Nghiên cứu biến đổi siêu cấu trúc phôi người nuôi cấy ngày 5 trước đông lạnh và sau rã đông bằng kỹ thuật thủy tinh hóa

Nội dung text: Nghiên cứu biến đổi siêu cấu trúc phôi người nuôi cấy ngày 5 trước đông lạnh và sau rã đông bằng kỹ thuật thủy tinh hóa

1. t¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 4-2018 NGHIÊN C ỨU BI ẾN ĐỔ I SIÊU C ẤU TRÚC PHÔI NG ƯỜI NUÔI C ẤY NGÀY 5 TR ƯỚC ĐÔNG L ẠNH VÀ SAU RÃ ĐÔNG B ẰNG K Ỹ THU ẬT TH ỦY TINH HÓA Đoàn Th ị H ằng*; Qu ản Hoàng Lâm*; Nguy ễn Thanh Tùng* và CS TÓM T ẮT Mục tiêu: đánh giá s ự thay đổi hình thái siêu c ấu trúc phôi ng ười d ưới kính hi ển vi điện t ử truy ền qua. Đối t ượng và ph ươ ng pháp: nghiên c ứu mô t ả trên 20 phôi ng ười nuôi c ấy ngày 5 (10 phôi t ươ i và 10 phôi sau rã đông). Kết qu ả: d ưới kính hi ển vi điện t ử, màng trong su ốt c ủa phôi b ị bi ến đổ i m ất độ x ốp, không quan sát rõ các s ợi glycoprotein. Nh ững phôi bào s ống sau rã đông ít b ị t ổn th ươ ng, trong bào t ươ ng có m ột s ố điểm thoái hóa h ạt ho ặc xu ất hi ện không bào. Nh ững phôi bào thoái hóa sau rã đông th ấy màng t ế bào b ị co rúm, ty th ể bị bi ến d ạng, l ưới n ội bào giãn r ộng, màng nhân co rúm. Kết lu ận: nh ững phôi s ống sau rã đông r ất ít b ị t ổn th ươ ng. * T ừ khóa: Phôi ng ười; Hình thái siêu c ấu trúc; K ỹ thu ật th ủy tinh hóa. Transformation of Morphological Ultrastructure of Day-Five Human Embryos before Freezing and after Vitrification Technique Summary Objectives: To assess the transformation of human embryological morphological ultrastructure in post-thawing stage under transmission electron microscope (TEM). Subject and methods: The descriptive study was performed on 20 human embryos in day 5 (10 fresh and 10 thawing embryos). Results: Under electron microscope, the zona pellucida of embryos is transformed and loses its porosity; glycoprotein fibers are not clearly visible. Embryos that survived after thawing show little damage; there are some particle degeneration and vacuoles appearance at some points in the cytoplasmic. The degenerative post-thawing embryos show deformed cell membrane and mitochondria, expanded endoplasmic reticulum, and shrunk nuclear membrane. Conclusions: Embryos that survived after thawing show little damage. * Keywords: Human embryo; Morphological ultrastructure; Vitrification technique. ĐẶT V ẤN ĐỀ quá kích bu ồng tr ứng ho ặc không chuy ển được phôi vào t ử cung, đặ c bi ệt khi s ố Th ụ tinh trong ống nghi ệm g ồm quá lượng phôi d ư th ừa đề u là nh ững lý do trình kích thích bu ồng tr ứng, th ụ tinh và ph ải th ực hi ện ph ươ ng pháp đông l ạnh nuôi c ấy phôi. Tuy nhiên, quá trình chuy ển phôi. Do v ậy, đông l ạnh phôi là k ỹ thu ật phôi t ươ i đôi khi không th ực hi ện được do không th ể thi ếu ở m ột trung tâm h ỗ tr ợ niêm m ạc t ử cung ch ưa phù h ợp, h ội ch ứng sinh s ản. * Học vi ện Quân y Ng ười ph ản h ồi (Corresponding): Đoàn Th ị H ằng (hangdt166@gmail.com) Ngày nh ận bài: 10/02/2018; Ngày ph ản bi ện đánh giá bài báo: 14/03/2018 Ngày bài báo được đă ng: 26/03/2018 13
2. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 4-2018 Hi ện nay, đông l ạnh phôi b ằng k ỹ thu ật + K ỹ thu ật làm tiêu b ản cho kính hi ển thu ỷ tinh hoá đang được áp d ụng r ộng rãi vi điện t ử truy ền qua: tiến hành làm tiêu ở nhi ều trung tâm trên th ế gi ới c ũng nh ư bản cho kính hi ển vi điện t ử truy ền qua ở Vi ệt Nam trong b ảo qu ản phôi ng ười. theo ph ươ ng pháp c ủa Hayat M.A (1989) Tuy nhiên, v ẫn ch ưa có nhi ều nghiên c ứu và Nguy ễn Kim Giao (2004) [1, 7]. sâu v ề c ấu trúc, siêu c ấu trúc c ủa phôi Đọc tiêu b ản trên kính hi ển v ị điện t ử tr ước và sau rã đông b ằng k ỹ thu ật thu ỷ truy ền qua JEOL - 1011 có độ phân gi ải 2A°, tinh hoá. Các nghiên c ứu siêu c ấu trúc này điện áp 100 KV, t ại Labo Kính hi ển vi điện giúp đánh giá r ất chính xác t ổn th ươ ng tử - B ộ môn Mô Phôi, H ọc vi ện Quân y. phôi ở m ức độ d ưới t ế bào sau quá trình rã đông, đồng th ời giúp xác đị nh hi ệu qu ả - Tiêu chí đánh giá hình thái siêu c ấu của ph ươ ng pháp đông l ạnh b ằng k ỹ trúc phôi trên kính hi ển vi điện t ử quét và thu ật thu ỷ tinh hoá. Do đó, chúng tôi ti ến kính hi ển vi điện t ử truy ền qua: hành nghiên c ứu đề tài này v ới m ục tiêu: + Mô t ả thay đổ i c ấu trúc màng trong Đánh giá siêu c ấu trúc phôi ng ười nuôi su ốt c ủa phôi tr ước đông l ạnh và sau rã cấy ngày 5 tr ước đông l ạnh và sau rã đông đông trên kính hi ển vi điện t ử truy ền qua. bằng kính hi ển vi điện t ử truy ền qua. + Mô t ả thay đổ i c ấu trúc c ủa màng t ế bào, các b ảo quan trong bào t ươ ng, nhân ĐỐI T ƯỢNG VÀ PH ƯƠ NG PHÁP tế bào c ủa phôi tr ước đông l ạnh và sau rã NGHIÊN C ỨU. đông trên kính hi ển vi điện t ử truy ền qua. 1. Đối t ượng nghiên c ứu. 20 phôi ( được s ự đồng ý c ủa b ệnh KẾT QU Ả NGHIÊN C ỨU nhân [BN]). 10 phôi t ươ i c ủa BN có phôi 1. Siêu c ấu trúc phôi t ươ i. tươ i d ư th ừa nh ưng không có nguy ện v ọng lưu tr ữ phôi, 10 phôi sau rã đông của BN có phôi l ưu tr ữ, nh ưng đã có đủ s ố con, tự nguy ện hi ến phôi cho nghiên c ứu. 1 Tất c ả phôi đều được đánh giá và l ựa 3 ch ọn theo thang điểm c ủa K.Gardner với tiêu chu ẩn sau: 2 * Tiêu chu ẩn l ựa ch ọn: phôi ngày 5 có điểm đánh giá AA, AB, BA, BB. * Tiêu chu ẩn lo ại tr ừ: phôi ngày 5 có điểm đánh giá C. Ảnh 1: Màng trong su ốt c ủa phôi t ươ i 2. Ph ươ ng pháp nghiên c ứu. ngày 5 (TEM - 10.000X). * Các k ỹ thu ật nghiên c ứu: (1: Ranh gi ới màng ZP; 2: Glycoprotein - K ỹ thu ật đông phôi: dạng s ợi; 3: Protein d ạng h ạt) + Quy trình đông l ạnh phôi b ằng k ỹ thu ật Quan sát ở độ phóng đại l ớn (10.000X) th ủy tinh hóa: s ử d ụng quy trình đông lạnh th ấy màng trong su ốt c ủa phôi t ươ i ngày 5, cực nhanh theo ph ươ ng pháp Cryotop c ủa có th ể nhìn r ất rõ glycoprotein d ạng s ợi Masashige Kuwayama (2005) [8]. và h ướng c ủa các s ợi này. 14
