Nghiên cứu áp dụng mê lọ nước và thử nghiệm cưỡng bức trên mô hình xuất huyết não thực nghiệm

Nội dung text: Nghiên cứu áp dụng mê lọ nước và thử nghiệm cưỡng bức trên mô hình xuất huyết não thực nghiệm

1. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2014 NGHIÊN CỨU ÁP DỤNG MÊ LỌ NƢỚC VÀ THỬ NGHIỆM CƢỠNG BỨC TRÊN MÔ HÌNH XUẤT HUYẾT NÃO THỰC NGHIỆM Hồ Anh Sơn*; Nguyễn Viết Trung**; Nguyễn Trọng Tài*** TÓM TẮT Mê lộ nƣớc Morris (MWM) đƣợc sử dụng để đánh giá trí nhớ không gian, chỉ huy vận động và bản đồ nhận thức. So sánh với các bài tập không gian khác nhƣ mê lộ chữ T, động vật chỉ cần quyết định chọn rẽ phải hoặc trái. Trong bài tập MWM, động vật cần phải liên tục có quyết định về hƣớng chuyển động của mình. Thử nghiệm cƣỡng bức vận động trên trục quay cũng đƣợc nghiên cứu áp dụng cho mô hình động vật đột quỵ nhằm đánh giá thực chất khả năng vận động của chúng. Để có thể áp dụng các bài tập trên trong nghiên cứu tại Học viện Quân y, chúng tôi tiến hành áp dụng bài tập MWM và cƣỡng bức vận động trên trục quay ở đối tƣợng chuột nhắt bị đột quỵ cho chảy máu não. Kết quả cho thấy có thể sử dụng các bài tập này để phân tích bài học không gian và khả năng vận động trên mô hình chuột nhắt bị xuất huyết não. * Từ khóa: Morris water maze; Mô hình đột quỵ; Chuột nhắt. Applying Morris water maze and forced task on brain haemorrhage mice model Summary The Morris water maze task (MWM) is supposed to measure spatial memory, movement control, and cognitive mapping. Comparing to other spatial tasks such as the t-maze, only requires the mouse to choose left or right. In the Morris water navigation task, the animal needs to decide continually where to go. In order to perform the task, animal do not need to be motivated by food deprivation or electrical shock. Also, forced task was applied for stroke animal model run on rota-rod to evaluate basically mobility. To apply in current study in our university, we tested MWM on the brain haemorrhage mice model. The results showed the MWM could be used to analyze the spatial learning, re-learning and spatial memory on brain haemorrhage mice. * Key words: Morris water maze; Stroke animal model; Mice. ĐẶT VẤN ĐỀ Trong số các mê lộ cạn và mê lộ nƣớc Sử dụng mê lộ để đánh giá khả năng hiện đang đƣợc sử dụng trên thế giới, học và ghi nhớ không gian của động vật mê lộ nƣớc Morris (Morris water maze, gặm nhấm là nội dung thí nghiệm thƣờng MWM) đƣợc lựa chọn với nhiều ƣu điểm dùng trong nghiên cứu sinh lý thần kinh. [1, 2]. Sử dụng trục quay rota-rod cũng là * Học viện Quân y ** Bệnh viện Qu©n y 103 *** Đại học Y Vinh Người phản hồi (Corresponding): Hồ Anh Sơn (hoanhson@yahoo.com) Ngày nhận bài: 20/02/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 05/05/2014 Ngày bài báo được đăng: 26/05/2014
2. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2014 phƣơng pháp đánh giá vận động cƣỡng Chuột đƣợc gây mê bằng nembutal bức thƣờng dùng trên động vật. Cùng với đƣờng phúc mạc với liều 40 mg/kg thể MWM có thể đánh giá khả năng vận động trọng. Cố định chuột trên hệ thống định vị của động vật do bị cƣỡng ép bơi (môi M2009S, một lỗ nhỏ 0,5 mm trên xƣơng trƣờng nƣớc lạnh), trục quay buộc động sọ bên phải, tại vị trí dự định đƣa hóa vật phải vận động để có thể đứng trên chất vào não, khoan với mũi khoan đƣờng trục mà không bị rơi. Do vậy, ứng dụng kính 0,2 mm. Kim tiêm 31G nối với bơm của MWM và phƣơng pháp cƣỡng bức tiêm siêu nhỏ (1 µl) gắn trên hệ thống vận động khá phổ biến trong nghiên cứu thƣớc không gian ba chiều, đƣa chậm vào não tới đích là nhân bèo, theo tọa độ thần kinh nói chung, trí nhớ và vận động trƣớc-sau 1,0; bên 2,0; sâu 3,5 mm (tính nói riêng. Trong nghiên cứu này, chúng từ điểm Bregma). Sau đó, bơm chậm 0,5 tôi tiến hành xây dựng và thử nghiệm µl dung dịch chứa 0,075 đơn vị collagen MWM và vận động cƣỡng bức trên trục vào não. Đóng da đầu lại. Nhỏ kháng sinh quay với động vật bị gây tổn thƣơng não gentamicine 80 mg/ml tại bề mặt xƣơng thực nghiệm do xuất huyết. sọ bộc lộ trong quá trình phẫu thuật. Lô ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP chứng đƣợc tiến hành các bƣớc nhƣ NGHIấN CỨU trên, nhƣng không đƣa kim tiêm và hóa chất vào não [2, 5]. 1. Đối tƣợng nghiên cứu. Cho chuột uống thuốc Não thông lạc Chuột nhắt trắng do Ban Cung cÊp kéo dài 10 ngày sau phẫu thuật với liều ®ộng vật thÝ nghiÖm, Học viện Quân y cung 0,1 ml/10 gr thể trọng (thuốc viên pha nƣớc cấp, không phân biệt giống, khoẻ mạnh, cất thành dung dịch 10%). Thuốc uống qua đạt tiêu chuẩn thí nghiệm, cân nặng 20,0 sonde dạ dày 18G, nhóm chứng và nhóm 2,0 g. Chuột đƣợc nuôi trong điều kiện nhiệt nghiên cứu uống nƣớc cất với thể tích độ 24 ± 20C, ánh sáng tự nhiên, nƣớc và tƣơng đƣơng 0,1 ml/10 gr thể trọng. thức ăn đƣợc nấu chín, bảo đảm theo nhu - Thử nghiệm tại MWM: bài tập này cầu. Quá trình nuôi đƣợc bắt đầu trƣớc khi tiến hành liên tục trong 9 ngày, bắt đầu tiến hành thí nghiệm ít nhất 3 ngày. vào ngày thứ 7 đến ngày thứ 15 sau tổn thƣơng. Nội dung này thực hiện tại MWM. 2. Ph•¬ng ph¸p nghiên cứu. Mê lộ là bể hình tròn có đƣờng kính 80 - Tổng số chuột 30 con, chia đều thành cm, cao 30 cm, sơn đen. Duy trì lƣợng các nhóm: nƣớc trong mê lộ ở mức 20 cm, nhiệt độ + Nhóm chứng: chuột đƣợc phẫu thuật, 18 - 200C trong suốt quá trình thí nghiệm. nhƣng không đƣa hóa chất vào não (xem Một bến đỗ kích thƣớc 8 x 8 cm, làm phẫu thuật gây xuất huyết não). bằng nhựa trong suốt, đặt tại một góc + Nhóm nghiên cứu: chuột đƣợc gây phần tƣ của mê lộ. Toàn bộ chƣơng trình bao gồm bài tập không gian (giai đoạn đột quỵ chảy máu, sử dụng nƣớc cất. học, invisible task) kéo dài 7 ngày, bài tập + Nhóm Não thông lạc: chuột đƣợc gây Probe (trí nhớ không gian, Probe task) đột quỵ chảy máu, điều trị bằng viên nang vào ngày thứ 8 và bài tập học lại (visible Não thông lạc (bài thuốc do Viện Y học task) vào ngày thứ 9. Cổ truyền Quân đội điều chế và sản xuất). - Phẫu thuật gây xuất huyết não:
3. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2014 + Bài tập không gian (Place task): đỗ), chúng đƣợc hƣớng dẫn đến bến đỗ. trong suốt bài tập, bến đỗ luôn đƣợc đặt Khi đến đƣợc đích, cho chuột ở đó 30 cố định tại chính giữa góc phần tƣ của giây. Khoảng cách giữa các lƣợt tập 1 mê lộ nƣớc hƣớng đông nam (phần tƣ phút, trong thời gian này nhanh chóng lau đích), 1,5 cm dƣới mặt nƣớc. Mỗi ngày khô và sƣởi ấm chuột. Toàn bộ quá trình tập bao gồm 3 lƣợt, mỗi lƣợt tập kéo