Nghiên cứu ảnh hưởng của ph dung dịch đệm và nồng độ sudan b đối với phản ứng nhuộm lipid bạch cầu người

Nội dung text: Nghiên cứu ảnh hưởng của ph dung dịch đệm và nồng độ sudan b đối với phản ứng nhuộm lipid bạch cầu người

1. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014 NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA pH DUNG DỊCH ĐỆM VÀ NỒNG ĐỘ SUDAN B ĐỐI VỚI PHẢN ỨNG NHUỘM LIPID BẠCH CẦU NGƢỜI Trần Văn Tính* TÓM TẮT Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình nhuộm màu lipid bạch cầu người bằng sudan B. Quy hoạch hóa thực nghiệm theo mô hình mặt hai nhân tố: pH (X1) và nồng độ sudan B (X2); hàm mục tiêu là điểm nhuộm lipid (Y) bằng phần mềm Modde 5.0. Phương trình hồi quy thu được: Y = 362,7 2 2 + 5,2 x X1 -10.5 x X2 - 26,3 x X1 (R = 0,985 với p > 0,95) và điều kiện nhuộm tối ưu: Nồng độ sudan B là 0,20% pha trong dung dịch đệm với pH = 7,42. Hiệu suất nhuộm tốt nhất trong điều kiện tối ưu tìm được 95,10 ± 1,0% (p = 0,95). * Từ khóa: Nhuộm hóa học tế bào; Nhuộm sudan B; Nhuộm lipid. EFFECT OF pH AND B SUDAN SOLUTION ON LIPID STRAINING OF HUMAN LEUKOCYTE SUMMARY 60
2. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014 A research was conducted on the optimal conditions for the lipid of human leukocyte with sudan B solution. Experiments were designed by response surface modeling with two factors: pH (X1) and sudan B concentrate (X2) to target lipid score function; Regression equation presents dependence 2 of lipid score on two factors quoted above as: Y = 362.7 + 5.2 x X1 -10.5 x X2 - 26.3 x X12 (R = 0.985 with p > 0.95) and the optimal conditions of the lipid staining as: pH = 7.42, sudan B 0,20%. The best efficiency of the lipid staining in the above optimal conditions is found to be 95.10 ± 1.0% (p = 0.95). * Key words: Cytochemistry; Sudan B staining; Lipid staining. ĐẶT VẤN ĐỀ phản ứng màu rất khác nhau, bao gồm Lipid có trong tế bào bạch cầu người là khuếch tán vật lý đơn thuần hoặc liên este của axít béo với ancol. Xác định các kết hóa học trực tiếp. Trong các loại lipid này bằng phản ứng màu với nhiều thuốc nhuộm, sudan là một nhóm phẩm loại phẩm màu: dầu đỏ, scharlach R, nhuộm được ưa chuộng để nhuộm lipid rodamin B, nile blue, sudan... Cơ chế của từ vàng (sudan III) đến đen (sudan B) [3]. * Bệnh viện 19-8 Người phản hồi (Corresponding): Trần Văn Tính (tranvantinh@yahoo.com) Ngày nhận bài: 17/06/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 28/07/2014 Ngày bài báo được đăng: 11/08/2014 Đối với máu ngoại vi, phản ứng nhuộm trong bệnh bạch cầu cấp theo tiêu chuẩn sudan B cho kết quả bạch cầu hạt dương FAB [2]. tính mạnh, monoxit dương tính yếu, Chayen (1968) cho rằng, mức độ bắt lymphoxit và hồng cầu âm tính. Trong tủy màu chọn lọc của các thuốc nhuộm đối xương bình thường, các tế bào dòng tủy với lipid phụ thuộc rất nhiều vào bản chất dương tính từ tiền tủy bào đến tế bào lipid và đặc tính của thuốc nhuộm, thuốc trưởng thành, dòng monoxit