3. t¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 4-2018 2 3 4 1 5 Ảnh 2: Tế bào n ụ phôi c ủa phôi t ươ i ngày 5 (TEM - 4.000X). (1: Màng nhân; 2: Nhân t ế bào; 3: Ty th ể; 4: L ưới n ội ch ất; 5: H ạt glycogen) 2 1 3 4 5 Ảnh 3: Tế bào lá nuôi phôi t ươ i ngày 5 (TEM - 4.000X). (1: Nhân t ế bào; 2: H ạt nhân; 3: Ty th ể; 4: L ưới n ội ch ất có h ạt; 5: H ạt glycogen) Quan sát hình ảnh t ế bào trong phôi và t ế bào lá nuôi phôi c ủa phôi t ươ i ngày 5 ở độ phóng đại 4000X th ấy t ế bào có màng, bào t ươ ng, nhân và h ạt nhân rõ, trong bào tươ ng th ấy các bào quan nh ư ty th ể, l ưới n ội ch ất, h ạt glycogen. 15
4. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 4-2018 2. Siêu c ấu trúc phôi s ống sau rã đông. 1 3 2 Ảnh 4: Màng trong su ốt c ủa phôi ngày 5 sau rã đông (TEM - 10.000X). (1: Ranh gi ới màng ZP; 2: Glycoprotein d ạng s ợi; 3: Protein d ạng h ạt) Quan sát màng trong su ốt c ủa phôi ngày 5 sau rã đông ở độ phóng đại 10.000X th ấy màng trong su ốt gi ảm m ật độ điện t ử h ơn so v ới tr ước đông l ạnh, không quan sát th ấy rõ các glycoprotein d ạng s ợi nh ư phôi tr ước đông l ạnh. 2 1 3 4 5 Ảnh 5: Tế bào n ụ phôi c ủa phôi ngày 5 sau rã đông (TEM - 2.000X). (1: Màng nhân; 2: Nhân t ế bào; 3: Ty th ể; 4: L ưới n ội ch ất; 5: Không bào) 16
5. t¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 4-2018 1 2 3 4 5 Ảnh 6: Tế bào lá nuôi c ủa phôi ngày 5 sau rã đông (TEM - 5.000X) (1: Nhân t ế bào; 2: L ưới n ội ch ất; 3: Ty th ể; 4: H ạt glycogen; 5: Màng trong su ốt) Quan sát t ế bào lá nuôi phôi và t ế bào n ụ phôi ngày 5 s ống sau rã đông ở độ phóng đại 1500X th ấy t ế bào đều có màng, bào t ươ ng, nhân, h ạt nhân rõ ràng, màng nhân và màng t ế bào không thay đổi, trong bào t ươ ng có đầy đủ các bào quan nh ư ty th ể, l ưới nội ch ất gi ống nh ư phôi tr ước đông. Tuy nhiên, m ột s ố phôi bào xu ất hi ện không bào trong bào t ươ ng. 3. Siêu c ấu trúc phôi thoái hóa sau rã đông. 3 1 4 2 Ảnh 7: Phôi ngày 5 thoái hóa sau rã đông (TEM - 8.000X). (1: Màng nhân đứt gãy; 2: H ạt nhân; 3: Ty th ể; 4: L ưới n ội ch ất) Phôi ngày 5 thoái hóa sau rã đông quan sát d ưới kính hi ển vi điện t ử truy ền qua th ấy màng nhân t ế bào b ị nh ăn nhúm, có ch ỗ đứt gãy, nhi ều n ếp g ấp, ty th ể bi ến d ạng, ch ất n ền sáng, không quan sát th ấy mào ty th ể, các l ưới n ội ch ất có h ạt giãn r ộng. 17
6. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 4-2018 BÀN LU ẬN - Thay đổi c ấu trúc c ủa các thành ph ần - Thay đổi màng trong su ốt tr ước đông trong bào t ươ ng các t ế bào c ủa phôi: lạnh và sau rã đông: ở phôi t ươ i d ưới độ Quan sát các phôi bào, t ế bào lá nuôi phóng đại 10.000 l ần, quan sát được màng và t ế bào ICM trong phôi s ống sau rã trong su ốt liên t ục, bên trong có nhi ều s ợi đông cho th ấy màng t ế bào còn nguyên sắp x ếp theo các h ướng khác nhau. Ở phôi vẹn, các thành ph ần h ữu hình trong bào sau rã đông, quan sát ở cùng độ phóng tươ ng nh ư: ty th ể, l ưới n ội ch ất, b ộ máy đại, màng trong su ốt v ẫn gi ữ nguyên Golgi, h ạt glycogen; màng