Một số hợp chất flavonoid phân lập từ lá cây dâu (Morus alba L.) thu hái tại tỉnh Thái Nguyên

Nội dung text: Một số hợp chất flavonoid phân lập từ lá cây dâu (Morus alba L.) thu hái tại tỉnh Thái Nguyên

1. Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 1 (2017) 45-50 Một số hợp chất flavonoid phân lập từ lá cây dâu (Morus alba L.) thu hái tại tỉnh Thái Nguyên Vũ Đức Lợi1,*, Đỗ Thị Nghĩa Tình1, Bùi Thị Xuân1, Vũ Kiều Oanh2, Trịnh Nam Trung2, Nguyễn Tiến Vững3 1Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, 144 Xuân Thủy, Cầu Giấy, Hà Nội, Việt Nam 2Học viện Quân y, số 160 Phùng Hưng, Hà Đông, Hà Nội, Việt Nam 3Viện Pháp y Quốc gia, số 41 Nguyễn Đình Chiểu, Hai Bà Trưng, Hà Nội, Việt Nam Nhận ngày 3 tháng 4 năm 2017 Chỉnh sửa ngày 21 tháng 4 năm 2017; Chấp nhận đăng ngày 14 tháng 6 năm 2017 Tóm tắt: Từ lá của cây dâu (Morus alba L.) thu hái ở tỉnh Thái Nguyên, trên cơ sở sử dụng các phương pháp sắc kí đã phân lập được hai hợp chất flavonoid. Cấu trúc hóa học của hai hợp chất này được xác định là Kaempferol 3-O-β-D-glucopyranosid (1) và Quercetin -O-α-L- rhamnopyranosid (2) dựa trên các dữ liệu phổ khối lượng và cộng hưởng từ hạt nhân kết hợp so sánh với dữ liệu phổ được công bố trong tài liệu tham khảo. Đây là 2 hợp chất lần đầu tiên được phân lập từ lá cây dâu thu hái tại Việt Nam. Từ khóa: Lá dâu, Morus alba, Kaempferol 3-O-β-D-glucopyranosid, Quercetin -O-α-L-rhamnopyranosid. 1. Đặt vấn đề * việc làm đẹp da, loại bỏ vết thâm nám, tàn nhang trên da. Cho đến nay, các công trình Cây dâu tằm (Morus alba L.) trong sách cổ nghiên cứu đã công bố về thành phần hóa học của Trung Quốc được coi là loài cây quý, bởi cũng như tác dụng sinh học của lá cây dâu ở nó có rất nhiều công dụng quý đối với con Việt Nam còn rất ít. Để góp phần cung cấp người, vừa có thể làm thuốc trị bệnh, vừa có thể những cơ sở tiền đề cho việc ứng dụng nguyên làm thực phẩm bồi bổ cơ thể. Trong đó, lá dâu liệu lá dâu trong chăm sóc sức khỏe, bài báo tằm không chỉ được dùng để chữa các bệnh như công bố một số thành phần hóa học được tiểu đường, huyết áp cao, rối loạn lipid máu, nghiên cứu phân lập được từ lá dâu. viêm đường hô hấp, nhức đầu, mờ mắt ..mà còn được dùng với công dụng làm đẹp da, trắng da [1, 2]. Ngày nay, cùng với sự phát triển của 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu xã hội, nhu cầu làm đẹp của con người tăng lên, đồng thời con người ngày càng có xu hướng tìm 2.1. Đối tượng nghiên cứu về với tự nhiên để tìm kiếm giải pháp làm đẹp an toàn, hiệu quả. Lá dâu được coi là một trong Mẫu cây dâu tằm được thu hái vào tháng 6 những nguồn nguyên liệu tự nhiên quý trong năm 2016 tại huyện Phổ Yên, tỉnh Thái Nguyên. Mẫu thực vật đã được Viện Sinh thái _______ * Tác giả liên hệ. ĐT.: 84-989313325. và Tài nguyên sinh vật giám định tên khoa học Email: ducloi82@gmail.com là: Morus alba L., họ dâu tằm Moraceae, mẫu được lưu giữ tại Khoa Y Dược, ĐHQGHN. 45