chỉ dương điều trị, hormon và điều kiện tiến hành tính ở tế bào trưởng thành; mẫu tiểu cầu nhuộm [3]. Phản ứng nhuộm sudan B nói và tiểu cầu dương tính ở các giai đoạn. riêng và nhuộm lipid nói chung có thể cho Trong nhiều trường hợp mắc bệnh bạch kết quả tương đối khác nhau trong từng cầu cấp, có thể phân biệt tương đối rõ điều kiện cụ thể. Vì vậy, việc nghiên cứu dòng tủy và những dòng tế bào khác bằng tìm ra điều kiện tối ưu để tiến hành phản kết quả nhuộm sudan B. Kết quả dương ứng, nhằm đảm bảo tính ổn định về mặt tính sudan B của mẫu bệnh phẩm thường kỹ thuật, nâng cao chất lượng nhuộm và cho kết quả dương tính với kỹ thuật nhuộm giảm chi phí là vấn đề có ý nghĩa khoa học peroxydase. Chính vì vậy, kết quả nhuộm và thực tiễn cần thiết. Mục tiêu của công sudan B là một trong những tiêu chuẩn trình này: Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình được ứng dụng để phân loại thể bệnh nhuộm lipid tế bào bạch cầu người bằng 61
3. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014 phẩm màu sudan B dùng trong xét nghiệm Na2HPO4 0,3% điều chỉnh pH bằng HCl để phân loại dòng tế bào ung thư máu. 0,1 M. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP + Dung dịch nhuộm sudan pha theo NGHIÊN CỨU bảng 1 trong ethanol 96% và đệm phenol- 1. Đối tƣợng, dụng cụ và hóa chất phosphat ở trên theo tỷ lệ 6:4. nghiên cứu. + Dung dịch nhuộm nhân: Giemsa. * Đối tượng nghiên cứu: bạch cầu lấy 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. từ máu của người khoẻ mạnh có chứa * Thiết kế thực nghiệm: lipid. Máu sau khi lấy từ tĩnh mạch, tiến Thí nghiệm được thiết kế theo mô hình hành dàn 14 tiêu bản không qua chống khảo sát mặt mục tiêu (Response Surface đông, để khô trong điều kiện tự nhiên và Modeling - RSM) cụ thể: tổ hợp mặt tâm cố định ngay. (The Central Composite Face - CCF) 2 0 * Dụng cụ: máy ủ nhiệt CW-20G 0 - 50 C, nhân tố trên phần mềm MOD5. Mỗi nhân độ chính xác ± 0,10C, máy đo pH inoLab tố gồm 3 mức: ở tâm (d = 0), ở đỉnh (1) 730 với độ chính xác đến 10-3, cân phân và ở mặt (d). Mô hình gồm 11 thí nghiệm: tích Sartorius TE214S có độ chính xác 10-4, 4 thí nghiệm ở đỉnh, 4 thí nghiệm điểm kính hiển vi Nikon với độ phóng đại 1.000 sao nằm ở mặt không gian mỗi nhân tố lần, pipet tự động của Hãng Thermo kèm và 3 thí nghiệm lặp ở tâm. Thiết kế quy đầu côn 0,2, 1,0 và 10 ml của Hãng Gilson. hoạch hóa thực nghiệm gồm 2 biến là pH * Hóa chất: sudan B (Hãng Sigma- dung dịch đệm (X1) và nồng độ sudan B Aldrich); phenol (Hãng Sigma-Aldrich); theo g/100 ml (X2). Ảnh hưởng của hai axít citric 99,5% (Hãng Sigma-Aldrich); nhân tố này lên hàm mục tiêu (Y) là điểm formaldehyd 37% ACS 99,5% (Hãng nhuộm tuân theo phương trình: Sigma-Aldrich); ethanol 96% (Hãng Y = b + b X + b X + b (X )2 + b (X )2 + b X X Sigma-Aldrich); aceton ACS 99,5% (Hãng 0 1 1 2 2 1 1 2 2 12 1 2 Sigma-Aldrich); Na2HPO4 (Hãng Sigma- Các điều kiện mã hóa để nhập dữ liệu Aldrich); Giemsa (Hãng Sigma-Aldrich). vào chương