc [7]. Nổi bật trong các kỹ thuật miễn do Trại rắn Vĩnh Sơn, Vĩnh Phúc cung dịch chính là xét nghiệm dựa trên nguyên cấp, số lượng 1 g; nọc tổng số của 4 loài lý sắc ký miễn dịch. Tuy nhiên, để phát rắn độc khác (Hổ đất, Lục xanh, Chàm triển được bộ xét nghiệm miễn dịch phát quạp và Hổ chúa) do Trung tâm Nuôi hiện nọc rắn độc dựa trên nguyên lý sắc trồng và Bảo tồn Dược liệu Quân khu 9 78
3. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2016 (Trại rắn Đồng Tâm) cung cấp, số lượng dịch lần đầu với kháng nguyên trộn tá mỗi loại 100 mg. Nọc rắn được thu thập chất Freund hoàn chỉnh, gây miễn dịch bằng phương pháp kích thích cơ học nhắc lại với kháng nguyên trộn tá chất tuyến nọc cho rắn tiết nọc vào cốc sạch Freund không hoàn chỉnh. Khoảng cách (theo quy trình của WHO [9]), tạo hỗn giữa các lần gây miễn dịch 3 tuần. hợp nọc của ít nhất 30 cá thể rắn mỗi Bảng 1: Liều kháng nguyên sử dụng gây loài, không phân biệt giới, có độ tuổi và miễn dịch. kích thước khác nhau nhằm bảo đảm tính đại diện loài. Lô thỏ (T), ô gà (G) T1, G1 T2, G2 T3, G3 T4, G4 Mũi 1 50 75 100 125 Tá chất Freund hoàn chỉnh và Freund Nồng độ Mũi 2 100 150 200 250 không hoàn chỉnh, kháng thể đơn clon kháng kháng IgG thỏ đánh dấu enzym peroxidase, nguyên Mũi 3 100 150 200 250 kháng thể đơn clon kháng IgY gà đánh (g/ml) Mũi 4 100 150 200 250 dấu enzym peroxidase và cơ chất OPD Mũi 5 100 150 200 250 (o-phenylenediamin) (Hãng Sigma). Phương pháp gây miễn dịch: Các hoá chất khác và vật tư tiêu hao - Đối với thỏ: tiêm theo đường tiêm dùng cho gây miễn dịch và phản ứng dưới da dọc 2 bên sống lưng thành nhiều ELISA đều đạt tiêu chuẩn phân tích và mũi, mỗi mũi khoảng 50 l huyền dịch, chính hãng sản xuất cung cấp. tổng thể tích một lần tiêm là 1 ml huyền 2. Phƣơng pháp nghiên cứu dịch. * Chế tạo kháng nguyên từ nọc rắn: - Đối với gà: tiêm trong cơ ngực lớn thành nhiều mũi, mỗi mũi khoảng 50 l Nọc rắn ở dạng đông khô được hoà tan huyền dịch, tổng thể tích một lần tiêm trong dung dịch NaCl 0,9% thành dạng 1 ml huyền dịch. dung dịch có nồng độ 1 mg/ml. Ly tâm dung dịch nọc, thu dịch nổi và lọc vô trùng Lấy máu động vật thí nghiệm trước khi qua màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,22 µm. gây miễn dịch và 7 ngày sau mỗi lần gây Trộn dung dịch nọc với tá chất Freund miễn dịch để phát hiện sự có mặt của theo tỷ lệ 1:1 về thể tích tạo thành huyền kháng thể kháng nọc rắn. Máu thỏ được lấy từ động mạch tai, máu gà lấy từ động dịch kháng nguyên để gây miễn dịch. mạch cánh. Huyền dịch kháng nguyên được chế tạo mới cho mỗi lần gây miễn dịch và được Trứng gà được thu thập 7 ngày sau giữ ở 40C đến khi sử dụng. lần gây miễn dịch thứ ba để phát hiện kháng thể đặc hiệu trong l ng đỏ trứng. * Gây miễn dịch tạo kháng thể kháng nọc rắn: * Kỹ thuật ELISA gián tiếp phát hiện kháng thể kháng nọc rắn trong huyết thanh: Được tiến hành theo quy trình gây miễn dịch nhiều mũi nhắc lại theo mô tả - Kháng nguyên nọc rắn tổng số (nồng của Selvanayagam và CS [6]. Gây miễn độ 20 g/ml pha trong dung dịch đệm 79
4. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2016 carbonate-bicarbonate pH 9,6) được cố - Tách chiết IgY từ trứng gà theo phương định trên bề mặt giếng ELISA bằng phương pháp được Hoàng Trung Kiên và CS mô tả pháp hấp phụ thụ động ở 400C/12 giờ. [5]: tách l ng đỏ trứng khỏi lòng trắng, sau Tiếp đó, bề mặt giếng ELISA được che đó trộn với nước cất lạnh 40C (tỷ lệ 1:9 về phủ (blocking) bằng dung dịch BSA 1%. thể tích) qua đêm; thu dịch nổi, lọc qua giấy - Huyết thanh (thỏ, gà, ngựa) được pha lọc Whatman; dịch lọc được kết tủa phân loãng bậc 2. Nhỏ 100 l huyết thanh đã đoạn lần lượt trong dung dịch amoni sulfat pha loãng vào giếng ELISA đã gắn kháng 25% và 40%; thu cặn, hòa tan trong dung nguyên nọc rắn, ủ trong 30 phút ở nhiệt dịch PBS 1X, tiếp đó thẩm tích (loại bỏ độ phòng. Kháng thể thỏ đặc hiệu với nọc amoni sulfat) trước khi chạy sắc ký trao đổi rắn có mặt trong mẫu huyết thanh được ion. Chế phẩm kháng thể sau tinh sạch phát hiện bằng kháng thể đánh dấu enzym được khảo sát hoạt tính bằng kỹ thuật peroxidase. Sau khi rửa loại bỏ các thành ELISA gián tiếp, đồng thời điện di SDS- phần không gắn kết trong giếng ELISA, PAGE để kiểm tra độ tinh sạch. hoạt tính của enzym peroxidase (thể hiện KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU sự có mặt của kháng thể đặc hiệu kháng nguyên nọc rắn) được khảo sát thông qua 1. Kết quả nghiên cứu chế tạo kháng tác dụng xúc tác của enzym gây đổi màu thể kháng nọc rắn hổ mang N. atra từ cơ chất OPD (bằng cách bổ sung cơ chất thỏ và gà. OPD vào giếng phản ứng). Đo cường độ của phản ứng chuyển màu bằng máy đọc ELISA ở bước sóng 450 nm. Hiệu giá kháng thể trong huyết thanh được tính là độ pha loãng huyết thanh lớn nhất mà tại đó c n cho kết quả dương tính với kháng nguyên nọc rắn. * Đánh giá phản ứng chéo giữa HTKNR với các nọc rắn khác: Phản ứng chéo giữa huyết thanh (thỏ, gà, ngựa) kháng nọc rắn N. atra với nọc rắn khác loài (rắn Hổ đất, Hổ chúa, Chàm quạp và Lục xanh) được khảo sát bằng kỹ thuật ELISA gián tiếp. Kết quả ELISA dương tính thể hiện sự có mặt của kháng thể phản ứng chéo. Hình 1: Biến động hiệu giá kháng thể đặc * Tinh sạch kháng thể: hiệu trên thỏ và gà được gây miễn dịch. - Huyết thanh chứa kháng thể đặc hiệu Kháng thể đặc hiệu bắt đầu xuất hiện được tinh sạch bằng phương pháp sắc ký sau mũi đầu tiên và tăng dần trong quá ái lực (sử dụng cột protein A cho huyết trình gây miễn dịch, đạt cao nhất sau 4 - 5 thanh thỏ, cột protein G cho huyết thanh lần tiêm kháng nguyên. ngựa), sau đó thẩm tích qua đêm ở 40C. 80
5. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2016 2. Kết quả xác định hiệu giá kháng thể đặc hiệu trong HTKNR. Hình 2: Hiệu giá kháng thể đặc hiệu của 3 HTKNR. Hiệu giá kháng thể có trong huyết thanh thỏ (T2, T3) và gà (G3) sau 5 lần gây miễn dịch đều đạt từ 128.000 - 256.000, hiệu giá kháng thể có trong huyết thanh ngựa là 256.000. 3. Phản ứng chéo giữa kháng thể kháng nọc rắn N. atra với kháng nguyên nọc rắn khác loài. 1 2 3 4 (1: nọc rắn Chàm quạp, 2: nọc rắn Lục xanh, 3: nọc rắn Hổ chúa, 4: nọc rắn Hổ đất) Hình 3: Phản ứng chéo giữa kháng thể kháng nọc rắn N. atra với nọc rắn khác loài. 81
6. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2016 Có phản ứng chéo giữa kháng thể (IgG, IgY) kháng nọc rắn N. atra với nọc của các loài rắn khác. Mức độ phản ứng chéo giữa kháng thể kháng nọc rắn N. atra với nọc loài rắn cùng họ cao hơn so với nọc các loài rắn khác họ. 4. Kết quả tách chiết và tinh sạch kháng thể IgG và IgY. IgG thỏ IgG ngựa IgY gà Hình 4: Sắc ký đồ tinh sạch kháng thể IgG và IgY. Hình ảnh sắc ký đồ cho thấy với các kỹ thuật sắc ký ái lực, sắc ký trao đổi ion, chúng tôi đã tách được các kháng thể IgG từ huyết thanh thỏ và ngựa, IgY từ trứng gà. 5. Kết quả điện di kháng thể IgG và IgY sau tách chiết và tinh sạch. Hình 5: Các kháng thể sau tách chiết và tinh sạch. (M: thang protein chuẩn, 1: kháng thể IgG ngựa, 2: kháng thể IgY gà, 3: kháng thể IgG thỏ) Hình ảnh điện di cho thấy, các kháng thể sau tách chiết và tinh sạch đều có độ tinh sạch khá cao. Kích thước các băng tương ứng với kích thước chuỗi nặng và chuỗi nhẹ của IgG và IgY. 82
7. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2016 6. Hoạt tính kháng thể IgG và IgY Nọc rắn là một hỗn hợp nhiều thành sau tách chiết và tinh sạch. phần, trong đó có những thành phần giống nhau giữa nọc các loài rắn khác nhau, đặc biệt giữa các loài rắn cùng họ. Vì vậy, HTKNR của một loài có thể phản ứng chéo với kháng nguyên nọc của loài rắn khác [7]. Phản ứng chéo tạo ra khả năng trung hoà chéo HTKNR trong điều trị, vì vậy trong một số trường hợp, có thể sử dụng HTKNR đặc hiệu của một loài rắn điều trị cho nạn nhân rắn cắn bởi một loài rắn khác cùng họ có mức độ phản ứng chéo mạnh [7]. Tuy nhiên, về phương diện Hình 6: Hoạt tính kháng thể sau tinh sạch. chẩn đoán xác định loài rắn thì phản ứng Có thể thấy, kháng thể IgY từ trứng chéo lại là nguyên nhân dẫn đến hiện gà, IgG từ thỏ và ngựa sau khi tinh sạch tượng dương tính giả và chẩn đoán nhầm [6]. Kết quả nghiên cứu ở hình 3 cho thấy vẫn có hoạt tính đối với kháng nguyên có hiện tượng phản ứng chéo giữa kháng nọc rắn N. atra (ở độ pha loãng 128.000 - thể kháng nọc rắn N. atra với nọc của một 256.000 lần). số loài rắn khác. Mức độ phản ứng chéo của kháng thể với kháng nguyên nọc của BÀN LUẬN loài rắn cùng họ mạnh hơn so với các loài rắn thuộc họ khác. Cụ thể, phản ứng Kết quả nghiên cứu cho thấy các cá chéo giữa kháng thể (IgG, IgY) kháng nọc thể động vật được gây miễn dịch với rắn N. atra với nọc rắn Hổ đất và Hổ chúa kháng nguyên nọc rắn N. atra ở các liều mạnh hơn so với nọc rắn Chàm quạp và khác nhau đều tạo được kháng thể đặc Lục xanh. Kết quả này phù hợp với nghiên hiệu kháng nọc rắn. Trước khi gây miễn cứu của Đỗ Khắc Đại và CS [2]. Điều này dịch, không có động vật nào có kháng thể cho thấy, để chế tạo bộ xét nghiệm miễn tự nhiên kháng nọc rắn. Hiệu giá kháng dịch phát hiện nọc rắn Hổ mang N. atra thể đặc hiệu trong huyết thanh sau 5 lần với độ đặc hiệu