dài chuột tập bài đƣợc ghi lại bằng camera, tối đa 90 giây, bắt đầu từ một trong ba xử lý dữ liệu bằng phần mềm máy tính góc phần tƣ còn lại của mê lộ. Nếu sau theo các tham số: thời gian tập bài, quãng 90 giây, chuột không đến đƣợc đích (bến đƣờng và vận tốc của chuột (hình 1). H×nh 1: Mª lé n•íc - bµi tËp Invislble. + Bài tập trí nhớ không gian (Probe task): trong bài tập này, bỏ bến đỗ ra ngoài, cho chuột bơi trong mê lộ 90 giây một lần duy nhất. Chuột nhớ lại vị trí của bến đỗ và có xu hƣớng bơi lâu hơn tại góc phần tƣ đích (góc có bến đỗ trong những ngày tập trƣớc). Camera và máy tính tự động ghi lại và phân tích thời gian chuột bơi tại mỗi góc phần tƣ của mê lộ theo các mức thời gian 30, 60 và 90 giây (hình 2). H×nh 2: Mª lé n•íc - bµi tËp Probe.
4. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2014 + Bài tập học lại (Visible task): trong bài vòng/phút. Ngày tiếp theo (ngày thứ 6), tập này, một bến đỗ dễ nhận thấy (cao hơn đặt chuột lên trục quay với vận tốc tăng mặt nƣớc 1 cm) đƣợc đặt tại góc phần tƣ dần từ 0 - 40 vòng/phút. Thời gian chuột đối diện (góc tây bắc) với góc phần tƣ đích ở trên trục quay đến khi bị rơi xuống trong những ngày tập trƣớc (góc đông đƣợc tự động ghi lại. Mỗi chuột thử nam). Chuột tập bài 3 lần, mỗi lần 90 giây, nghiệm 3 lần. Ghi lại thời gian ở trên trục khoảng cách giữa các lần tập đều 1 phút. quay lâu nhất để lấy số liệu đánh giá. Các lần tập xuất phát từ các góc phần tƣ - Đánh giá tổn thƣơng não bằng giải khác nhau. Camera và máy tính tự động phẫu bệnh: sau khi thực hiện toàn bộ các ghi lại và phân tích thời gian, vận tốc và bài tập và uống thuốc, gây mê sâu chuột quãng đƣờng bơi của mỗi chuột. bằng nembutal, tiêm phúc mạc 80 mg/kg - Đánh giá khả năng vận động chủ động: thể trọng sau 4 tuần sau khi phẫu thuật. ®o tổng chiều dài quãng đƣờng vận động Sau đó, phẫu tích lấy não chuột rồi ngâm trong 5 phút (tiến hành vào ngày 1, 3 sau vào dung dịch formalin 10% trong 24 giờ. phẫu thuật gây đột quỵ). Đặt mỗi chuột Tiến hành đúc parafin và cắt lát, nhuộm trong hộp nhựa, kích thƣớc 20 x 30 cm và tiêu bản bằng cresyl violet, chụp hình tiêu ghi quá trình vận động trong 5 phút bằng bản dƣới kính hiển vi. §o diện tích tổn camera nối với máy tính. Phần mềm máy thƣơng bằng phần mềm máy tính. tính sẽ tự động phân tích tổng quãng đƣờng di chuyển và vận tốc trung bình của chuột. * Phương pháp xử lý số liệu: - Đánh giá khả năng vận động thụ Các số liệu thu thập đƣợc xử lý bằng động: đặt chuột lên trục quay vào ngày thuật toán one-way ANOVA, phần mềm thứ 5 để làm quen với vận tốc khoảng 4 SPSS (12.0). KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1. Bài tập không gian (Invisible task). 25 600 500 20 400 15 Chứng Chứng NTL 300 NTL NC NC 10 L vận vận tốc (cm/s) quãng đường (cm) quãng 200 5 100 0 0 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 ngày ngày Hình 3: Vận tốc và quãng đƣờng bơi của chuột trong bài tập không gian. Về tốc độ bơi và quãng đƣờng bơi, khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa nhóm chứng với hai nhóm bị gây đột quỵ. Không có sự khác biệt đáng kể về các tiêu chí này giữa nhóm chuột bị xuất huyết Não thông lạc và nhóm nghiªn cứu trong từng ngày bơi kế tiếp nhau.
5. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2014 2. Bài tập trí nhớ không gian (Probe task). Hình 4: Thời gian phân bố tại phần tƣ của MWM trong bài tập Probe. Trong bài tập trí nhớ không gian, chuột ở các lô đều sử dụng thời gian lâu hơn tại phần tƣ đích và không có sự khác biệt có ý nghĩa giữa các lô. Thời gian sử dụng tại phần tƣ đích giảm dần sau 30, 60, 90 giây bơi trong mê lộ nƣớc. Không có sự khác biệt đáng kể về thời gian bơi giữa các nhóm tại phần tƣ đích trong khoảng thời điểm 0 - 30; 30 - 60; 60 - 90 giây.
6. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2014 3. Bài tập không gian học lại (Visible task). NC NTL chứng 0 20 40 60 80 100 120 Hình 5: Quãng đƣờng bơi tới đích của chuột trong bài Visible task. Kết quả không cho thấy sự khác biệt nào giữa các nhóm đối với bài học tại không gian trong mê lộ nƣớc. Các nhóm đều có kết quả tƣơng tự nhau về quãng đƣờng, thời gian và vận tốc bơi. 4. Thời gian và tốc độ chuột vận động tự do trong vòng 5 phút. Ngày 3 Nhãm chøngNC Nhãm NNTL·o th«ng l¹i Nhãm chøng chứng Ngày 1 0 500 1000 1500 2000 2500 cm Hình 6: Chiều dài quãng đƣờng vận động các nhóm chuột Kết quả nghiên cứu cho thấy vào ngày thứ 1 sau gây đột quỵ, nhóm chuột Não thông lạc và nghiên cứu chƣa có sự khác biệt đáng kể về chiều dài quãng đƣờng di chuyển tự do trong vòng 5 phút so với lô chứng. Chiều dài di chuyển của chuột nhóm chứng dài gần gấp 2 lần so với 3 nhóm còn lại. Vào ngày thứ 3 sau đột quỵ, lô dùng thuốc tăng rõ rệt về chiều dài quãng đƣờng di chuyển so với lô nghiên cứu (p < 0,05).
7. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2014 8 7 6 5 Ngày 1 4 cm/s Ngày 3 3 2 1 0 chứng NTL NC Hình 7: Vận tốc trung bình các nhóm chuột. Kết quả nghiên cứu cho thấy tốc độ di chuyển các nhóm chuột bị gây đột quỵ đều tăng lên ở ngày 3 so với ngày 1 sau đột quỵ (p < 0,05). Đồng thời, chuột đƣợc điều trị bằng Não thông lạc có tốc độ nhanh hơn đáng kể so với nhóm không đƣợc điều trị (p < 0,05). 5. Thời gian chuột vận động trên trục quay Rota-rod. NC NTL chứng giây 0 5 10 15 20 25 Hình 8: Thời gian di chuyển trên trục quay Rota-rod. Sau khi gây xuất huyết não 6 ngày, cho chuột lên trục quay Rota-rod để đo thời gian vận động trên trục quay. Lô Não thông lạc có thời gian vận động dài hơn có ý nghĩa thống kê so với lô nghiªn cứu. Chuột lô chứng có thời gian dài hơn đáng kể so với cả 2 lô còn lại (p < 0,05).
8. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2014 6. Thể tích tổn thƣơng. Đây cũng là ƣu điểm của MWM khi đánh giá vận động tổng thể của chuột sau khi THỂ TÍCH TỔN THƢƠNG (mm3) bị gây đột quỵ. Trung bình SE Đối với vận động cƣỡng bức và tự do Nhóm Não thông lạc 8,58 0,34 vận động, kết quả nghiên cứu cho thấy Nhóm nghiên cứu 10,54 0,44 chuột sử dụng thuốc Não thông lạc có cải thiện rõ rệt sau 3 ngày điều trị (tự vận 1 tháng sau gây xuất huyết não và trải động) và sau 6 ngày điều trị (vận động qua 10 ngày điều trị liên tục, đo các tổn cƣỡng bức). Kết hợp với đánh giá tổn thƣơng trên não chuột để đánh giá thể thƣơng giải phẫu bệnh trên não chuột có tích tổn thƣơng. Kết quả cho thấy lô Não thể nhận thấy thuốc Não thông lạc làm thông lạc có thể tích tổn thƣơng giảm có giảm thể tích não tổn thƣơng. Do đó, các ý nghĩa so với lô nghiªn cứu (p < 0,005). chức năng liên quan tới vận động đƣợc cải thiện rõ rệt so với nhóm chứng. BÀN LUẬN Nghiên cứu trƣớc đây trên mô hình xuất Trên cơ sở mô hình xuất huyết não huyết não cũng cho kết quả tƣơng tự về gây bởi đƣa vào não dung dịch chứa phƣơng pháp tiến hành và cải thiện vận enzym collagen, là enzym phân giải động sau khi điều trị bằng An cung ngƣu protein có thể làm tan tổ chức ngoại bào hoàng hoàn [1]. Clark (1998) tiến hành xung quanh mạch máu, đã xây dựng gây xuất huyết não trên chuột nhắt tƣơng thành công trên chuột nhắt trắng [1, 2, 5], tự nhƣ nghiên cứu này và điều trị bằng chúng tôi tiến hành đánh giá khả năng citicoline, kết quả đạt đƣợc cho thấy tổn học và ghi nhớ không gian tại MWM trên thƣơng não ở chuột đƣợc điều trị giảm động vật đột quỵ. Kết quả cho thấy, sử đáng kể so với nhóm chứng. Các chỉ số dụng MWM có thể xác định tốt khả năng vận động của chuột dùng citicoline khác học và ghi nhớ không gian trên chuột biệt rõ rÖt so với chuột không đƣợc điều nhắt bị xuất huyết não thông qua 3 bài tập trị [2]. trong 9 ngày liên tục [3, 4]. Trong môi KẾT LUẬN trƣờng nƣớc, khi chuột chuyển động không để lại dấu vết nhƣ mùi, phân, nƣớc - Thử nghiệm các bài tập học và ghi tiểu, đồng thời các tiếp xúc thân thể với nhớ không gian trên chuột xuất huyết không gian cũng bị hạn chế tối thiểu. Do não, kết quả cho thấy không có sự khác vậy, MWM đƣợc lựa chọn để đánh giá biệt đáng kể nào giữa các nhóm, vì tổn khả năng ghi nhớ không gian thông qua thƣơng đƣợc gây ra tại vùng nhân bèo. sử dụng khả năng định hƣớng chủ yếu - Nhóm xuất huyết não đƣợc điều trị dựa vào cơ quan thị giác. Khi bị đƣa bằng Não thông lạc có thể tích não xuống nƣớc lạnh, chuột bắt buộc phải tổn thƣơng nhỏ hơn so với nhóm dùng vận động để thoát khỏi môi trƣờng nƣớc. nƣớc cất.
9. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2014 TÀI LIỆU THAM KHẢO 3. Morris RGM. Spatial localization does not require the presence of local cues. Learn 1. Hồ Anh Sơn, Nguyễn Minh Hà, Hoàng Motiv. 1981, 12, pp.239-260. Văn Lương. Đánh giá hiệu quả điều trị của thuốc “An cung ngƣu hoàng hoàn” trên mô 4. Morris R. Developments of a water- hình xuất huyết não ở chuột nhắt thực nghiệm. maze procedure for studying spatial learning Tạp chí Y - Dƣợc học Quân sự. 2010, số 6. in the rat. J Neurosci Methods. 1984, 11 (1), 2. Clark W, Gunion-Rinker L, Lessov N, pp.47-60. Hazel K, Macdonald RL. Citicoline treatment 5. Rosenberg GA, Mun-Bryce S, Wesley M, for experimental intracerebral hemorrhage in Kornfeld M. Collagenase-induced intracerebral mice. Stroke. 1998, 29, pp.2136-2140. hemorrhage in rats. Stroke. 1990, 21, pp.801-807.
10. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2014