trình phần mềm (bảng 1): - Pha chế thuốc thử: Bảng 1: Ký hiệu và mức mã hóa thực + Dung dịch cố định tiêu bản: nghiệm. ++ Dung dịch citrat: 25 ml (lấy từ dung dịch 18 mmol axÝt citric + 9 mmol natri citrat -1 0 1 và 12 mmol NaCl trong 1 lít). pH dung dịch đệm X1 7,2 7,4 7,6 ++ Acetone 99,5%: 65 ml. Sudan B (%) X2 0,2 0,3 0,4 ++ Focmaldehyd 37%: 8 ml. + Dung dịch đệm phenol-phosphat với * Kỹ thuật tiến hành nhuộm: pH được pha theo bảng 1: phenol 16% và 62
4. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014 - Cố định tiêu bản trong dung dịch cố Đánh giá bạch cầu trung tính dương tính định tiêu bản ở trên với thời gian 30 giây. thành 5 mức độ: Sau đó, gói và đưa các tiêu bản vào hộp Độ 0: không có hạt bắt màu đen. chống ẩm bảo quản ở nhiệt độ 4 - 80C Độ 1: ít hạt trên nguyên sinh chất, hạt (thời gian bảo quản có thể kéo dài 2 tháng mịn nhỏ, không có hạt trên nhân tế bào. [8]). Độ 2: nhiều hạt to trên nguyên sinh chất, - Nhúng tiêu bản vào dung dịch nhuộm không có hạt trên nhân tế bào. sudan ở trên với nồng độ và pH khác nhau theo quy hoạch thực nghiệm ở bảng 1 trong Độ 3: nhiều hạt to trên toàn bộ tế bào, 30 phút. Sau đó, rửa tiêu bản dưới vòi nền xấu. nước 5 phút, để khô. Độ 4: nhiều hạt to trên toàn bộ tế bào, - Nhuộm nền bằng dung dịch Giemsa nền đẹp. 10% trong 15 phút và để khô. Công thức tính điểm nhuộm: ∑Y (điểm) = - Đọc tiêu bản dưới vật kính dầu với độ Y0 x 0 + Y1 x 1 + Y2 x 2 + Y3 x 3 + Y4 x 4. phóng đại 1.000 lần. Như vậy, phản ứng nhuộm sẽ đạt tối Các vùng có chứa lipid trong nguyên ưu khi toàn bộ tế bào bạch cầu trung tính sinh chất bạch cầu sẽ xuất hiện hạt bắt dương tính ở độ 4, tổng điểm tối đa 400 màu đen. Đối với dòng tủy tế bào càng và hiệu suất đạt 100%. trưởng thành, mức độ dương tính càng mạnh. Đối với dòng lympho bình thường âm tính. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Bảng 2: Kết quả thực nghiệm nhuộm sudan theo theo mô hình khảo sát mặt mục tiêu. X1 X2 X1 X2 8 -1 -1 7.2 0.2 342 1 1 -1 7.6 0.2 355 2 -1 1 7.2 0.4 322 7 1 1 7.6 0.4 335 6 -1 0 7.2 0.3 335 11 1 0 7.6 0.3 340 10 0 -1 7.4 0.2 378 9 0 1 7.4 0.4 355 3 0 0 7.4 0.3 360 4 0 0 7.4 0.3 362 5 0 0 7.4 0.3 364 63
5. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014 Nhập kết quả vào phần mềm Modde 5.0 qua xử lý, được phương trình hồi quy: 2 2 -6 Y = 362,7 + 5,2 x X1 -10.5 x X2 - 26,3 x X1 + 2,7 x X2 -5.53x10 x X1 x X2. * Độ tin cậy thống kê của các biến số: Bảng 3: Hệ số và độ tin cậy thống kê của các hệ số. p ± Constant 362,737 1,45222 1,95E-11 3,73306 X1 5,16673 1,15571 0,006576 2,97085 X2 -10,5 1,15571 0,00027 2,97085 X1*X1 -26,3421 1,7786 2,54E-05 4,57205 X2*X2 2,65793 1,7786 0,195304 4,57205 X1*X2 -3,15E-05 1,41545 1 3,63854 N = 11 Q2 = 0,878 Cond. no. = 3,0822 DF = 5 R2 = 0,985 Y-miss = 0 2 R Adj. = 0,97 RSD = 2,8309 Conf. lev. = 0,95 2 Như vậy, loại bỏ hệ số X2 và X1 x X2 phương trình hồi quy là: Y = 362,7 + 5,2 x X1 - 2 10,5 x X2 - 26,3 x X1 . Phân tích Anova cho thấy phương trình mô tả tương đối tốt kết quả thực nghiệm (hệ số tương quan R2 = 0,985 (p > 0,95)). Chạy chương trình tối ưu thu được điều kiện tối ưu với pH = 7,419 và nồng độ sudan là 0,20 g%, khi đó dự đoán điểm nhuộm đạt 376,1. Kết quả tối ưu hóa được trình bày ở bảng 4 và hình 1, hình 2. 64
6. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014 Bảng 4: Tối ưu hóa theo phương trình hồi quy. 7,4431 0,2 375,782 127 -0,564 7,4203 0,2 376,142 24 -0,687 7,4431 0,2 375,782 127 -0,564 7,4192 0,2 376,142 24 -0,687 7,4445 0,2 375,736 114 -0,55 7,4189 0,2 376,14 24 -0,686 7,4445 0,2 375,736 114 -0,55 7,4445 0,2 375,736 114 -0,55 Hình 1: Sơ đồ đường đồng mức mặt tối ưu. Hình 3: Hình ảnh nhuộm lipid bạch cầu ở điều kiện tối ưu với sudan B. Hình 2: Mặt tối ưu thực nghiệm. BÀN LUẬN Để khẳng định điều kiện tối ưu thu được - Về pH dung dịch đệm: ở trên sẽ cho hiệu suất nhuộm cao nhất, pH của dung dịch nhuộm có vai trò đã tiến hành nhuộm 3 thí nghiệm. quan trọng trong phản ứng nhuộm, quyết Bảng 5: Kết quả thí nghiệm lặp lại ở định tốc độ khuếch tán và giữ nguyên hình điều kiện tối ưu. thái của tế bào cũng như lipid ở trạng thái S è HiÖu tự nhiên. Để phản ứng xảy ra tốt nhất, ®iÓm n g h i Ö m ( dung dịch sudan B được pha chế trong 1 382 95.5% môi trường có độ pH trung tính hoặc kiềm nhẹ, phenol có trong dung dịch đóng 2 380 95.0% vai trò như chất cố định màu [4]. Kết quả 3 379 94.8% thu được của nghiên cứu (pH = 7,42) Trung bình 380,3 95,10% tương đương với công bố của Hayhoe, Sheehan và Storey (pH = 7,4) [1, 3, 4]. Sau khi xử lý dữ liệu bằng chương trình thống kê SPSS 18, thu được khoảng giới - Nồng độ của sudan B: hạn hiệu suất nhuộm trung bình khá cao: Nồng độ sudan B quyết định khả năng 95,10% ± 1,0 (p = 0,95). khuếch tán từ dung môi vào tổ chức mỡ. Sudan B nhuộm màu lipid theo 2 cơ chế: khuếch tán vật lý đơn thuần và liên kết hóa học. 2 nhóm amino của sudan B phản 65
7. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014 ứng với các nhóm axít của lipid. Nồng độ TÀI LIỆU THAM KHẢO sudan B (0,20 g%) tối ưu thu được nhỏ 1. Viện Huyết học-Truyền máu. Kỹ thuật xét hơn 18,9 lần so với kết quả của Hayhoe nghiệm Huyết học-Truyền máu. NXB Y học. Hà [1, 3, 4]. Nội. 1984. KẾT LUẬN 2. Bennett JM, Catovsky D, Daniel MT, et al. Qua nghiên cứu thực nghiệm theo mô Proposals for the classification of the acute leukaemias, French-American-British (FAB) hình khảo sát mặt mục tiêu 2 biến số, đã co-operative group. J. Haematol. 1976, 33 (4), tìm được điều kiện tối ưu của phản ứng pp.451-458. nhuộm sudan B: pH dung dịch đệm nhuộm 3. F.G.J. Hayhoe & D. Quaglino. Haematological bằng 7,419 và nồng độ sudan B là 0,2%. cytochemistry, Churchill Livingstone, London. Quy trình tìm được đạt hiệu suất nhuộm 1994. 95,10% ± 1,0 (p = 0,95), tạo điều kiện để 4. Sir John V. Dacie; S.M Lewis. Practical có thể triển khai rộng kỹ thuật này trong Haematology. Longman Group Ltd, Hong Kong. phòng xét nghiệm huyết học ở Việt Nam 1994. với giá thành thấp. 66