cao, cần tiếp tục tinh chế gây miễn dịch dao động từ 128.000 - kháng thể để loại bỏ kháng thể phản ứng 256.000. Như vậy, quy trình gây miễn chéo. dịch chế tạo HTKNR mà chúng tôi áp Ngoài ra, với các phương pháp tách dụng đạt hiệu quả tốt đối với nọc rắn hổ chiết và tinh sạch kháng thể (IgG, IgY) mang N. atra. Kết quả này phù hợp với mà chúng tôi áp dụng, kháng thể thu nghiên cứu của Đỗ Khắc Đại và CS (với được có độ tinh sạch tương đối cao và 4 loài rắn độc thường gặp ở Việt Nam) [2]. vẫn thể hiện hoạt tính kháng thể đặc hiệu 83
8. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2016 với kháng nguyên nọc rắn N. atra ở độ 3. Võ Văn Chi, Nguyễn Đức Minh. Các loài pha loãng 128.000 - 256.000 lần, đáp ứng rắn thông thường ở Việt Nam, rắn làm thuốc và thuốc trị rắn cắn. Nhà xuất bản Khoa học được yêu cầu chế tạo bộ xét nghiệm miễn và Kỹ thuật, tái bản lần thứ hai. 2000, tr.43-100. dịch phát hiện nọc rắn. 4. Trịnh Xuân Kiếm. Rắn cắn tại Việt Nam: Kết quả nghiên cứu 10 năm tại Bệnh viện KẾT LUẬN Chợ Rẫy. Kỷ yếu các báo cáo khoa học tại - Đã tạo được kháng thể đặc hiệu nọc Hội nghị Quốc tế về rắn độc và chăm sóc BN rắn Hổ mang N. atra từ huyết thanh thỏ rắn độc cắn. TP. Hồ Chí Minh. 11 - 1998. và từ l ng đỏ trứng gà bằng quy trình gây 5. Hoàng Trung Kiên, Đỗ Khắc Đại và CS. miễn dịch tiêm dưới da (thỏ), tiêm trong Nghiên cứu chế tạo kháng thể kháng Edwardsiella cơ ngực (gà), nhắc lại nhiều lần cho hiệu ictaluri gây bệnh mủ gan ở cá Tra bằng công giá kháng thể cao sau 5 lần gây miễn dịch. nghệ tạo kháng thể IgY gà. Tạp chí Thông tin - Có phản ứng chéo giữa kháng thể Y Dược. 2010, 3, tr.71-76. kháng nọc rắn Hổ mang N. atra với nọc của 6. Selvanayagam ZE, Gopalakrishnakone P. rắn Hổ đất, Hổ chúa, Lục xanh và Chàm Tests for detection of snake venoms, toxins quạp ở các mức độ khác nhau. and venom antibodies: review on recent trends - Kết hợp các phương pháp thường (1987 - 1997). Toxicon. 1999, 37 (4), pp.565-586. quy tách chiết và tinh sạch kháng thể, đã thu được kháng thể (IgG, IgY) đặc hiệu 7. Selvanayagam ZE, Gnanavendhan SG, Ganesh KA et al. ELISA for the detection of nọc rắn N. atra có độ tinh sạch và hoạt venoms from four medically important snakes tính cao. of India. Toxicon. 1999, 37 (5), pp.757-770. TÀI LIỆU THAM KHẢO 8. Warrell DA. WHO/SEARO Guidelines for The Clinical Management of the Snakebite 1. Bệnh viện Bạch Mai. Số liệu thống kê in Southeast Asian Region. Southeast Asian trên phần mềm quản lý của Trung tâm Chống Journal of Tropical Medicine and Public Health. độc năm 2009. Hà Nội. 2009. 1999, 30, pp.1-85. 2. Đỗ Khắc Đại, Nguyễn Đặng Dũng, 9. World Health Organization. WHO Guidelines Lê Văn Đông. Nghiên cứu chế tạo HTKNR for the production, control and regulation of của bốn loài rắn độc thường gặp ở Việt Nam snake antivenom immunoglobulins. Expert làm nguyên liệu chế tạo xét nghiệm miễn dịch Committee on Biological Standardization. Gevena, chẩn đoán rắn độc cắn. Tạp chí Y - Dược học Switzerland. 2010. Quân sự. 2008, 2, tr.108-113. 84