nhân, ch ất được tính liên t ục, nh ưng c ấu trúc màng mịn h ơn, t ăng m ật độ điện t ử, do đó khó nhân, h ạt nhân không khác so v ới phôi th ấy rõ các s ợi nh ư tr ước khi đông l ạnh. tr ước đông l ạnh. Trong bào t ươ ng t ế bào Điều này có th ể g ợi ý c ấu trúc c ủa màng xu ất hi ện m ột s ố không bào. Trên phôi b ị trong su ốt có th ể b ị ảnh h ưởng trong quá thoái hóa sau rã đông th ấy màng t ế bào trình đông l ạnh và rã đông. nh ăn nheo, liên k ết gi ữa các t ế bào l ỏng Trên th ực t ế, nhi ều nghiên c ứu t ại Vi ệt lẻo, màng nhân có th ể b ị đứ t đoạn, ty th ể Nam và trên th ế gi ới đã ch ỉ ra phôi sau rã lưới n ội ch ất b ị tr ươ ng ph ồng lên. K ết qu ả đông n ếu được h ỗ tr ợ thoát màng có t ỷ l ệ của chúng tôi t ươ ng t ự nghiên c ứu c ủa làm t ổ và có thai cao h ơn nhóm không có Bettencourt E.M.V (2008) v ề đặ c điểm hỗ tr ợ thoát màng. V ới nhóm được chuy ển siêu c ấu trúc c ủa phôi c ừu t ươ i và sau rã phôi t ươ i, t ỷ l ệ này t ăng không đáng k ể đông b ằng ph ươ ng pháp đông l ạnh ch ậm [4, 9]. Nghiên c ứu c ủa Đoàn Th ị H ằng và trên kính hi ển vi điện t ử truy ền qua: phôi CS (2011) trên 257 phôi sau rã đông cho có ch ất l ượng t ốt sau khi rã đông, ít b ị t ổn th ấy phôi được h ỗ tr ợ thoát màng t ăng th ươ ng, phôi có ch ất l ượng kém khi đông có ý ngh ĩa th ống kê v ề t ỷ l ệ s ống và làm tổ so v ới phôi không được h ỗ tr ợ thoát lạnh phôi s ẽ b ị t ổn th ươ ng nhi ều, các t ổn màng [2]. Wellington P. Martins và CS (2011) th ươ ng ch ủ y ếu th ấy ở ty th ể b ị t ổn th ươ ng, tổng h ợp 28 nghiên c ứu trên 5.507 BN màng nhân có th ể b ị đứ t đoạn, t ế bào chuy ển phôi được h ỗ tr ợ thoát màng. không có m ối liên k ết ch ặt ch ẽ, trong bào Kết qu ả cho th ấy t ỷ l ệ thành công t ăng lên tươ ng có th ể th ấy xu ất hi ện các kho ảng có ý ngh ĩa ở hai nhóm: BN chuy ển phôi tr ống, m ật độ điện t ử gi ảm, đặ c bi ệt xu ất từng th ất b ại nhi ều l ần và BN chuy ển phôi hi ện nhi ều không bào [5]. K ết qu ả này sau rã đông, nh ưng khác bi ệt không có tươ ng t ự m ột s ố tác gi ả nghiên c ứu trên ý ngh ĩa ở nhóm BN chuy ển phôi t ươ i [10]. phôi bò đông l ạnh b ằng k ỹ thu ật đông Điều này g ợi ý, màng trong su ốt c ủa phôi lạnh ch ậm [3]. sau rã đông r ất có th ể b ị bi ến đổ i so v ới phôi t ươ i, tr ở nên “c ứng” h ơn do protein Nh ư v ậy, có th ể nói quá trình đông đông vón trong quá trình đông l ạnh, lạnh làm t ổn th ươ ng t ế bào ở m ột ng ưỡng gây c ản tr ở quá trình phôi thoát màng. nh ất đị nh, đố i v ới nh ững phôi có ch ất Th ực t ế này phù h ợp v ới k ết qu ả nghiên lượng t ốt, còn s ống sau rã đông, c ấu trúc cứu c ủa chúng tôi trên kính hi ển vi điện tế bào ít b ị bi ến đổ i, đặ c bi ệt các thành tử truy ền qua. ph ần quan tr ọng nh ư ty th ể, l ưới n ội ch ất, 18