2. 46 V.Đ. Lợi và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 1 (2017) 45-50 2.2. Dung môi, hóa chất dưới áp suất giảm thu được 520 g cắn chiết methanol. Cắn chiết được phân bố vào nước Các dung môi dùng trong chiết xuất, phân cất vừa đủ và tiến hành chiết lần lượt với n- lập như methanol (MeOH), n-hexan, ethyl hexan, ethylacetat. Các dịch chiết n-hexan, acetat (EtOAc), và dicloromethan (DCM)... đều ethylacetat và phần nước còn lại được cất thu đạt tiêu chuẩn công nghiệp và được chưng cất hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được các lại trước khi dùng. Dung môi phân tích gồm cắn n-hexan (A, 60 g), cắn ethylacetat (B, 75 MeOH, n-hexan, EtOAc, H2O dùng để phân g) và cắn nước (C, 42 g). tích sắc ký đều đạt tiêu chuẩn phân tích. Pha Cắn ethylacetat (B, 50 g) được hòa tan trong tĩnh dùng trong sắc ký cột là silicagel pha lượng dung môi vừa đủ và trộn với silicagel thường (0,040 - 0,063 mm, Nicalai Tesque Inc., (150 g), sau đó cất loại dung môi để được Nhật Bản), YMC ODS-A (50μm, YMC Co. dạng bột tơi, tiến hành sắc ký cột với chất hấp Ltd., Nhật Bản). Bản mỏng tráng sẵn trên đế phụ silica gel, kích thước cột 60 cm x 10 cm nhôm loại pha thường Kieselgel 60 F và pha 254 (chiều dài x đường kính cột), dung môi rửa giải đảo TLC Silica gel 60 RP-18 F (Merck, 254S dicloromethan: methanol với độ phân cực của Damstadt, Đức). Phát hiện chất bằng đèn tử dung môi tăng dần (từ 20:1 đến 0:1) thu được 4 ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc phân đoạn B1 (6,0 g), B2 (7,5 g), B3 (12,0 g) và dùng thuốc thử là dung dịch H SO 10 % hơ 2 4 B4 (10,0 g). Phân tách phân đoạn B3 trên sắc nóng để phát hiện vết chất. ký cột với chất hấp phụ pha đảo (ODS) sử 2.3. Thiết bị, dụng cụ dụng YMC-gel, kích thước cột 80 cm x 3 cm (chiều dài chất nhồi 70 cm) và kích thước cột - Sắc ký cột: sắc ký cột sử dụng silicagel cỡ 80 cm x 1,5 cm (chiều dài chất nhồi 70 cm), sử hạt 0,063-0,200 mm (Merck) và cỡ hạt 0,040- dụng hệ dung môi rửa giải aceton: nước (2:5, 0,063 mm (Merck) với các loại cột sắc ký có v:v) thu được 4 phân đoạn nhỏ là B3.1 (2,1 g), kích cỡ khác nhau. B3.2 (3,1 g), B3.3 (1,9 g), B3.4 (3,6 g). - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: NMR được Phân đoạn B3.1 được tinh chế bằng CC pha ghi trên máy Bruker Avance 500MHz tại Viện đảo với hệ dung môi rửa giải MeOH-H2O (2:1) Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công thu được chất rắn màu vàng ký hiệu là hợp chất nghệ Việt Nam. 2 (41mg). Phân đoạn B3.2 được phân tách bằng - Phổ khối ESI-MS: đo trên máy AGILENT sắc ký cột silicagel pha thường rửa giải bằng 1260 Series LC-MS ion Trap (Agilent hệ dung môi chloroform/methanol (5/2, v/v) Technologies, Hoa Kỳ) thu được hợp chất 1 (48 mg). - Nhiệt độ nóng chảy: đo trên máy SMP10 BioCote, Khoa Y Dược, ĐHQGHN. - Góc quay cực riêng: đo trên máy PLR-4, 3. Kết quả và bàn luận MRC scientific instruments, Khoa Y Dược, ĐHQGHN. Hợp chất 1: Kaempferol 3-O-β-D- glucopyranosid 2.4. Chiết tách và phân lập các hợp chất Chất tinh thể hình kim, màu vàng. Nhiệt độ nóng chảy 178-179oC. Lá dâu được thu hái, rửa sạch, phơi và sấy 25 khô ở 50oC, nghiền nhỏ thu được bột thô. Lấy Độ quay cực: [α]D = +16,9 (c =0,65, MeOH). ESI-MS: m/z 447 [M-H]- và 471 6,0 kg bột khô (đã trừ độ ẩm) đem ngâm chiết + [M+Na] CTPT: C21H20O11; KLPT M =448; Số với 9,0 lít methanol/lần x 4 lần ở nhiệt độ 1 13 phòng, mỗi lần 48 giờ. Các dịch chiết được liệu phổ H-NMR và C-NMR (DMSO-d6) gom lại, lọc qua giấy lọc và cất loại dung môi được trình bày ở Bảng 1.