7. t¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 4-2018 màng nhân và h ạt nhân. Điều này có th ể lâm sàng c ủa chuy ển phôi tr ữ l ạnh, Y h ọc được ch ứng minh b ằng tr ẻ sinh ra t ừ phôi Sinh s ản. Nhà xu ất b ản Y h ọc. 2005, tr.15-18. đông l ạnh hoàn toàn kh ỏe m ạnh nh ư nh ững 4. Balaban B, Urman B, Alatas C, Mercan R, tr ẻ sinh ra t ừ phôi t ươ i [6, 11]. Mumcu A,d Isiklar A. A comparison of four different techniques of assisted hatching. Human KẾT LU ẬN Reproduction. 2002, 17 (5), pp.1239-1243. Nghiên c ứu 20 phôi ng ười nuôi c ấy 5. Bettencourt E.M.V, Bettencourt C.M, ngày 5 tr ước đông l ạnh và sau rã đông Silva J.N.C.E. Ultrastructural characterization dưới kính hi ển vi điển t ử truy ền qua, of fresh and cryoprotected in vivo produced chúng tôi rút ra k ết lu ận: ovine embryos. Theriogenology. 2008, 10 (1016), - Các phôi s ống sau rã đông h ầu nh ư pp.947-958. không thay đổi v ề c ấu trúc so v ới phôi 6. Gvakharia M et al . Comparison of tr ước đông l ạnh: các phôi bào liên k ết r ất post-thawed survival and implantation of ch ặt ch ẽ, đặ c bi ệt thành ph ần c ấu trúc frozen-thawed embryos derived from ICSI vs. quan tr ọng c ủa phôi bào nh ư nhân, màng conventional IVF. Fertility and Sterility. 2004, nhân, l ưới n ội ch ất, ty th ể và màng t ế bào pp.7-17. còn nguyên v ẹn, t ổn th ươ ng duy nh ất là 7. Hayat M.A . Principle anh techniques of xu ất hi ện một s ố không bào. Electron microscopy. Macmillian Press. Hong - Màng trong su ốt gi ảm m ật độ điện t ử Kong. 1989, pp.79-137. so v ới tr ước đông l ạnh, không quan sát rõ 8. Kuwayama M, Vajta G, Ieda S. glycoprotein d ạng s ợi nh ư ở phôi t ươ i. Comparison of open and closed methods for - Phôi thoái hóa sau rã đông b ị bi ến vitrification of human embryos and the dạng, b ề m ặt l ồi lõm không đều. Các t ế climination of potential contamination. Reprod bào c ủa phôi có màng t ế bào nh ăn nhúm, Biomed Online. 2005, 11 (5), pp.608-614. ty th ể bi ến d ạng, ch ất n ền sáng, không 9. Valojerdi M.R, Eftekhari-Yazdi P, quan sát th ấy mào ty th ể, l ưới n ội ch ất Karimian L. Effect of laser zona pellucida giãn r ộng, màng nhân b ị đứ t đoạn, ro rúm. opening on clinical outcome of assisted TÀI LI ỆU THAM KH ẢO reproduction technology in patients with advanced female age, recurrent impantation 1. Nguy ễn Kim Giao. Hi ển vi điện t ử trong failure, or frozen - thawed embryos Fertil Steri. khoa h ọc và s ự s ống. Nhà xu ất b ản Đại h ọc 2008, 90 (1), pp.84-91. qu ốc gia. Hà N ội. 2004, tr.55-169. 10. Wellington P.M . Assisted hatching of 2. Đoàn Th ị H ằng, Nguy ễn Thanh Tùng, human embryos: a systematic review and Qu ản Hoàng Lâm, Nguy ễn Đình T ảo và CS . meta-analysis of randomized controlled trials. Hi ệu qu ả c ủa k ỹ thu ật h ỗ tr ợ phôi thoát màng Human Reproduction Update. 2011, pp.1-6. bằng axít tyrode cho phôi đông l ạnh. T ạp chí Y D ược lâm sàng 108. 2011, 6(6), tr.145-150. 11. WHO. Infecundity, infertiliti and 3. Đặng Quang Vinh, V ươ ng Th ị Ng ọc childlessness in developing countries. Lan. H ồ M ạnh T ường và CS. M ối t ươ ng quan gi ữa ch ất l ượng phôi sau rã đông và t ỷ thai nfertiiti/DHS-CR9.pdf. 2010. 19