3. V.Đ. Lợi và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 1 (2017) 45-50 47 Bảng 1. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 1 và chất so sánh M Vị trí DEPT δC (M) δC (1) ppm δH (1) ppm, δH (M) ppm, HMBC (1) (H→C) C ppm J: Hz J: Hz 2 C 156,7 156,7 - - 3 C 133,5 133,4 - - 4 C 177,6 177,7 - - 5 C 160,8 161,4 - - 6 CH 99,3 98,9 6,24 (d, 2,0) 6,22 (d, 2,0) 7, 5, 10, 8 7 C 162,2 164,4 - - 8 CH 94,5 94,0 6,43 (d, 2,0) 6,41 (d, 2,0) 7, 9, 10, 6 9 C 156,0 156,6 - - 10 C 105,5 104,3 - - 1′ C 120,7 121,2 - - 2′,6′ CH 130,9 131,2 8,05 (dd, 1,5, 7,0) 8,06 (dd, 1,5, 7,0) 4′, 2, 2′, 6′ 3′,5′ CH 115,1 115,4 6,87 (dd, 1,5, 7,0) 6,85 (dd, 1,5, 7,0) 4′, 1′, 3′, 5′ 4′ C 160,2 160,1 - - 1′′ CH 100,8 101,1 5,44 (d, 7,5) 5,46 (d, 7,5) 3 2′′ CH 74,2 74,4 3,18 (m) 3,16 (m) 1′′, 3′′ 3′′ CH 77,5 77,6 3,08 (m) 3,09 (m) 4′′ 4′′ CH 69,9 70,1 3,09 (m) 3,06 (m) 5′′, 3′′ 5′′ CH 76,4 76,6 3,25 (m) 3,26 (m) 6′′ CH2 60,8 61,1 3,33 (m) 3,35 (m) 3,56 (dd, 5,5, 11,0) 3,53 (dd, 5,5, 11,0) δC (M), δH (M) của kaempferol 3-O-β-D-glucopyranoside [3, 4]. Hình 1. Cấu trúc hóa học của hợp chất 1. Hợp chất 1 thu được dưới dạng tinh thể chất flavonol; cặ p hai tín hiệu doublet khác hình kim, màu vàng. Phổ khối lượng ESI-MS tại δH 6,87 (dd, J = 1,5, 7,0 Hz) và 8,05 (dd, J của 1 xuất hiện tín hiệu tại m/z 447 [M-H]- và = 1,5, 7,0 Hz) đặc trưng cho vòng thơm B thế 471 [M+Na]+ ứng với khối lượng phân tử là para. Phổ 1 3 C -NMR của 1 xuất hiện tín hiệu 448, công thức phân tử của hợp chất này có thể của 21 nguyên tử cacbon, trong đó có 6 tín 1 là C21H20O11. Trên phổ H-NMR của 1 xuất hiệu tại δC 101,1 (C-1′′), 74,4 (C-2′′), 77,6 (C-3′′), 70,1 (C-4′′), 76,6 (C-5′′), 61,1 (C-6′′) hiện: Tín hiệu proton anome tại δH 5,44 (1H, d, J = 7,5 Hz) gợi ý trong 1 có mặt 1 phần khẳng định sự có mặt của phần đường glucose đường; cặp tín hiệu doublet tại 6,24 (d, J = 2,0 và tín hiệu của 15 nguyên tử cacbon thuộc Hz) và 6,43 (d, J = 2,0 Hz) điển hình cho hai vào khung flavonol có vòng B thế para. So proton ở vị trí C-6 và C-8 của vòng A của hợp sánh các dữ liệu phổ NMR của 1 với hợp chất kaempferol 3-O-β- D-glucopyranoside thấy sự
4. 48 V.Đ. Lợi và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 1 (2017) 45-50 trùng hợp [3, 4]. Tương tác HMBC giữa H-1″ Hợp chất 2: Quercetin 3-O-α-L- (δC 5,44) và C-3 (δC 133,4) gợi ý phần O-β-D- rhamnopyranosid glucopyranosyl tại C-3 của flavonol. Như vậy, Tinh thể màu vàng nhạt, M= 448, Mp =182- có thể khẳng định hợp chất 1 là o 183 C; Rf = 0,45 (CHCl3 - MeOH, 85:15); ESI- kaempferol 3-O-β-D-glucopyranoside. Hợp MS m/z: 447,0 [M-H]-. Phổ 1H-NMR (500MHz), chất này có mặt trong nhiều loài thực vật và có 13 C-NMR (125MHz) đo trong CD3OD và phổ hoạt tính chống ôxi hóa mạnh. DEPT của chất 2 được trình bày ở bảng 2: Bảng 2. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 2 và chất so sánh K Vị trí C DEPT δH(K) ppm, δH (2) ppm, δC(K) δC (2) J: Hz J: Hz ppm ppm 2 C - - 158,1 158,5 3 C - - 136,0 136,2 4 C - - 179,3 179,7 5 C - - 159,1 159,3 6 CH 6,10 d (1,8) 6,22 d (2,0) 99,5 99,9 7 C - - 165,8 165,9 8 CH 6,29 d (1,8) 6,39d (2,0) 94,3 94,7 9 C - - 163,0 158,5 10 C - - 105,5 105,9 1' C - - 122,5 123,0 2' CH 7,57 d (1,9) 7,36 d (2,5) 116,2 116,4 3' C - - 146,2 146,4 4' C - - 149,5 149,8 5' CH 6,77 d (8,2) 6,93 d (8,0) 116,7 117,0 6' CH 7,53 dd (1,9; 8,2) 7,33 dd (2,0; 8,5) 122,7 122,9 1'' CH 5,01 d (2,0) 5,37 d (1,5) 103,4 103,5 2'' CH 4,25 dd (1,7; 3,3) 71,8 72,0 3'' CH 3,77 dd (3,5; 9,5) 72,0 72,1 4,22-3,14 4'' CH 3,36dd (2,3, 9,58) 73,1 73,3 5'' CH 3,44dd (6,0; 9,5) 71,7 71,9 6'' CH3 1,02 d (6,0) 0,96d (6,5) 17,5 17,6 Ghi chú: δH (K) đo trong CD3OD ở 400 MHz, δC (K) đo trong CD3OD ở 100 MHz của chất quercitrin [5, 6]. Hình 2. Cấu trúc của hợp chất 2.
5. V.Đ. Lợi và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 1 (2017) 45-50 49 Hợp chất 2 nhận được dưới dạng chất bột lá cây dâu đã phân lập, xác định cấu trúc phân có màu vàng đặc trưng cho nhóm chất tử 2 hợp chất nhóm flavonoid là kaempferol 3- flavonoid. Phổ ESI-MS của hợp chất 2 xuất O-β-D-glucopyranoside (1) và quercetin 3-O-α- hiện pic ion tại m/z:447 [M-H]-, tương ứng với L-rhamnopyranosid (2). Các kết quả trên cũng khối lượng phân tử M = 448, phù hợp với công mở ra những hướng nghiên cứu sâu hơn nhằm hướng tới mục tiêu tìm ra hoạt chất chính có thức phân tử C21H20O11. khả năng ứng dụng làm chất chuẩn trong kiểm Phổ 1H-NMR của hợp chất 2 xuất hiện hai nghiệm. Đồng thời cần tiếp tục thực hiện các vùng phổ đặc trưng, một vùng ở trường khá nghiên cứu bổ sung về hàm lượng và tác dụng thấp với hai tín hiệu của hai proton nằm ở vị trí sinh học của các hợp chất phân lập được, nhằm meta với nhau thuộc vòng A tại tại 6,22 và 6,39 minh chứng cho công dụng và góp phần định (d, J = 2,0 Hz) và ba tín hiệu cộng hưởng với hướng sử dụng cây dâu hiệu quả hơn. tương tác spin coupling dạng ABX của vòng B thế ở các vị trí 1,3,4 tại 7,36 (1H, d, J = 2,5, H- 2'), 6,93 (1H, d, J = 8,0, H-5'); 7,33 (1H, dd, J = 2,0; 8,5; H-6'); Vùng trường cao hơn là các tín Lời cảm ơn hiệu của một phân tử đường. Tín hiệu của proton anome tại 5,37 (1H, d, J = 1,5; H-1''), tín Nghiên cứu này được tài trợ bởi Quỹ Khoa hiệu điển hình của nhóm methyl bậc một dưới học Công nghệ Đại học Quốc Gia Hà Nội, đề dạng doublet tại 0,96 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-6'') tài “Phát triển sản phẩm thực phẩm chức năng và bốn proton của các nhóm oxymethin tại 3,77 và mỹ phẩm làm sáng da, chống nám từ nguyên (1H, dd, J = 3,5; 9,5; H-3''); 4,25 (1H, dd, J = liệu thiên nhiên Việt Nam”, mã số: QG.16.86 1,7; 3,3; H-2''); 3,36 (1H, dd, J= 2,3, 9,58; H- 4''); 3,44(1H, dd, J = 6,0; 9,5;H-5'') cho thấy cấu trúc của 2 có một phân tử đường rhamnose. Tài liệu tham khảo Phổ 13C-NMR của 2 xuất hiện tín hiệu của 21 nguyên tử carbon, trong đó có 15 tín hiệu [1] Đỗ Tất Lợi (2001). Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. NXB Y học, tr. 628-629. của khung flavon và 6 tín hiệu của một phân tử [2] Viện Dược liệu (2004). Cây thuốc và động vật đường rhamnose. Các tín hiệu của vòng B lần làm thuốc ở Việt Nam. NXB Khoa học và Kỹ lượt tại 123,0 (C, C-1'); 116,4 (CH, C-2'); 146,4 thuật, tr. 462-468. (C, C-3'); 149,8(C, C-4'); 117,0 (CH, C-5'); 122,9 [3] Ayse Kuruzum-uz, Zühal Guvenalp, Cavit (CH, C-6'). Nhóm carbonyl xuất hiện tại 179,7 Kazaz (2013), Phenolic compounds from (C-4), hai tín hiệu CH điển hình tương ứng với the roots of Anchusa azurea var. azurea, các vị trí C-6 và C-8 của vòng A tại 99,9 (C-6) và Turk J Pharm Sci, 10 (2), 177-184. 94,7 (C-8); tín hiệu của carbon anome tại 103,5 [4] Choi J, Kang HJ, Kim SZ, Kwon TO, Jeong (C-1''), nhóm methyl tại 17,6 (C-6'') và bốn tín SI, Jang SI. (2013), Antioxidant effect of astragalin isolated from the leaves of Morus alba hiệu CH nối với oxi của phân tử đường rhamnose L. against free radical-induced oxidative tại 72,0 (C-2''); 72,1 (C-3''); 73,3 (C-4''); 71,9 (C- hemolysis of human red blood cells. Arch Pharm 5''). Từ các kết quả nêu trên, đối chiếu với dữ liệu Res, 36(7), pp. 912-7. đã công bố [5, 6] hợp chất 2 được xác định là [5] Lee E. H., Song D.-G., Lee J. Y., et al. (2009), quercetin 3-O-α-L-rhamnopyranosid. "Flavonoids from the leaves of Thuja orientalis inhibit the aldose reductase and the formation of advanced glycation endproducts", Journal of the 4. Kết luận Korean Society for Applied Biological Chemistry, 52(5), pp. 448-455. Bằng các phương pháp sắc ký kết hợp với [6] Wang K.J., Yang C.R., and Zhang Y.J. (2007), các phương pháp phân tích phổ hiện đại (MS, "Phenolic antioxidants from Chinese toon (fresh NMR), từ phân đoạn dịch chiết ethylacetat của young leaves and shoots of Toona sinensis)", Food Chemistry, 101(1), pp. 365-371.
6. 50 V.Đ. Lợi và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Số 1 (2017) 45-50 Flavonoids Isolated from the Leaf of Morus alba L. Collected in Thai Nguyen Province Vu Duc Loi1, Do Thi Nghia Tinh1, Bui Thi Xuan1, Vu Kieu Oanh2, Trinh Nam Trung2, Nguyen Tien Vung3 1VNU School of Medicine and Pharmacy, 144 Xuan Thuy, Cau Giay, Hanoi, Vietnam 2Vietnam Militery Medical University, 160 Phung Hung, Ha Dong District, Hanoi, Vietnam 3National Institute of Forensic Medicine, 41 Nguyen Dinh Chieu, Hai Ba Trung District, Hanoi, Vietnam Abstract: From the leaf of Morus alba L. collected in Thai Nguyen province, using chromatography methods resulted in the isolation of two flavonoids. Their structures were identified as kaempferol 3-O-β-D-glucopyranoside (1), quercetin 3-O-α-L-rhamnopyranoside (2) on the basis of spectroscopic data including mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectra together with comparison with those reported in the literature. This is the first report of flavonoid components from the leaf of Morus alba L. colected in Vietnam. Keywords: Morus alba, kaempferol 3-O-β-D-glucopyranoside, quercetin 3-O-α-L-rhamnopyranoside.